生物化学实验：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
11.实验结果分析
注意的问题
蛋白质电泳 常用的S不同亚基组成的蛋白质
聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套
试剂
1.40%丙烯酰胺（Acr）：
2.10%SDS（十二烷基硫酸钠）
3.1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g ，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用 蒸馏水定容至100ml
* 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要 在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶 过程最好一次性完成,避免产生气泡
* 水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡,加速 聚合. * 胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓 缩胶,连续平稳加入浓缩胶至边缘处,迅速插入梳子, 静置到胶凝 * 梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需 水平
• 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯 酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种 因素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量 的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电 泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小？
SDS的作用
SDS is a strong detergent agent used to denature native proteins to unfolded, individual polypeptides. When a protein mixture is heated to 100 °C in presence of SDS, the detergent wraps around the polypeptide backbone. It binds to polypeptides in a constant weight ratio of 1.4 g SDS/g of polypeptide. In this process, the intrinsic charges of polypeptides becomes negligible when compared to the negative charges contributed by SDS. Thus polypeptides after treatment become rod-like structures possessing a uniform charge density, that is same net negative charge per unit length. The electrophoretic mobilities of these proteins will be a linear function of the logarithms of their molecular weights.
电泳方向
混合样品 电泳
大分子
带孔胶
小分子
按分子 大小分离
电泳 缓冲液
加在槽中的经 SDS处理的样品
夹在两块玻璃 板之间的凝胶
电泳 缓冲液
电源
分子量大 分子量小
电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片
标准蛋白分子量
在一定的凝胶浓度下， 多肽链分子量的对数与 多肽链的相对迁移率成 线性关系，所以可以通 过标准曲线求未知多肽 链分子量。 未 知 蛋 白
4.0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g ，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用 蒸馏水定容至100ml
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：
SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（ 2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl （2ml），最后定容至10ml。 （10）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加 上述固定液250ml，过滤后备用
• 当蛋白质的分子量在15,000－200,000之 间时，样品的迁移率与其分子量的对数 呈线性关系。
符合如下方程式：lg MW =－b m + K
• 其中，MW 为蛋白质的分子量，m 相 对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件 一定时，b与K均为常数
• 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋 白的比较，就可以得出未知蛋白的分子 量
Gel
5%
10%
200
200
97
97
66
66 45
29 45
29
15%
200 97 66
45
29
• Ammonium (AP) (N2H8S2O8; MW: 228.2). APS is a source of free radicals and is often used as an initiator for gel formation.
• SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及 有无浓缩效应分为连续系统和不连续系 统两大类
• 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝 胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下， 主要靠电荷和分子筛效应
• 不连续系统中由于缓冲液离子成分， pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性， 带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应 ，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而 其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳
高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔
8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，溴酚蓝距 凝胶边缘约数cm时，停止电泳
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝 胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染 色液，染色20-30min左右
10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色 液脱色，直到蛋白质区带清晰 *剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分
• TEMED(N, N, N', N'tetramethylethylenediamine) (C6H16N2; MW: 116.21). TEMED stabilizes free radicals and improves polymerization
垂直板 电泳装置
加样
样品迁 移方向
电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分 子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide
gel electrophoresis
一. 实验目的
1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原 理 2.掌握垂直板电泳的操作方法
二. 实验原理
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺 凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）
相对迁移率
水平式电泳装置
电泳缓冲液
凝胶
操作过程
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好(放好密 封条和隔离板)
*固定玻璃板时，两边用力一定要均匀 ，防止夹坏玻璃板
配胶
ddH2O 40%Acr Buffer
10%SDS 10%Ap TEMED
分离胶(12%)
4.3ml
3.0ml
5.拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液
*用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的 气泡全部排出
6.上样：
（1）marker 10µl
（2）样品（100℃沸水浴，3-5min 处理并离心 ，蛋白变性）
7. 微量注射器（加样器）上样, 上样量 10-15µl *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过
1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml
0.1ml
0.1ml
4µl
浓缩胶(5%)
2.37ml
0.5ml
0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.0ml
40µl
40µl
4µl
3.按比例配好分离胶,用移液枪快速加入（或 直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后 加少许蒸馏水（或异丙醇除泡）,静置至胶 凝
（11）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水 定容至1000ml
（12）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g， 甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定 容至1000ml
注意的问题
蛋白质电泳 常用的S不同亚基组成的蛋白质
聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套
试剂
1.40%丙烯酰胺（Acr）：
2.10%SDS（十二烷基硫酸钠）
3.1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g ，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用 蒸馏水定容至100ml
* 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要 在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶 过程最好一次性完成,避免产生气泡
* 水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡,加速 聚合. * 胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓 缩胶,连续平稳加入浓缩胶至边缘处,迅速插入梳子, 静置到胶凝 * 梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需 水平
• 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯 酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种 因素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量 的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电 泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小？
SDS的作用
SDS is a strong detergent agent used to denature native proteins to unfolded, individual polypeptides. When a protein mixture is heated to 100 °C in presence of SDS, the detergent wraps around the polypeptide backbone. It binds to polypeptides in a constant weight ratio of 1.4 g SDS/g of polypeptide. In this process, the intrinsic charges of polypeptides becomes negligible when compared to the negative charges contributed by SDS. Thus polypeptides after treatment become rod-like structures possessing a uniform charge density, that is same net negative charge per unit length. The electrophoretic mobilities of these proteins will be a linear function of the logarithms of their molecular weights.
