太平洋牡蛎过敏原精氨酸激酶的分子克隆、表达纯化和免疫原性鉴定

太平洋牡蛎过敏原精氨酸激酶的分子克隆、
表达纯化和免疫原性鉴定
赵晓涵，刘文颖，程青丽，谷瑞增，鲁军*，李国明*
（中国食品发酵工业研究院，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京 100015）
摘要：克隆太平洋牡蛎精氨酸激酶（CG-AK）基因，导入大肠杆菌（BL21（DE3））中，然后筛选重组菌株。

通过SDS-PAGE对重组菌株中太平洋牡蛎精氨酸激酶（CG-AK）的诱导表达条件进行探究，经Ni2+亲和层析柱纯化，通过SDS-PAGE、质谱（MALDI-TOF-MS）、圆二色（CD）光谱等方法从相对分子量、一级结构以及二级结构综合鉴定了重组CG-AK的准确性，同时使用SDS-PAGE和Western blot检测重组CG-AK 的表达，并利用酶联免疫吸附（ELISA）对其免疫原性进行鉴定。

成功克隆表达并鉴定了CG-AK，其最佳诱导表达条件为18℃诱导14h，具有良好的免疫原性。

为国内过敏原的标准化生产提供理论支持，也为后续牡蛎过敏疾病的精准诊断、治疗及脱敏方法奠定了良好的分子生物学基础。

关键词：太平洋牡蛎；精氨酸激酶；分子克隆；表达条件；免疫原性；过敏原
中图分类号：R392.11/TS201.6 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2021）02-0100-07
doi：10.19804/j.issn1006-2513.2021.02.015
Cloning，expression，purification and immunogenicity identification of arginine kinase，the allergen from Crassostrea gigas
ZHAO Xiao-han，LIU Wen-ying，CHENG Qing-li，GU Rui-zeng，
LU Jun*，LI Guo-ming*
（China National Research Institute of Food & Fermentation Industry，Beijing Engineering Research Center of Protein and Functional Peptides，Beijing 100015）
Abstract：The Pacific oyster arginine kinase（CG-AK）gene was cloned into E.coli（BL21（DE3）），and the recombinant strain was screened. The inducible expression conditions of the recombinant CG-AK were investigated by SDS-PAGE. The recombinant CG-AK was purified by Ni2+ affinity chromatography column，which was comprehensively identified from the relative molecular weight，primary structure and secondary structure by SDS-PAGE，mass spectrometry（MALDI-TOF-MS），circular dichroism（CD）spectroscopy. At the same time，SDS-PAGE and Western blot were used to detect the expression of recombinant CG-AK，and enzyme-linked
收稿日期：2020-09-17
基金项目：国家自然科学基金项目（31671963）；中国食品发酵工业研究院强院工程培育专项（院强院20-功能肽-505）。

作者简介：赵晓涵（1994-），女，研究生，研究方向为功能食品与食品过敏原。

E-mail：*******************。

*通讯作者：鲁军（1973-），男，教授级高工，研究方向为功能食品与生物技术。

E-mail：********************。

李国明（1983-），男，高级工程师，研究方向为功能食品与生物技术。

E-mail：****************。

100
Immunoadsorption（ELISA）was used to identify its immunogenicity. The optimal induction expression condition of CG-AK was 18℃ for 14h ，which was successfully cloned，expressed and identified and has good immunogenicity. It provides theoretical support for the standardized production of domestic allergens，and also lays a good molecular biology foundation for the follow-up accurate diagnosis，treatment and desensitization methods of oyster allergies. Key words：Pacific oysteras；arginine kinase（AK）；cDNA cloning；expression conditions；immunogenicity；allergen
随着食品流通的加快和人民生活质量的提高，食物过敏已成为家庭、临床医生和政策制定者日益关注的问题［1］。

据报道，牡蛎、虾和蟹等水产品造成的食物过敏常引起患者发生皮肤红肿、痒痛、咳嗽、呕吐、腹泻等症状，严重者会出现呼吸困难甚至休克［2］。

牡蛎也叫海蛎子、蚝等，属于软体动物门，是世界第一大养殖贝类［3］，在世界各地都有分布，它因为味道鲜美且具有很高的保健功能和药用价值而深受人们的喜爱。

全球每年牡蛎消费量超过300万吨，而太平洋牡蛎（Crassostrea gigas，CG）约占世界牡蛎消费量的一半［4］，因食用牡蛎引起的过敏反应也已成为不容忽视的食品安全问题。

