非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR_检测用引物和探针的筛选

非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测用
引物和探针的筛选
郑腾1邹晨伟2张体银1罗兆飞3王武军1唐寰宇1李宋钰1林杰1郑洁1林素洁1（1.福州海关技术中心/福建省检验检疫技术研究重点实验室福州350003；
2.福州千烨生物科技有限公司福州350108；
3.南宁海关技术中心南宁530201）
摘要本试验针对非洲猪瘟病毒基因保守序列设计了四对引物和探针用于微滴式数字PCR检测，经过数字PCR梯度反应体系及条件优化、特异性试验、灵敏度和线性范围试验，最终确认了一对引物和探针结果较为理想，其中引物浓度为900nmol/L，探针浓度450nmol/L，最适退火温度为54.2℃。

关键词非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR引物探针退火温度
文献标识码：A文章编号：1003-4331（2023）03-0001-06
Screening of primers and probes for detection of african swine fever virus by droplet digital PCR
Zheng Teng1Zou Chenwei2Zhang Tiyin1Luo Zhaofei3Wang Wujun1
Tang Huanyu1Li Songyu1Lin Jie1Zheng Jie1Lin Sujie1
(1.Technology Center of Fuzhou Customs/Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine
Technology Research,Fuzhou350003;2.Fuzhou Qianye Biotechnology Co.Ltd,Fuzhou350108;
3.Technology Center of Nanning Customs,Nanning530201)
Abstract In this experiment,four pairs of primers and probes were designed for the conserved sequence of the gene of African swine fever virus to be used for droplet digital PCR.Through the gradient reaction system of droplet digital PCR and the tests of condition optimization,specificity test,sensitivity and linear range,it was finally confirmed that the results of a pair of primers and probes were relatively ideal.The primer concentration was900nmol/L,the probe concentration was450nmol/L,and the optimal annealing tem鄄perature was54.2℃.
Key words African swine fever virus Droplet digital PCR Primer Probe Annealing temperature
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家猪和各种野猪（如非洲野猪、欧洲野猪等）而引起的一种急性、出血性、烈性传染病，致死率高、传染性强、不易杀灭。

该病自2018年6月中旬在辽宁省沈阳市首次确诊后就席卷了全国，造成养猪业的重大损失。

2020年初，国内的新冠疫情使得人们的关注点发生了变化，但非洲猪瘟的威胁始终存在。

该病被世界动物卫生组织（WOAH）列为法定报告疫病，同时也是我国重点防范的一类动物疫病。

非洲猪瘟的潜伏期为4～19d，特征性临床表现就是猪只突然死亡。

主要分为最急性型、急性型、亚急性型、慢性型四种，但临床症状上与猪瘟和高致病性猪繁殖与呼吸综合征等猪病相类似，必须经过实验室检测进行鉴别诊断。

目前检测方法分为血清学方法和病原学诊断，血清学方法主要包括间接ELISA、阻断ELISA和间接荧光抗体试验等，但这些方法主要用于猪场抗体水平的监测；病原学方法主要有病毒细胞培养和分离、直接免疫荧光、双抗体夹心ELISA、普通PCR和荧光定量PCR（qPCR）等，其中WOAH推荐使用普通PCR和荧光定量PCR，尤其是非洲猪瘟暴发后荧光定量PCR成为了主要的检测方法，其适用于全血、血清、鼻腔拭子、相关猪内脏、猪肉及其制品等检测样品，因其快速和准确的优势而被广泛使用[1]。

随着分子生物学技术的进一步发展，对检测技术的灵敏度和精确度有了更高的要求，从而诞生了微滴式数字PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）技术，其原理是通过微滴生成器将含有目标DNA分子及荧光探针的PCR反应体系进行极限稀释，形成无数个含有单一拷贝DNA模板的油包水微滴，每一个微滴就是一个独立的反应单元，然后再将含有无数个反应单元的反应体系进行PCR扩增，利用数字PCR 仪对每个反应单元的荧光信号进行采集，根据荧光信号的有无来判定目标DNA存在与否，荧光信号的数量就是目标DNA分子的数量，然后利用泊松概率分布函数来计算每个分区的平均分子数，最后根据
基金项目：福建省科技计划对外合作项目（2020I0030）资助。

作者简介：郑腾（1969-），男。

研究员，主要从事动物检疫实验室工作。

稀释倍数获得目标分子的绝对数量。

ddPCR首先要筛选检测对象目的基因中核苷酸保守序列作为扩增对象，利用相应的软件设计引物和探针；再对ddPCR反应体系和条件进行优化，选择合适的引物浓度和探针浓度及最佳退火温度后形成初步的检测方法，而后对方法的特异性、灵敏度、线性范围和重复性进行一系列验证，最终达到符合检测需求的ddPCR检测技术[2]。

