国境口岸血吸虫PCR和荧光PCR检测方法SNT5371-2021

S N/T5371 2021国境口岸血吸虫P C R和荧光P C R检测方法
1范围
本文件规定了国境口岸日本血吸虫㊁埃及血吸虫㊁曼氏血吸虫P C R和三重实时荧光P C R检测的对象㊁检测方法㊁生物安全及结果报告㊂
本文件适用于国境口岸日本血吸虫㊁埃及血吸虫㊁曼氏血吸虫的实验室检测㊂
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款㊂其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件㊂
G B19489实验室生物安全通用要求
S N/T1193基因检验实验室技术要求
W S/T230临床诊断中聚合酶链反应(P C R)技术的应用
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件㊂
3.1
血吸虫s c h i s t o s o m a
属于扁形动物门吸虫纲裂体吸虫科,也称裂体吸虫㊂寄生于人体的有日本血吸虫㊁埃及血吸虫和曼氏血吸虫等,可引起血吸虫病㊂其幼虫在中间宿主螺类体内发育,尾蚴通过皮肤㊁粘膜进入人体内,可侵及肺㊁胃肠道㊁泌尿和中枢神经系统,有些虫卵随血流进入各器官,引起各种症状,如肝肿大,严重时造成宿主死亡㊂日本血吸虫主要见于中国大陆㊁日本㊁中国台湾㊁东印度群岛和菲律宾;埃及血吸虫主要分布于非洲㊁南欧和中东;曼氏血吸虫主要分布于非洲和南美洲北部㊂血吸虫感染后会出现皮疹㊁发热㊁腹痛㊁腹泻㊁乏力㊁肝脏不适等症状,严重危害人类的健康㊂日本血吸虫㊁曼氏血吸虫成虫主要寄生于人体肠系膜下静脉,埃及血吸虫成虫主要寄生于膀胱静脉丛㊂
4缩略语
下列缩略语适用于本文件㊂
D E P C:焦碳酸乙二酯(d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e)
P A G E:聚丙烯酰胺凝胶电泳(p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s)
F AM:6-羧基荧光素(6-c a r b o x y f l u o r e s c e i n)
B H Q:黑洞淬灭基团(b l a c k h o l e q u e n c h e r)
5检测对象
5.1国境口岸发现的有皮疹㊁发热㊁腹痛㊁腹泻㊁乏力㊁肝脏不适等症状,疑似血吸虫感染病人㊂
1
5.2 来自血吸虫感染疫区人员㊂5.3 其他申请检验的人员㊂6 生物安全和P C R 防污染要求
实验室生物安全和运输要求应符合G B 19489的规定㊂P C R 防污染措施按S N /T 1193和W S /T 230的规定执行㊂
7 主要试剂
7.1 无R N A 酶的D E P C 水㊂
7.2 D N A 提取液(含0.9%N a C l 和0.1%E D T A -N a 2的混合液)
㊂7.3 引物应用液浓度配制成20μm o l /L ,
引物和探针见表1㊂等效商品化试剂也可使用㊂表1 血吸虫P C R 和实时荧光P C R 检测引物及探针
引物及探针名称
序列(5 -3
)扩增片段日本血吸虫P C R 检测引物S j
-F 15 -G G T T A T G G T T T G T T G A T G T T A G G -3
S j
-R 15 -A C T A A T T C A C T C T C G G A C T C A C C -3
269b p
曼氏血吸虫P C R 检测引物S m -F 1
5 -A G T T A C T R G G A A A G G T G A A A G T G C -3
S m -R 15 -C A C T A A A A C A C T C C T T A T A C C R G G -3
350b p
埃及血吸虫P C R 检测引物
S h -F 1
5 -G C G G A T G A T T T T C G T T G T T A G G -3
S h -R 15 -T T C A G A C T C G G A A T A G T C A C A T G G -3
398b p
日本血吸虫实时荧光P C R 检测引物
S j -F 5 -G G G G T T T G T A T T A T A A G T T T A T G A T G T T -3
S j -R 5 -C A C A C G A A C A G C A C T A A T C A A T C -3
S j -P 5 -F AM -C C A A G A A C C T C A A C C T A A C A T C A A C A A -B HQ 1-3
125b p
曼氏血吸虫实时荧光P C R 检测引物及探针
S m -F 5 -A G T A A G T G A G A A T A A T C G T A C G C C -3
S m -R
5 -G G A A T A A A C A T C A T A G C A T A T T C A C A -3
S m -P 5 -H E X -A C A C C A C T C A C A A G C T C A C T C T -B HQ 1-3 135b p
埃及血吸虫实时荧光P C R 检测引物
S h -F
5 -G G C A T G G T T A A T A G T R T T A T T A A G A G A G -3
S h -R 5 -G G A A T A C T C G C A A G C A A A T A T A A C -3
S h -P
5 -R e d 610-A G T A A T C G T A C A C C A T G T G A C T A T T C -B HQ 2-3
139b p
