【CN109971463A】一种检测细胞内溶酶体NO的比率型荧光探针及其应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910336984.3
(22)申请日 2019.04.25
(71)申请人 济南大学
地址 250022 山东省济南市市中区南辛庄
西路336号
(72)发明人 林伟英　左育静　杨婷新　
(74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所
37218
代理人 李桂存
(51)Int.Cl.
C09K 11/06(2006.01)
C07F 7/18(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
(54)发明名称
一种检测细胞内溶酶体NO的比率型荧光探
针及其应用
(57)摘要
本发明公开了一种检测细胞内溶酶体NO的
比率型荧光探针，该荧光探针为γ-哌嗪基丙基
甲基二甲氧基硅烷，其化学结构通式如下所示：
本发明的荧光探
针易于获得成本低廉，且具有高特异性，可快速
检测溶液环境的NO含量，在进行相应NO检测过程
不会受其他组分的干扰，可用于活细胞中溶酶体
NO的定量和定性测定，
具有广阔的应用前景。

权利要求书1页 说明书3页 附图3页CN 109971463 A 2019.07.05
C N 109971463
A
1.一种检测细胞内溶酶体NO的比率型荧光探针，其特征在于，该探针为γ-哌嗪基丙基甲基二甲氧基硅烷，其化学结构通式如式(I)所示：
2.一种权利要求1所述的检测细胞内溶酶体NO的比率型荧光探针的应用，其特征在于，用于细胞内溶酶体NO的定性和定量检测。

3.根据权利要求2所述的检测细胞内溶酶体NO的比率型荧光探针的应用，其特征在于，检测条件为：激发波长为365nm以及520nm，在405～700nm之间进行荧光发射光谱的检测。

权　利　要　求　书1/1页CN 109971463 A
一种检测细胞内溶酶体NO的比率型荧光探针及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种检测细胞溶酶体内NO的比率型荧光探针及其应用，属于分析化学技术领域。

背景技术
[0002]一氧化氮(NO)是人类首次发现的在机体中具有信号分子作用的一种气体，作为生理活性氧物种中的一种，它是生物体内一种重要的细胞信使分子，被誉为“信息分子、效应分子、明星分子”。

近年来的研究表明，一氧化氮作为一种新型的细胞内信使分子，广泛参与机体心血管、神经和免疫系统的生理和病理调节。

它能舒张血管、降低血压、抑制血管平滑肌细胞的增值和血小板粘附，并作为一种神经递质，在神经元的信息传递中起重要作用。

目前的研究表明，一氧化氮还在生殖器、肺等器官中都有递质的功能，还具有免疫调节功能、抗溃疡作用、调节性功能等其他生理功能。

鉴于一氧化氮的重要生理功能，所以一氧化氮的分析成为研究其生理功能及建立其分布模型的重要环节，如何能更快速、准确、灵活、方便的对一氧化氮进行分析已经成为揭示一氧化氮神秘面纱重要研究方向。

因此，对细胞内NO 进行灵敏、准确的实时原位监测，有助于从分子水平上理解细胞的生理和病理过程。

[0003]溶酶体(lysosomes)是真核细胞中的一种细胞器，为单层膜包被的囊状结构，多为球形，但也存在橄球形，大小约0.025～0.8微米。

溶酶体内含蛋白酶、核酸酶、磷酸酶、脂肪酶、磷酸酯酶及硫酸脂酶等50多种水解酶，可分解各种外源和内源的蛋白质等大分子物质，为细胞内的消化器官，具有溶解或消化的功能。

溶酶体中的NO含量多少影响溶酶体的功能。

因此，检测细胞内溶酶体的NO含量可以为研究相关生理和病理过程，以及预防相关疾病提供重要的信息。

[0004]荧光成像分析法具有灵敏度高、选择性好、响应时间短、操作简单等优点，而且对细胞基本没有损伤，已经广泛用于各种离子及生物物种的检测或细胞荧光成像。

用于检测细胞内NO含量的荧光探针也得到了迅速发展，其中一些已经商品化。

但是，目前报道的和已经商品化的溶酶体NO荧光探针大都是基于典型荧光团的共轭型荧光探针。

基于非典型荧光的NO荧光探针未见报道。

此外，比率型荧光探针以两个荧光信号的比值为输出信号，可有效的避免或降低这些因素的干扰。

因此开发新的基于非典型荧光的比率型NO荧光探针具有重要的意义。

发明内容
[0005]针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测细胞内溶酶体NO的比率型荧光探针。

该探针不需要通过化学合成获得，原料廉价易得，成本低，易于推广。

[0006]本发明还提供了一种检测细胞内溶酶体NO的比率型荧光探针的应用。

该探针用于检测细胞内溶酶体NO时灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性(400～700nm)，可以实现对细胞中的NO快速准确检测的目的。

[0007]本发明采用以下技术方案：
[0008]一种检测细胞内溶酶体NO的比率型荧光探针，该探针为γ-哌嗪基丙基甲基二甲氧基硅烷，其化学结构通式如式(I)所示：
[0009]一种检测细胞内溶酶体NO的比率型荧光探针的应用，其用于细胞内溶酶体NO的定性和定量检测。

该探针作为溶酶体NO的特异性探针，可在不同NO浓度环境下，通过哌嗪基团的氧化，生成具有不同荧光发射能力的形态，通过定量检测不同形态的荧光强度来测定溶酶体中的NO浓度。