超过90%以上的食物过敏都属于免疫球蛋白IgE介导的Ⅰ型过敏反应［5］，牡蛎过敏也是如此。

食物过敏原指的是能引起免疫反应的食物抗原分子，水产品中已发现的过敏原包括原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）、精氨酸激酶（Arginine Kinase，AK）、肌球蛋白轻链（Myosinlightchain，MLC）、肌钙结合蛋白（Sarcoplasmic calcium binding protein，SCP）等［6］。

本实验室和国内外学者已对牡蛎主要过敏原原肌球蛋白进行了详细深入的研究，而对牡蛎中精氨酸激酶的免疫学研究还尚未见报道。

精氨酸激酶在无脊椎动物中分布十分广泛，尽管已经发现二聚体AK，但通常以单体形式存在［7］，它高度集中在肌肉组织中［8］，并且已经证明可以与肌动蛋白结合［9］，在无脊椎动物的细胞能量代谢调控中起关键作用［10］。

无脊椎动物AK的分子分析揭示了与来自脊椎动物肌酸激酶的进化关系，它们都有着相似的代谢作用［11］。

由于过敏原诊断方法的可获得性非常有限，再加上种类的多样性以及对过敏原和交叉反应的了解有限，导致很难对致敏水产品过敏原种类进行鉴定［12］。

但从20世纪80年代以来，随着科研人员的不断尝试，以少量mRNA为起点克隆cDNA而发展起来的重组技术为过敏原克隆找到突破口［13］。

DNA分子克隆技术是分子生物学研究的基础，其创新和发展不仅直接促进了分子生物学的进步［14］，也推动了标准化进程。

此外，本文通过对太平洋牡蛎精氨酸激酶进行分子克隆、表达纯化及免疫原性鉴定，为以后的深入研究作铺垫，以期通过一系列的研究找到生产低致敏食品的方法。

1 材料与方法
1.1 材料和试剂
太平洋牡蛎（Crassostrea gigas，CG）购自山东威海；RNA提取试剂Trizol购自Qiagen公司；特异性引物购自华大基因；限制性内切酶BamHI、SalI、T4 DNA连接酶购自Takara公司；质粒pET30（+）、BL21（DE3）、抗组氨酸抗体购自南京金斯瑞（GenScript）生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgE购自KPL 公司；TMB显色液购自碧云天；所用试剂均为分析纯。

血清：7个牡蛎过敏受试者的血清样品获自PlasmaLab International（USA）。

所有7名受试者在摄入牡蛎后1h内具有至少两种或更多种症状的临床病史，包括瘙痒症，过敏性鼻炎，胃肠道疾病和腹泻。

5名没有任何贝类过敏史的正常志愿者的血清被用作阴性对照。

将所有血清以等分试样储存在-80℃直至使用。

1.2 方法
1.2.1 AK基因克隆及表达载体构建
根据GenBank提供的太平洋牡蛎精氨酸激酶AK基因序列（登录号BAD11
950.1），通过 Primer 5.0软件设计一对引物：P1（上游）：5’-TATTGGATCCAT
GGCTGACGCTGCTGTTAT-3’（BamHI）；P2（下游）：5’-AAAGTCGACTTACA
101
TCTCCTTCTCAA TCTT-3’（SalI）。

以Trizol 试剂提取牡蛎肌肉总RNA，以总RNA 为模板，Oligo（dT）为引物，反转录合成cDNA第一链。

再以此反转录产物为模板，P1、P2为特异性引物，聚合酶链式反应扩增目的基因的中间片段。

采用DNA 回收试剂盒纯化PCR产物，将纯化的PCR 产物经1%琼脂糖电泳检测后，与原核表达载体pET30（+）分别进行BamHI and SalI双酶切，并将获得的基因片段与pET30（+）的酶切产物相互连接，构建重组表达质粒pET30（+）-CG-AK。

然后用氯化钙法转化入E.coli DH5α感受态细胞，铺平板，37℃过夜培养，筛选阳性克隆并将得到的重组阳性质粒进行鉴定和测序。

1.2.2 重组大肠杆菌中AK的最佳表达条件探究
将重组阳性质粒导入表达宿主菌BL21（DE3）中，涂布于卡那霉素的平板，挑选3个单克隆，分别接种到4mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃振荡培养箱中以175r/min 振荡培养。

当OD600值达到0.6～0.8时，向其中两根管中加入浓度为0.5mmol/L的IPTG，分别在18℃下诱导14h和37℃下诱导4h，最后一支试管作为阴性参照。

全菌裂解物样品：取培养物离心后的沉淀，重悬于300μL裂解缓冲液（20mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，5%甘油pH8.0），用超声波破碎仪裂解10min，取100μL裂解液。