注:引物序列中的简并碱基R 表示G 或A ㊂
7.4 P C R 基础试剂:
市售商品化试剂㊂7.5 电泳缓冲液(10ˑT B E ):称取108g T r i s 碱,7.44g N a 2
E D T A ㊃H 2O 和55g 硼酸,溶于800m L 的d d H 2O 中,
充分搅拌溶解后加水定容至1L ,室温保存㊂7.6 G o l d e n V i e w 核酸染料(或其他等效核酸染料):使用浓度为5μL /50m L ㊂
2
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S N/T5371 2021 8主要仪器
主要仪器设备如下:
二级生物安全柜;
台式高速冷冻离心机(最高离心力12000g以上);
涡旋振荡器;
冰箱:4ħ和-20ħ;
超净工作台;
微型离心机;
P C R仪;
荧光定量P C R仪;
凝胶成像分析系统;
电子天平(d=1m g);
微波炉;
电泳仪;
高压灭菌锅;
超纯水器或双蒸水器;
微量可调移液器一套(含以下5种规格:10μL㊁20μL㊁100μL㊁200μL㊁1m L)㊂
9样品采集与运输
9.1样品采集
9.1.1粪便标本
采集新鲜粪便于一次性无菌采便管内,成形便采集5g~8g,水样便采集1m L~3m L㊂采便管外表贴上带有唯一识别号码的标签,直接用于检测,或保存,或送检㊂
9.1.2尿液标本
用无菌容器采集3m L~5m L,密闭后外表贴上带有唯一识别号码的标签,直接用于检测,或保存,或送检㊂
9.1.3血液
用无菌容器采集2m L~3m L抗凝血(非肝素),密闭后外表贴上带有唯一识别号码的标签,直接用于检测,或保存,或送检㊂
9.2样本的运送与保存
样本运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输㊂对于不立即检测的样本,应保存于-20ħ及以下待检㊂
3
S N/T5371 2021
10实验室检验
10.1样品处理
取黄豆大小约100m g~200m g的粪便,加入500μL的生理盐水,振荡混匀,制成20%~40%的混悬液;或取2m L血液,静置待自然分层,吸取上层血浆层及中层B u f f y c o a t层;或取3m L尿液㊂然后16200g离心2m i n㊂弃去上清㊂不能立即进行检测时,样本冻存于-20ħ冰箱备用㊂
10.2核酸提取
在标本的前处理沉淀中,加入100μL D N A提取液(7.2)充分混匀,沸水浴10m i n(误差不超过1 m i n)㊂16200g离心5m i n,上清可直接用于P C R反应㊂也可以使用商品化的D N A提取试剂盒并按其说明书操作㊂
10.3空白对照和阴㊁阳性对照设置
检测过程中分别设空白对照和阴㊁阳性对照㊂阴性对照为不含血吸虫核酸的标本㊂阳性对照为日本㊁埃及㊁曼氏血吸虫阳性样本核酸,或者为克隆的日本㊁埃及㊁曼氏血吸虫部分D N A序列(必须包含扩增区域在内),序列见附录A㊂空白对照为d d H2O㊂
10.4P C R检测
10.4.1反应体系组成
10.4.1.1日本血吸虫反应体系为40μL,组成如下:
M a s t e r M i x(含P C R缓冲液㊁d N T P㊁M g2+㊁T a p酶)干粉球
D E P C水35μL
S j-F1(20μm o l/L)0.5μL
S j-R1(20μm o l/L)0.5μL
模板4μL
10.4.1.2曼氏血吸虫反应体系为40μL,组成如下:
M a s t e r M i x(含P C R缓冲液㊁d N T P㊁M g2+㊁T a p酶)干粉球
D E P C水35μL
S m-F1(20μm o l/L)0.5μL
S m-R1(20μm o l/L)0.5μL
模板4μL
10.4.1.3埃及血吸虫反应体系为40μL,组成如下:
M a s t e r M i x(含P C R缓冲液㊁d N T P㊁M g2+㊁T a p酶)干粉球
D E P C水35μL
S h-F1(20μm o l/L)0.5μL
S h-R1(20μm o l/L)0.5μL
模板4μL
10.4.2P C R扩增
循环参数设置:94ħˑ5m i n;94ħˑ15s,58ħˑ20s,72ħˑ30s,循环40次;72ħˑ10m i n;因不同P C R仪器的性能差异,可根据条件优化适当调整P C R退火温度和时间㊂
4
S N/T5371 2021 10.4.3琼脂糖凝胶电泳
用0.5ˑT B E电泳缓冲液配制2.0%(质量分数)的琼脂糖凝胶(含G o l d e n V i e w或其他等效核酸染料)㊂将琼脂糖凝胶放入水平电泳槽,使电泳缓冲液刚好淹没胶面㊂取5μL普通R T-P C R扩增产物和1μL上样缓冲液混匀后加入糖凝胶的样品孔㊂在电泳时设立D N A标准分子量作对照,使用100b p D N A分子量标准㊂按8V/c m的电压条件电泳约30m i n~40m i n㊂采用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果㊂
10.4.4检验结果判断及报告
10.4.4.1当阳性对照出现目的片段条带,而阴性对照和空白对照没有任何核酸条带出现时才可对样本进行结果判定及报告,否则视为实验失败,需重新实验㊂
10.4.4.2本方法检验结果判定及报告如下㊂
日本血吸虫反应体系检测样品出现269b p条带时,报告检出日本血吸虫特异性基因(P C R法, 269b p);否则报告日本血吸虫核酸检测阴性㊂
曼氏血吸虫反应体系检测样品出现350b p条带时,报告检出曼氏血吸虫特异性基因(P C R法, 350b p);否则报告曼氏血吸虫核酸检测阴性㊂
埃及血吸虫反应体系检测样品出现398b p条带时,报告检出埃及血吸虫特异性基因(P C R法, 398b p);否则报告曼氏血吸虫核酸检测阴性㊂
10.4.5测序