[0010]本发明荧光探针用于检测溶酶体内的NO含量时，检测条件为：激发波长为365nm以及520nm，在405～700nm之间进行荧光发射光谱的检测。

[0011]具体测定方法为：室温条件下，配制100μM荧光探针PBS/乙醇溶液，测定溶液荧光强度作为NO浓度的评价指标。

见图5。

[0012]本发明所述的荧光探针在NO环境下，哌嗪基团的仲胺部分将会发生氧化，从而改变其空间共轭的方式，NO氧化前,荧光探针可以发射来自哌嗪蛋原子上孤对电子聚集的强烈蓝色荧光(峰值约为446nm)以及来自氧原子上孤对电子聚集的弱红色荧光(峰值约为577nm)；NO氧化后，烷氧基硅烷荧光探针的荧光因来自于氮原子的聚集作用受到影响而得到淬灭，氧原子聚集的荧光则因氧化作用引入氧原子而得到增强，此时探针发出氧原子上孤对电子聚集的强红色荧光(峰值约为577nm)。

同时，由于哌嗪具有溶酶体靶向功能，因此该荧光探针可以用于检测溶酶体内的NO含量。

可采用荧光检测器实现产物的快速灵敏检测；检测条件为：激发波长为365nm以及520nm，在405～700nm之间进行荧光发射光谱的检测。

[0013]荧光探针在生物成像应用研究主要内容有探针对活细胞的毒性、染色能力、活细胞和活组织荧光成像。

采用MTT比色法，通过分析细胞在加入荧光探针之后的存活率，讨论荧光探针对细胞的毒性。

在此基础上，应用本发明所述的检测细胞内溶酶体NO的荧光探针对活细胞或活组织进行检测，能够对该样品中细胞内溶酶体NO实现荧光成像，达到对细胞中的NO快速准确检测的目的。

[0014]本发明的有益效果：
[0015]本发明所述的检测细胞内溶酶体NO的荧光探针不需要通过化学合成获得，原料廉价易得，成本低，易于推广。

[0016]本发明所述的检测细胞内溶酶体NO的荧光探针具有高特异性，在进行相应NO检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活细胞内溶酶体NO的实时测定，具有广阔的应用前景。

[0017]本发明所述的检测细胞内溶酶体NO的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性(400～700nm)，可以实现对细胞中的NO快速准确检测的目的。

附图说明
[0018]图1是荧光探针1在不同NO条件下的荧光光谱，λEx＝365nm。

[0019]图2是荧光探针1在不同NO条件下的荧光光谱，λEx＝520nm。

[0020]图3是446nm处的荧光强度与NO浓度的线性关系。

[0021]图4是荧光探针1与对其它活性物质的选择性。

[0022]图5是荧光探针1与溶酶体定位试剂Lyso-Tracker Red的共定位成像结果:(a)明场，(b)Lyso-Tracker Red定位效果图，(c)荧光探针1定位效果图,(d)叠加定位效果图，(e) LysoTracker与PA-NO强度的相关性，定位系数＝0.897，(f)细胞间线性区域的相应强度分布。

具体实施方式
[0023]下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明保护内容不仅限于此。

[0024]实施例1
[0025]本发明所述检测细胞内溶酶体NO的荧光探针1在不同NO浓度条件下的荧光光谱[0026]预先准备10份5mL的100μM探针PBS缓冲溶液，含20％甲醇，pH＝7.4。

分别向体系中加入0，5，10，15，20，25，30，35，40μM的NO，然后进行荧光检测(λEx＝365nm以及520nm)；计算各体系中荧光强度；评估该探针对NO的响应性能(见图1，2)。

图1中可见，随着NO加入量的增加，λEx＝365nm时，峰值约为446nm处荧光强度逐渐降低，这是由于NO氧化后，烷氧基硅烷荧光探针的荧光因来自于氮原子的聚集作用受到影响而得到淬灭。

图2中随着NO加入量的增加，λEx＝520nm，峰值约为577nm处荧光强度逐渐增强，这是由于引入氧原子的氧化作用而使荧光增强。

本发明分析溶液NO浓度在0-30μM范围内，446nm处与577nm处的荧光强度比值I446/I577与NO浓度的线性关系，见图3。

线性相关系数r2＝0.955，线性良好。

[0027]实施例2
[0028]荧光探针1a与不同物质反应后的荧光光谱
[0029]预先准备10份5mL的100μM探针PBS缓冲溶液，含20％甲醇，pH＝7.4。

分别向体系中加入40μM的Ag+、Al3+、Zn2+、Cd2+、Cr3+、Br-、Cl-、Na2SO3、H2O2、HCHO等的PBS溶液。

然后进行荧光检测(λEx＝365nm以及520nm)；计算各体系中荧光强度；评估该不同物质对荧光探针溶液的干扰性(见图4)。

图4中结果表明，其他物质对该探针无任何干扰作用，因而本发明探针在进行相应NO检测过程中抗干扰性强。

[0030]实施例4
[0031]荧光探针1a在活细胞中的成像应用将Hela细胞放在培养基(DMEM培养液和10％胎牛血清)中，放置于条件为37℃、5％CO2和20％O2的培养箱中培养24-48h。

用微量进样器吸取本发明所述检测细胞内溶酶体pH的荧光探针1(10μM)和溶酶体定位试剂Lyso-Tracker Red 注入含有Hela细胞的培养基中，继续在培养箱中培养30min。

之后用PBS(磷酸盐缓冲溶液)冲洗培养细胞3次，然后进行荧光成像。

结果见图5，其中：(a)明场，(b)Lyso-Tracker Red定位效果图，(c)荧光探针1定位效果图,(d)叠加定位效果图，(e)LysoTracker与PA-NO强度的相关性，定位系数＝0.897，(f)细胞间线性区域的相应强度分布。

图1
图2
图3
图4
图5。