电泳方向
混合样品 电泳
大分子
带孔胶
小分子
按分子 大小分离
电泳 缓冲液
加在槽中的经 SDS处理的样品
夹在两块玻璃 板之间的凝胶
电泳 缓冲液
电源
分子量大 分子量小
电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片
标准蛋白分子量
在一定的凝胶浓度下， 多肽链分子量的对数与 多肽链的相对迁移率成 线性关系，所以可以通 过标准曲线求未知多肽 链分子量。 未 知 蛋 白
4.0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g ，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用 蒸馏水定容至100ml
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：
SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（ 2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl （2ml），最后定容至10ml。 （10）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加 上述固定液250ml，过滤后备用
• 当蛋白质的分子量在15,000－200,000之 间时，样品的迁移率与其分子量的对数 呈线性关系。
符合如下方程式：lg MW =－b m + K
• 其中，MW 为蛋白质的分子量，m 相 对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件 一定时，b与K均为常数
• 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋 白的比较，就可以得出未知蛋白的分子 量
Gel
5%
10%
200
200
97
97
66
66 45
29 45
29
15%
200 97 66
45
29
• Ammonium (AP) (N2H8S2O8; MW: 228.2). APS is a source of free radicals and is often used as an initiator for gel formation.
• SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及 有无浓缩效应分为连续系统和不连续系 统两大类
• 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝 胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下， 主要靠电荷和分子筛效应
• 不连续系统中由于缓冲液离子成分， pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性， 带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应 ，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而 其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳
高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔
8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，溴酚蓝距 凝胶边缘约数cm时，停止电泳
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝 胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染 色液，染色20-30min左右
10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色 液脱色，直到蛋白质区带清晰 *剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分
• TEMED(N, N, N', N'tetramethylethylenediamine) (C6H16N2; MW: 116.21). TEMED stabilizes free radicals and improves polymerization
垂直板 电泳装置
加样
样品迁 移方向
电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分 子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide
gel electrophoresis
一. 实验目的
1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原 理 2.掌握垂直板电泳的操作方法
二. 实验原理
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺 凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）
相对迁移率
水平式电泳装置
电泳缓冲液
凝胶
操作过程
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好(放好密 封条和隔离板)
*固定玻璃板时，两边用力一定要均匀 ，防止夹坏玻璃板
配胶
ddH2O 40%Acr Buffer
10%SDS 10%Ap TEMED
分离胶(12%)
4.3ml
3.0ml
5.拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液
*用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的 气泡全部排出
6.上样：
（1）marker 10µl
（2）样品（100℃沸水浴，3-5min 处理并离心 ，蛋白变性）
7. 微量注射器（加样器）上样, 上样量 10-15µl *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过
1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml
0.1ml
0.1ml
4µl
浓缩胶(5%)
2.37ml
0.5ml
0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.0ml
40µl
40µl
4µl
3.按比例配好分离胶,用移液枪快速加入（或 直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后 加少许蒸馏水（或异丙醇除泡）,静置至胶 凝
（11）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水 定容至1000ml
（12）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g， 甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定 容至1000ml