细胞裂解物的上清和包涵体样品：取剩余200μL裂解缓冲液，11000r/min离心10min，分别收集裂解液的上清液和包涵体沉淀。

使用SDS-PAGE探究重组CG-AK在不同温度和诱导时间下BL21（DE3）菌的上清液和沉淀中的表达情况。

1.2.3 重组AK的诱导表达
将重组大肠杆菌BL21（DE3）在最优条件下扩大培养并诱导表达，离心后得到菌体沉淀，将菌体沉淀重悬于50mL裂解缓冲液并超声，条件如下：工作时间20min（超声时间：3s，间隙时间：3s；输出功率：55%）工作温度0℃。

离心（11000r/min，40min，4℃）取上清液。

1.2.4 重组AK的纯化
使用ÄKTA-快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统将过滤后的重组CG-AK溶液上样于平衡好的镍柱，用含500mmol/L咪唑的Buffer I （10mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，pH 8.0）将结合在镍柱上的重组CG-AK洗脱下来。

所有纯化步骤均在4℃下进行，收集的重组CG-AK 储存在-80℃直至使用。

1.2.5 SDS-PAGE 分析
利用SDS-PAGE分析比较纯化后的重组CG-AK与天然CG-AK的相对分子质量。

采用5%浓缩胶和15%分离胶进行电泳。

将样品溶液（10μL）与10μL上样缓冲液混合，并在100℃加热8min后进行电泳。

通过比较购自碧云天的低分子量标记蛋白的电泳迁移率来确定分子量。

1.2.6 重组AK的质谱鉴定
从SDS-PAGE凝胶上切下目的蛋白，经DTT还原和碘代乙酰胺烷基化处理后，加入胰蛋白酶酶解过夜。

酶解后得到的肽段再经脱盐后，与基质α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）混合点板，通过MALDI-TOF-MS进行分析。

质谱条件为：激光源N2；波长337nm；加速电压25kV；采用正离子模式，自动获得数据。

通过Mascot搜索工具将目的蛋白的肽质量指纹与Swissprot数据库中的肽质量指纹进行比较。

1.2.7 圆二色（CD）光谱分析
用Chirascan测量重组CG-AK和天然CG-AK（0.3mg/mL）的CD光谱，并将三个光谱的平均值作为最终数据。

对于波长分析，以0.2nm的步长和2.0nm的带宽扫描样品，波长范围为195～260nm，扫描速度为1200nm/min。

使用样品所在的缓冲液作为基线对照，从每个CD 光谱中减去缓冲液的基线光谱，并使用CDNN软件进行分析。

1.2.8 酶联免疫吸附（ELISA）测定重组AK的免疫原性
用CBS溶液将蛋白稀释至5μg·mL-1，各取100μL样品置于酶标板中，从第2排开始每排加入6孔重组AK，后三孔每孔加入100μL CBS 溶液作为空白对照，在4℃包被过夜。

用Tween 20/PBS（PBS-T）洗涤4次后，加入300μL的5%脱脂奶粉在37℃孵育1h。

再次洗涤并加入100μL过敏患者血清（用2%脱脂奶粉以1∶10比例稀释），并在室温下晃动孵育3h。

洗涤后，将100μL过氧化物酶标记的山羊抗人IgE抗体
102
103
（1∶2000）添加到孔中，然后在室温下孵育1h 。

用PBS -T 洗涤5次并用PBS 洗涤3次后，每孔加入200μL TMB 显色液并避光孵育30min ，然后使用50μL 的2MH 2SO 4终止反应。

最后，用自动酶标仪在450nm 下测量OD 值。

对来自非过敏性受试者的血清（每排中间3孔）进行相同的操作，以确定非特异性结合的程度，将其从测试血清数据中减去。

对每个样品进行三个平行实验，取平均值作图。

2 结果
2.1 牡蛎精氨酸激酶基因的鉴定
提取经菌落PCR 鉴定为阳性的重组pET30（+）-CG -AK 质粒，双酶切后经10%琼脂糖凝胶电泳对扩增的产物进行分析（图1），载体片段约为4100bp ，插入的太平洋牡蛎过敏原AK 的基因片段为1056bp ，其大小与理论值基本相符。