对于检测阳性的样本可切下电泳分析的目的条带,用凝胶回收试剂盒回收纯化(按其说明书进行),全自动遗传分析仪进行测序,确认基因序列,也可进一步分析基因的变异情况㊂
10.5实时荧光P C R检测
10.5.1引物和探针
参见7.3㊂
10.5.2反应体系组成
反应体系为40μL,组成如下:
M a s t e r M i x(含P C R缓冲液㊁d N T P㊁M g2+㊁T a p酶)干粉球
D E P C水29.5μL
S j-F(20μm o l/L)0.6μL
S j-R(20μm o l/L)0.6μL
S j-P(20μm o l/L)0.1μL
S m-F(20μm o l/L)1.2μL
S m-R(20μm o l/L)1.2μL
S m-P(20μm o l/L)0.2μL
S h-F(20μm o l/L)1.2μL
S h-R(20μm o l/L)1.2μL
S h-P(20μm o l/L)0.2μL
模板4μL
5
10.5.3 P C R 扩增
10.5.3.1 反应管置于荧光定量P C R 仪上,推荐循环参数设置:37ħ2m i n ,94ħ2m i n ;93ħ15s
,60ħ60s ,循环40次;单点荧光检测在60ħ㊂
10.5.3.2 荧光通道检测选择:选择F AM ㊁H E X 和C Y 5通道㊂
10.5.3.3 因不同荧光P C R 仪的性能差异,可通过条件优化适当调整P C R 循环的温度和时间㊂10.5.4 检验结果判断及报告10.5.4.1 基线和阈值设定
基线一般设定取6~15个循环,
具体可根据实际情况调整,调整原则为选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域,起点避开荧光采集起始阶段的信号波动,终点比最早出现指数扩增的样本C t 值减少1~2
个循环㊂阈值设定原则以阈值线刚好超过空白对照品的检测荧光曲线的最高点,也可根据仪器噪音情况调整㊂
10.5.4.2 质量控制
空白对照和阴性对照在F AM ㊁V I C 和C Y 5通道检测结果应为U N D E T ,
且无明显的扩增曲线;阳性对照在F AM ㊁H E X 和R e d 610通道检测结果C t 值均ɤ35,
且有明显的扩增曲线;否则实验视为无效㊂
10.5.4.3 检测结果的判定
检测结果的判定应见表2㊂
表2 血吸虫三重实时荧光P C R 检测结果判定
通道
C t 值
结果判断
F AM
ɤ35
报告为日本血吸虫荧光P C R 检测阳性
U N D E T 或40
检测样品低于检测限,报告为日本血吸虫荧光P C R 检测阴性
35~40待检标本C t 值在35~40之间时,重复检测一次,若重新检测的C t 值仍介于35和40之间,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性;否则建议采用浓缩方式处理核酸样本,再重新进行荧光P C R 检测,若重新检测的C t 值有明
显减少趋势,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性,否则判为阴性
H E X
ɤ35
报告为曼氏血吸虫荧光P C R 检测阳性
U N D E T 或40
检测样品低于检测限,报告为曼氏血吸虫荧光P C R 检测阴性
35~40待检标本C t 值35~40之间时,重复检测一次,若重新检测的C t 值仍介于
35和40之间,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性;否则建议采用浓缩方式处理核酸样本,再重新进行荧光P C R 检测,若重新检测的C t 值有明显
减少趋势,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性,否则判为阴性C Y 5
ɤ35
报告为埃及血吸虫荧光P C R 检测阳性
U N D E T 或40
检测样品低于检测限,报告为埃及血吸虫荧光P C R 检测阴性
35~40
待检标本C t 值35~40之间时,重复检测一次,若重新检测的C t 值仍介于
35和40之间,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性;否则建议采用浓缩方式处理核酸样本,再重新进行荧光P C R 检测,若重新检测的C t 值有明显
减少趋势,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性,否则判为阴性
6
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S N/T5371 2021
10.6检测注意事项
10.6.1血液样本可检测日本血吸虫㊁埃及血吸虫㊁曼式血吸虫;粪便标本可检测日本血吸虫和曼式血吸虫;尿液标本可检测埃及血吸虫㊂
10.6.2实验室环境污染,试剂污染,样品交叉污染会出现假阳性结果;试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或检测不准确的结果㊂
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附录A
(资料性)
阳性对照基因合成序列及G e n B a n k参考序列编号
A.1日本血吸虫
G e n B a n k参考序列编号:K U196379.1㊂
阳性对照基因合成序列如下:
