蛋白质工程PROTEINENGINEERING
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2
蛋白质工程
通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助
计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技术， 特异性地对蛋白质结构基因进行改造，产生 具有新的特性的蛋白质的技术，并由此深入 研究蛋白质的结构与功能的关系,并使蛋白质 更好地造福于人类。
3
基本步骤
分离纯化目的蛋白
氨基酸测序、X－射线衍射分析、NMR等测试，目
将这种方法用于分析小 分子的结构，因为生物 大分子非常复杂，分析 起来难度很大。
17
从左至右库特-乌特里 希(64岁)、田中耕一 (43岁)、约翰-B-芬恩 (85岁) （2000年）
1983年瑞士苏黎世瑞士联邦技术学院的库特-乌特里希
(Kurt Wuthrich)教授首次运用NMR法解析了胰高血糖素 续测定所有相邻的两个质子之间的距离和方位，这些数 据经计算机处理后就可形成生物大分子的三维结构图。
12
3.1.1X射线晶体衍射法
用X射线轰击待分析的混合物的结晶，并用照相底
片将其拍摄下来。这样，就可以得到一张结晶分子 的侧视影象照片。通过各种角度的影象照片，就可 以建立起一个该混合物分子结构的三维影象。
13
X射线晶体衍射过程示意图
衍射现象的产生是X射线与组成晶体的原子核外电子相互作用 的结果。 14
19
3.2相关数据库
多维NMR是目前唯一能够用于测定蛋白质或核酸溶液
三维结构的方法，但受分子量的限制（＜150aa）。 目前，科学家已经利用这一方法绘制出 15-20%的已 知蛋白质的结构。 /pdb/ ( 美国)
8
蛋白质结构的四个层次
一 级 结 构Biblioteka 二 级 结 构三 级 结 构
四 级 结 构
9
第三节 蛋白质结构测定与预测
绿色荧光蛋白（GFP） /newsf/2008-10/2008109173851.htm 肌红蛋白的三维结构图
10
一级结构测定
基本方法：（1）应用化学裂解法和蛋白酶水解法
将多肽链专一性裂解；（2）逐一测定每个纯化的 小肽段的顺序；（3）根据肽段氨基酸顺序中的重 叠区确定小肽段的排列次序；（4）完成整条多肽 链的顺序分析。 尽管蛋白质顺序分析已经自动化，但仍然耗时、复 杂并且昂贵。重组DNA技术出现后，人们可以从 cDNA或基因序列直接推导出蛋白质的氨基酸顺序， 速度快且经济，已成为最常用的测定蛋白质一级结 构的方法。
测定结果可靠，但需分离出足够量的纯蛋白质(几毫
克-几十毫克)，并制备出单晶体，然后再进行繁杂 的数据收集、计算和分析。而多数蛋白质很难结晶， 或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶。 与溶液中的构象相比，蛋白质分子在晶体中的构象 是静态的。所以，利用这种方法不能测定不稳定的 过渡态的构象。蛋白质的晶体状态与自然状态也不 尽相同，在分析的时候要考虑到这个问题。 工作流程较长。
选择生物大分子中的质子(氢原子核)作为测量对象，连
18
NMR法最大的优点:
可分析溶液中的肽链的三维结构，进而可对活
细胞中的蛋白质进行分析，这意味着可以测得 接近生理状态下的样品，也能测出如蛋白质链 中极易活动、改变部分的动态的结构。这种方 法绕过了结晶、X－射线衍射成像分析等难点， 直接分析自然状态下的蛋白质的结构。
的蛋白的结构与功能的分析 目的基因的获得及预测 改造基因序列（定点突变等） 改造后的基因序列进行表达 分离纯化表达产物，检测
这个步骤实际上是对现有蛋白的改造。
4
蛋白质工程的方向
基因水平上的蛋白质改造：即在基因水平上
改变蛋白质一级结构，以调节蛋白质的二、 三、四级结构和功能；DNA合成技术用于蛋白 质功能片段多肽基因的合成，可创造结构和 功能全新的蛋白质。 蛋白质水平上的修饰（即基因翻译后的蛋白 质修饰）:对蛋白质分子进行化学修饰和生物 修饰，延长蛋白质的稳定性。
第六章 蛋白质工程 PROTEIN ENGINEERING
6.1 概述
6.2 蛋白质结构分析
6.3 蛋白质结构测定与预测 6.4 蛋白质工程的研究方法 6.5 蛋白质工程的应用
1
第一节 概述
诞生于20世纪80年代初； 1983 年，美国加州基因公司 Ulmer
在 SCIENCE(VOL.219) 上 发 表 以 “ Protein Engineering”为题的 专论，一般将此视为蛋白质工程 诞生的标志. 北大张龙翔等在对胰蛋白酶结构 与功能研究的基础上 , 在国内最 早提出蛋白质工程研究的设计与 构想。
Kendrew（1917 - 1997 ）， Perutz（1914 - 2002 ）。（ 1962年）
1957年Kendrew用这种方法给出第一张三维蛋白
质结构——肌红蛋白的0.6nm的真实图像； 1959年Perutz完成血红蛋白0.55nm分辨率的晶 体结构；
15
X－射线晶体衍射分析的缺点
X－射线晶体衍射仪
16
3.1.2核磁共振（NMR）
科学家在1945年发现磁场中的原子核会吸收一定 频率的电磁波，这就是核磁共振现象。由于不同的 原子核吸收不同的电磁波，因而通过测定和分析受 测物质对电磁波的吸收情况就可以判定它含有哪种 原子，原子之间的距离多大，并据此分析出它的三 维结构。