为了研发针对肉松和肉丸等深加工猪肉制品中非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测技术，开展了相关引物、探针和最适退火温度的筛选及验证。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1试剂药品质粒小提试剂盒和磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；ddPCR Super mix for Probes和其他相关试剂购自Bio-Rad公司。

1.1.2主要仪器设备Nanodrop2000c超微量分光光度计由美国Thermo Fisher公司生产；QX200TM ddPCR微滴生成仪、PX1TM热封仪、QX200TM微滴读取仪、S1000TM热循环仪由美国Bio-Rad公司生产；八连管小型离心机由天根生化科技（北京）有限公司生产；涡旋震荡仪由杭州米欧仪器有限公司生产。

1.1.3引物和探针引物和探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司生产，具体序列见表1。

1.1.4重组质粒重组质粒参考公布的非洲猪瘟病毒P72基因序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司人工合成含有该序列的质粒，酶切点位设计见图1。

1.2方法
1.2.1微滴式数字PCR梯度反应体系及条件反应体系包括：上游和下游引物各2μL、探针1μL、Super mix for Probes10μL、DNA模板2μL，加ddH2O至20μL。

利用QX200TM ddPCR微滴生成仪将20μL体系混合物生成微滴，再利用S1000TM热循环仪进行扩增。

扩增条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s；56℃退火1min；40个循环；98℃微滴固化10min；4℃保存。

PCR反应结束后利用QX200TM微滴读取仪读取DNA拷贝数。

使用质粒来摸索反应条件，淬火温度分别选择60℃、59.4℃、58.1℃、56.2℃、54.2℃、52.1℃、50.7℃、50℃共8个温度点，4个引物的加样量分别选择300nmol/L、500nmol/L和900nmol/L，同时探针的加样量分别为引物加样量的一半。

1.2.2特异性试验分别以重组质粒（pUC19-P72）、普通家猪（Porcine）基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）和市场随机采购的非特异性样本为检测对象，采用上述建立的非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR试验方法进行检测，每个样本重复3个，评估方法的特异性。

各组引物探针特异性以（阳性结果反应数/总反应数）×100%来表示，以每组引物探针的假阳性微滴数非参数检验（秩和检验）结果的最高95%置信区间作为检测背景限（Limit of blank，LoB）。

1.2.3灵敏度、线性范围及重复性试验采用重组质粒（pUC19-P72）进行10倍梯度稀释，得到终浓度分别为100拷贝数/mL、10-1拷贝数/mL、10-2拷贝数/mL、
P15'-TCTGCAGCTCTTACATAC-3'；5'-CTTGCTCTGGATACGTTA-3' 5'-[FAM]-CCACTACGGAGGCAATGCGA-[BHQ1]-3'
P25'-GCGATGATGATTACCTTTG-3'；5'-GCTCTGGATACGTTAATATG-3' 5'-[FAM]-TTGGTATTCCTCCCGTGGCTT-[BHQ1]-3'
P35'-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3'；5'-GATACCACAAGATCAGGCCGT-3' 5'-[FAM]-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG3'-[BHQ1]-3'
P4
5'-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-3'；5'-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-3'
5'-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-3'
表1非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测用引物和探针序列
图1pUC19-P72
质粒酶切位点设计图谱
10-3拷贝数/mL 、10-4拷贝数/mL 、10-5拷贝数/mL 的
样品，取2μL 作为模板DNA 进行ddPCR 检测，每个梯度做3次平行检测。

评估方法的检出限、线性范围和重复性。

3结果与分析
3.1
非洲猪瘟病毒微滴数字PCR 方法优化
设置
60℃、59.4℃、58.1℃、56.2℃、54.2℃、52.1℃、50.7℃、50℃共8个淬火温度点，退火温度对应表
见表2。

表2
退火温度对应表
梯度退火微滴式数字PCR 结果见图2-图5。

图中微滴显示为阳性微滴，对应的图像阈值线根据波峰图进行划分。

判断引物探针浓度的依据应为阴阳微滴的分离程度，由结果可知，图2c 所示结果即P1引物浓度900nmol/L 、探针浓度450nmol/L 以及退火温度为54.2℃时的分离效果最佳，荧光信号可达到10000左右；图3c 所示P2引物浓度900nmol/
L 、探针浓度450nmol/L 以及退火温度为54.2℃时的分离效果最佳，荧光信号可达到15000左右；图4c
所示P3引物浓度900nmol/L 、探针浓度450nmol/L 以及退火温度为59.4℃时的分离效果最佳，荧光信号可达到9000左右；图5c 所示P4引物浓度
900nmol/L 、探针浓度450nmol/L 以及退火温度为54.2℃时的分离效果最佳，荧光信号可达到10000左右。