G G G G T T T G T A T T A T A A G T T T A T G A T G T T G T A C A T T T T A A T T T T G T C T A C T T T T A C T G G T T A T G G T T T G T T G A T G T T A G G T T G A G G T T C T T G G A A A A A G T A T A G A T T G A T T A G T G C T G T T C G T G T G G C T T T T G C T A G A A T A A G G T T T G A A G C T A C T T T T A T G T G T T T A G T A T T A G T A T T G G G T G T A A T A T A T A A T G A T T A T G G T A A A T T G G A T A T T A C T T A T T T G A T T G T T A T T G C T C C A T T A A A T T A T T T T G C T T G G T C T G T T T C T T T G C T T G C T G A A A G A A A A C G T T C T C C A T T T G A T T A T G G T G A G T C C G A G A G T G A A T T A G T
A.2曼氏血吸虫
G e n B a n k参考序列编号:H E601612.1㊂
阳性对照基因合成序列如下:
A G T A A G T G A G A A T A A T C G T A C G C C C T T A G A T T A T G G G G A G T G T G A G A G T G A G C T T G T G A G T G G T G T A A C A G T G G A G T A T A G A A G T G T A T T G T T C T T A G T G A T A T T T G C T T G T G A A T A T G C T A T G A T G T T T A T T C C A G T T A C T G A G A A A G G T G A A A G T G C A T G G T T T C A A T T T T C G A A G G T G A T T T T C A G T A T T T G G G T G T A T A G T T A T G G T A G T A T G T T T T T T A G T T A G G G T T G A G A T T T A C G G A A T G T T T C A A A G T G G T A T C G A T A G G T G G T A T G C G T T A T T A T A T T T T T T A G T T G T T T T T T C T T T T T T G G G T T A T G G T A T A C T G T T A T T A G G G T G A T G T T C A T G A T C T A A G T A T A G G T T A A T A A G G T G T A T T C G G G T T T C T T T T T C T A A A G T G A T G T T T G A A A T G A T A T T T A T G T G T A T A T T A A T C T T G T T T G G T T A T T T A T A T T T T G G T T A T G G T G A T C C T G G T A T A A G G A G T G
T T T T A G T G
A.3埃及血吸虫
G e n B a n k参考序列编号:G U257392.1㊂
阳性对照基因合成序列如下:
G C G G A T G A T T T T C G T T G T T A G G T T G T A T A A T T T T A A T T T C A T G T T C A G T A T C A A T G G T A G T A G T T T A T A G A T T A A T A A A T A G G A A T A T A T G A T G T A A T T G A A T A T T A C T T T A T T T T T T A G T A G T A G G T T C T A T A G T A A G T T A T A G A A C T T T A T T A A T A G G C T G A T G T T C G T G A T C A A A G T A C A G T C T A A T C A G T T C T A T T C G T G T T T C T T T T T C T A G T G T G A T G T T C G A A A T G A T A C T G A T G T G C A T T A T A A T T T T G T T T G G T T T A A T G T A T G G T G G T T A T A G A A A A C C T A G A A T T A G A A G A G T A A T G A T A T T T A T A G C A C C T T T A G T T T T T A T T G C A T G G T T A A T A G T A T T A T T A A G A G A G A G T A A T C G T A C A C C A T G T G A C T A T T C C G A G T C T G A A A G T G A A T T A G T A A G A G G A A T T A G A G T G G A A T A T A G G A G A G T A T T A T T T T T A G T T A T A T T T G C T T G C G A G T A T T C C 1 2 0 2 1 7 3 5 T / N S。