DNA 序列测定结果显示克隆的片段为AK 的完整编码框（包括起始密码子和终止密码子），表明所扩增的精氨酸激酶基因是正确的。

1000
bp
1
2
M
200040005000注：M ：DNA 标志物（KB Ladder ）； 1：酶切产物；2：重组
pET30（+）-CG -AK 质粒
图1 重组pET30（+）-CG -AK 质粒双酶切鉴定 Figure 1 Double restriction endonuclease identification
of recombinant plasmid pET30（+）-CG -AK
2.2 重组大肠杆菌中CG -AK 的最佳表达条件探究
重组CG -AK 在BL21（DE3）中表达的SDS -PAGE 结果如图2所示，从图中可以看出18℃诱导14h 和37℃诱导4h 的细胞裂解物、细胞裂解上清液和细胞裂解沉淀在相对分子质
量43kDa 左右都有条带（泳道1、2、3、4、5、6），而在没有加入IPTG 诱导的细胞裂解物中在43kDa 处并没有明显的突出条带（NC ）。

与37℃诱导4h 的细胞裂解上清液相比，在18℃下诱导14h 时细胞裂解上清液在43kDa 的条带处比较明显，说明目的蛋白的含量相对较多。

而18℃诱导14h 和37℃诱导4h 的细胞裂解沉淀在43kDa 的条带虽然都明显深于两种条件下的细胞裂解上清液，但由于沉淀以无活性的包涵体形式存在，所以选择18℃诱导14h 后对细胞裂解上清液进行纯化。

KDa M 1PC 1PC 2PC 1NC 12NC 23
456
12060
403020
10
80注：Lane M 1：Protein marker ；Lane PC 1：BSA （1μg ）；Lane
PC 2：BSA （2μg ）；Lane NC ：未诱导的全细胞；Lane 1：18℃诱导14h 的全细胞；Lane 2：37℃诱导4h 的全细胞 ；Lane NC 1：未诱导的细胞裂解上清；Lane 3：18℃诱导14h 的细胞裂解上清；Lane 4：37℃诱导4h 的细胞裂解上清；Lane NC 2：未诱导的细胞裂解沉淀；Lane 5：18℃诱导14h 的细胞裂解沉淀 ；Lane
6：37℃诱导4h 的细胞裂解沉淀
图2 重组CG -AK 在不同表达条件下的
SDS -PAGE 结果
Figure 2 SDS -PAGE results of recombinant CG -AK under different expression conditions
2.3 重组CG -AK 的纯化
将重组大肠杆菌在18℃诱导14h 的最优条件来扩大培养并诱导表达蛋白后进行纯化，从图3中可以看出，重组CG -AK 在43kDa 左右有单一条带，而天然CG -AK 的相对分子质量在40kDa ，这可能是由于重组CG -AK 含有6个His 标签和4个限制性酶切位点，所以重组CG -AK 比天然CG -AK 大3kDa ，且重组CG -AK 与天然CG -AK 相比杂蛋白较少，纯度较高。

该实验从相对分子质量方面说明重组CG -AK 的准确性。

104
1
2
3
4
5
6
kD 114.025.014.4
18.435.045.066.2
M
注：M ：标准分子质量蛋白；1～3：纯化后天然CG -AK ；
4～6：纯化后重组CG -AK
图3 重组CG -AK 和天然CG -AK 纯化后
SDS -PAGE 鉴定
Figure 3 SDS -PAGE analysis of the purified recombinant CG -AK and natural CG -AK
2.4 AK 的质谱鉴定
通过MALDI -TOF -MS 分析后得到肽指纹图谱（图4），表明切除的目的蛋白质条带在700D 和4000D 之间显示出多个峰。

1732.81D 处的信号作为突出峰，使用Mascot 搜索工具将其信号与Swissprot 数据库中的数据进行比较，并观察Mowse 值。

3种匹配的蛋白的相关信息列于表1中，经比较发现具有最高得分的蛋白质是来自太平洋牡蛎的精氨酸激酶，其得分为201，有27条匹配肽段，其他搜索匹配的2种蛋白质均为精氨酸激酶；综上所述，证明43kDa 蛋白质是重组的牡蛎（Crassostrea gigas ）精氨酸激酶（CG -AK ）。