由图示结果可发现一个规律，即引物探针浓度在一定范围内的增加能够提高荧光信号，从而更好地分辨出阴阳微滴。

还可以观察到阴阳微滴的分离
效果与温度的关系，从图2a 、图2b 、图5c 的荧光信号随温度变化趋势可发现，在温度（50~60℃）逐渐提高的情况下，荧光微滴基本呈现先升后降或者保持稳定水平后下降（其中以54.2℃为分水岭），所以
P1、P2和P4的最佳退火温度都可选定为54.2℃；
只有图4a-图4c 即P3引物探针的最佳退火温度趋势比较特殊，直到59.4℃才开始呈现下降趋势，推测可能是由于设计的引物长度比P1、P2和P4要来得长，所以所需的退火温度要来得高一些。

所以四对引物探针的最适退火温度和浓度分别为：P1引物浓度900nmol/L ，探针浓度450nmol/L ，最适退火温度
54.2℃；P2引物浓度900nmol/L ，探针浓度
A
B
C
D
E
F
G
H
60℃59.4℃58.1℃56.2℃54.2℃52.1℃50.7℃50
℃
（a.引物300nmol/L 、探针150nmol/L ；b.引物500nmol/L 和探针250nmol/L ；c.引物900nmol/L 和探针450nmol/L ）
图2
不同浓度P1
引物和探针上机雨滴图
（a.引物300nmol/L 、探针150nmol/L ；b.引物500nmol/L 和探针250nmol/L ；c.引物900nmol/L 和探针450nmol/L ）
图3
不同浓度P2引物和探针上机雨滴图
450nmol/L ，最适退火温度54.2℃；P3引物浓度900nmol/L ，探针浓度450nmol/L ，最适退火温度59.4℃；P4引物浓度900nmol/L ，探针浓度450nmol/L ，最适退火温度54.2℃。

3.2非洲猪瘟微滴式数字PCR 检测方法的特异性试验四对引物和探针均采用重组质粒pUC19-P72为阳性样本，以家猪（Porcine ）基因组、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）、猪圆环病毒（PCV ）、猪伪狂犬病病毒（PRV ）、猪细小病毒（PPV ）为模板进行ddPCR 检测方法特异性验证，每个样本做3个重复。

结果见图6-图9，其结果不符合正态分布，故采用秩和计算空白限（Limit of blank ，LoB ），计算方法
如下：首先从低到高对测得值进行秩和排列，计算需要概率对应的秩和排序位置（0.95对应95%的置信度），然后按95%秩=[0.5+0.95×检测数量]取整对应的排序，LoB 等于上一步计算得到的95%秩对应排序位置的样本ddPCR 测得值。

如果计算得到的值为非整数，为保证LoB 保守性，可进位向高值取整（如
91.2取92）。

计算后结果如下：P1的95%秩和=0.5+0.95×15=
15，所以P1的LoB 为0.19（Copies/μL ），见图6；P2
的95%秩和=0.5+0.95×15=15，所以P2的LoB 为
0.12（Copies/μL ），见图7；P3的95%秩和=0.5+0.95
×
（a.引物300nmol/L 、探针150nmol/L ；b.引物500nmol/L 和探针250nmol/L ；c.引物900nmol/L 和探针450nmol/L ）
图4
不同浓度P3
引物和探针上机雨滴图
（a.引物300nmol/L 、探针150nmol/L ；b.引物500nmol/L 和探针250nmol/L ；c.引物900nmol/L 和探针450nmol/L ）
图5
不同浓度P4
引物和探针上机雨滴图
图6
P1引物探针与样本特异性数据统计图
图7P2引物探针与样本特异性数据统计图
15=15，所以P3的LoB 为0.09（Copies/μL ），见图8；P4的95%秩和=0.5+0.95×15=15，所以P4的LoB 为0.1（Copies/μL ），见图9。

结果显示，除了阳性样本
外，其它均未检出，表明四对探针引物具有对ASFV 的靶向特异性。

3.3非洲猪瘟微滴式数字PCR 检测方法的灵敏度
与线性范围
将重组质粒pUC19-P72按10倍梯度
稀释，并配置ddPCR 反应体系，得到终浓度分别为
800fg/μL （10-2）、80fg/μL （10-3）、8fg/μL （10-4）、800ag/μL （10-5）、80ag/μL （10-6）的样品，进行ddPCR 检测。