1732.8101075.578
2007.076
2879.2671973.996
1481.141
2668.266
954.5101214.649
3999.983
3351.5333700.805AK1 0:K19 MS Raw
2
4
6
8
×104
I n t e n s . [a .u .]1000
1500
20002500
3000
3500
4000
m/z
1850.929
图4 重组CG -AK 的肽指纹图谱
Figure 4 Peptide mass fingerprint of recombinant CG -AK
表1 重组CG -AK 的前3种匹配蛋白的信息
Table 1 Information on the top 3 matching proteins of recombinant CG -AK
Accession Mass Score Matches Description
BAD11950.14001220127arginine Kinase ［Crassostrea gigas ］EKC24882.139********Arginine Kinase ［Crassostrea gigas ］XP 011416277.1
84866
157
27
taurocyamine kinase -like ［Crassostrea gigas ］
2.5 圆二色（CD ）光谱分析
CD 光谱在远紫外区域具有肽键吸收信号，并
能反映蛋白质二级结构的信息。

将195～260nm 处的CD 光谱图使用CDNN 软件计算后得出如下
105
结论（表2），从图5和表2可以看出天然CG -AK 和重组CG -AK 的α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规卷曲含量相差不大，说明它们的二级结构几乎一致，进一步证明重组CG -AK 是正确的。

天然CG -AK 重组CG -AK
3020100-10-20
-30
190200210220230240250260
Wavelength （nm ）
C i r c u l a r
D i c h r o i s m （m d e g ）
图5 重组CG -AK 和天然CG -AK 的圆二色（CD ）
光谱分析
Figure 5 Circular dichroism （CD ）spectrum analysis of
recombinant CG -AK and natural CG -AK
表2 圆二色（CD ）光谱
Table 2 Circular dichroism （CD ）spectrum
二级结构α-螺旋β-折叠β-转角无规卷曲天然CG -AK 7.2%48.5%18.3%32.4%重组CG -AK
7.0%
48.7%
18.6%
32.0%
2.6 ELISA 检测重组CG -AK 的免疫原性
如图6所示，2～6号过敏患者血清OD 450nm
都大于1号健康人血清的OD 450nm ，但由于个体过
O D 450n m
血清
注：1：健康人血清；2～6：过敏患者血清
图6 重组CG -AK 的IgE 分析
Figure 6 Analysis of IgE reactivity of recombinant
CG -AK
敏患者的差异，重组CG -AK 与患者血清 IgE 发生的结合反应有强有弱，其中与3号过敏患者血清的IgE 反应最强烈。

该重组CG -AK 与健康人血清无明显反应，空白对照吸光度小于0.06，说明重组CG -AK 具有较好的免疫原性。

3 讨论
精氨酸激酶（AK ）是继原肌球蛋白之后新发现的一种过敏原，目前一些科研人员对不同种类动物中的精氨酸激酶过敏原进行了研究并取得进展。

2001年，Binder 等［15］对蛾类的精氨酸激酶进行了重组及一系列的免疫学研究，包括组胺释放、皮肤点刺及免疫抑制等实验，并发现其与龙虾、对虾、贝类、尘螨和蟑螂中相对分子量约为40 kDa 的过敏原有一定的免疫交叉反应。

2003年，Yu 等［16］发现了斑节对虾（Penaeus monodon ）新的精氨酸激酶过敏原
并命名为Pen m 2，后来又陆续在南美白对虾［17］
（Litopenaeus vannamei ）、锯缘青蟹［6］（Scylla serrata ）、北海对虾［18］（Crangon crangon ）、克氏原螯虾［19］
（Procambarus clarkii ）、拟穴青蟹［20］（Scylla paramamosain ）以及软体动物章鱼中发现了精氨酸激酶，证实AK 为重要过敏原，不仅对其基本性质作了相关研究，还进行分子克隆及诱导表达，而且对其免疫原性进行深入探究。

由此可见，AK 广泛存在于各种甲壳类动物、软体动物和昆虫中，不同物种间具有较强的免疫交叉 反应。

本研究通过基因重组获得目的基因片段，克隆得到的精氨酸激酶基因长度为1056bp ，编码350个氨基酸残基，分子量为43kDa ，等电点为6.57。

诱导表达后成功获得了牡蛎重组CG -AK ，上清液经Ni 2+亲和层析柱纯化后重组CG -AK 纯度达95%以上，但仍有一部分以不可溶的包涵体形式存在，后续可以进行包涵体复性试验。

最终通过SDS -PAGE 、圆二色（CD ）光谱等实验方法对所表达的CG -AK 进行综合鉴定，证明重组CG -AK 的准确性，为后续CG -AK 以及牡蛎脱敏的相关研究鉴定奠定了良好的基础。

ELISA 检测结果显示纯化后的重组CG -AK 具有较好的免疫原性，这将为牡蛎过敏甚至软体类动物过敏的
精准诊断及免疫治疗提供了新的技术资料，以更好地预测软体类动物过敏的严重程度，也有利于探究CG-AK的免疫学特征。

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