所有ddPCR 反应生成的微滴数目均大于10000，表明所有反应微滴生成正常，保证了后续定
量分析的准确性。

在不同质粒浓度的反应体系中，
ddPCR 产生的阳性微滴数目随着模板DNA 浓度降低而降低，无非特异性扩增，雨滴图见图10-图13。

根据检测结果绘制标准曲线，发现引物探针P1的样品DNA 浓度在10-2~10-5梯度时，ddPCR 检测
结果呈良好的线性关系，而且其检测浓度可到10-6。

同时四组引物探针的R 2都大于0.99，适合定量检测的需要，见图14-图17。

各组引物探针的检出限见表3，所有检出限均高于空白限。

4讨论
非洲猪瘟自2018年传入我国以来，在全国广泛传播且反复发生，由于养殖场户的防疫意识还不够
强，部分地区地下黑疫苗的乱象等还在威胁养殖业的发展，
养殖环节和流通环节疫情传播的风险依然
图10
P1
线性相关雨滴图
图11
P2
线性相关雨滴图
图12P3
线性相关雨滴图
图13P4线性相关雨滴图
图8P3引物探针与样本特异性数据统计图
图9P4引物探针与样本特异性数据统计图
存在，部分带有非洲猪瘟病毒的猪肉以及深加工的猪肉制品还有流入食品消费环节的现象。

经过5年多的摸索，现行有效的防控方法是采用生物安全措施控制非洲猪瘟的传播和流行。

无论是养殖环节、屠宰环节还是食品流通环节，均需要有一种灵敏度、准确性和抗干扰能力均较强的检测方法，而且该方法还必须能够尽量避免假阳性和假阴性的发生。

目前广泛使用的是普通PCR 方法和荧光定量PCR 方
法，尤其是荧光定量PCR 方法已在养殖场和屠宰场广泛使用，但该方法难以实现精准定量，在检测过程中也难免出现部分假阳性和假阴性的情况，无法实现对非洲猪瘟病毒的精准检测和精准打击，从而对疫情的有效防控和生物安全措施的精确使用造成困难。

ddPCR 作为一种新的定量检测技术，具有良好
的特异性和准确性，理论上可以精确到单个病毒核酸的检测，从而有效避免了荧光定量PCR 检测中可能出现的假阴性和假阳性，极大提高了检测准确
性。

原霖等[3]、邬旭龙等[4]虽然开展了非洲猪瘟病毒
ddPCR 的研究工作，但还没有广泛应用在深加工肉
制品上（如福州当地有名的特产肉松和肉丸）。

本研究根据非洲猪瘟病毒核酸的P72保守序列，合成四对引物探针，进行退火温度和初始浓度的条件摸索，并以重组质粒阳性样本，以家猪（Porcine ）基因组、猪蓝耳病病毒（PRRSV ）、猪圆环病毒（PCV ）、猪伪狂犬病病毒（PRV ）、猪细小病毒（PPV ）的核酸为模板，进行ddPCR 检测方法特异性验证和LoB 计算，最后开
展了检测灵敏度和线性范围试验，最终选定引物探针P1为最佳试验结果，引物浓度900nmol/L 、探针浓度450nmol/L 和最适退火温度54.2℃可以作为非洲猪瘟病毒ddPCR 检测的最适PCR 扩增条件。

后续将进一步开展深加工肉制品（肉松和肉丸）中非洲猪瘟病毒ddPCR 检测研究工作，以期有效降低深加工肉制品中非洲猪瘟病毒传播的风险。

参考文献：
[1]张志,康京丽,李晓成.非洲猪瘟的流行特征和传播路线[J].
中国动物检疫,2018(11):48-51.
[2]郑腾,张体银,李宋钰,等.数字PCR 技术在猪病检测中的
研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2022(24):35-38,43.
[3]原霖,董浩,倪建强,等.非洲猪瘟病毒微滴数字PCR 检测
方法的建立[J].畜牧与兽医,2019,51(7):81-84.
[4]邬旭龙,肖璐,宋勇,等.非洲猪瘟病毒微滴数字PCR
(ddPCR)方法的建立及应用[J].微生物学通报,2017,44(12):
2839-2846.
图14
P1
线性相关标准曲线
图15
P2
线性相关标准曲线
图16
P3
线性相关标准曲线
图17
P4线性相关标准曲线表3
非洲猪瘟微滴式数字PCR 检测检出限比较
引物探针组
质粒浓度（ag/μL ）
检测限（copies/μL ）
P1P2P3P4
80800800800
0.930.960.361.21。