不过，最初科学家只能
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3.1蛋白质三维结构测定
根据蛋白质的状态，测定蛋白质三维结构的方法分为两
大类：
X射线晶体衍射法（X-ray crystallography）和中子 衍射法测定晶体中的蛋白质分子构象
核磁共振法（nuclear magnetic resonance，NMR）、 园二色性光谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫 外差光谱法和氢同位素交换法等测定溶液中的蛋白质 构象。
5
研究的核心内容
蛋白质结构分析（X－射线衍射、NMR） 高级结构的预测和分子设计
蛋白质的修饰与表达
6
第二节 蛋白质结构分析
7
蛋白质分子的结构有4个严格的层次，即蛋白质的
一级至四级结构。 蛋白质的一级结构（primary structure）是指多 肽链的氨基酸残基的排列顺序。 线性多肽链在空间折叠成特定的三维空间结构，称 为蛋白质的空间结构或构象。蛋白质的空间结构包 括：二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和 四级结构。
蛋白质工程
通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助
计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技术， 特异性地对蛋白质结构基因进行改造，产生 具有新的特性的蛋白质的技术，并由此深入 研究蛋白质的结构与功能的关系,并使蛋白质 更好地造福于人类。
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基本步骤
分离纯化目的蛋白
氨基酸测序、X－射线衍射分析、NMR等测试，目
将这种方法用于分析小 分子的结构，因为生物 大分子非常复杂，分析 起来难度很大。
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从左至右库特-乌特里 希(64岁)、田中耕一 (43岁)、约翰-B-芬恩 (85岁) （2000年）
1983年瑞士苏黎世瑞士联邦技术学院的库特-乌特里希
(Kurt Wuthrich)教授首次运用NMR法解析了胰高血糖素 续测定所有相邻的两个质子之间的距离和方位，这些数 据经计算机处理后就可形成生物大分子的三维结构图。
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3.1.1X射线晶体衍射法
用X射线轰击待分析的混合物的结晶，并用照相底
片将其拍摄下来。这样，就可以得到一张结晶分子 的侧视影象照片。通过各种角度的影象照片，就可 以建立起一个该混合物分子结构的三维影象。
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X射线晶体衍射过程示意图
衍射现象的产生是X射线与组成晶体的原子核外电子相互作用 的结果。 14
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3.2相关数据库
多维NMR是目前唯一能够用于测定蛋白质或核酸溶液
三维结构的方法，但受分子量的限制（＜150aa）。 目前，科学家已经利用这一方法绘制出 15-20%的已 知蛋白质的结构。 /pdb/ ( 美国)
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蛋白质结构的四个层次
一 级 结 构Biblioteka 二 级 结 构三 级 结 构
四 级 结 构
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第三节 蛋白质结构测定与预测
绿色荧光蛋白（GFP） /newsf/2008-10/2008109173851.htm 肌红蛋白的三维结构图
10
一级结构测定
基本方法：（1）应用化学裂解法和蛋白酶水解法
将多肽链专一性裂解；（2）逐一测定每个纯化的 小肽段的顺序；（3）根据肽段氨基酸顺序中的重 叠区确定小肽段的排列次序；（4）完成整条多肽 链的顺序分析。 尽管蛋白质顺序分析已经自动化，但仍然耗时、复 杂并且昂贵。重组DNA技术出现后，人们可以从 cDNA或基因序列直接推导出蛋白质的氨基酸顺序， 速度快且经济，已成为最常用的测定蛋白质一级结 构的方法。
测定结果可靠，但需分离出足够量的纯蛋白质(几毫
克-几十毫克)，并制备出单晶体，然后再进行繁杂 的数据收集、计算和分析。而多数蛋白质很难结晶， 或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶。 与溶液中的构象相比，蛋白质分子在晶体中的构象 是静态的。所以，利用这种方法不能测定不稳定的 过渡态的构象。蛋白质的晶体状态与自然状态也不 尽相同，在分析的时候要考虑到这个问题。 工作流程较长。
选择生物大分子中的质子(氢原子核)作为测量对象，连
18
NMR法最大的优点:
可分析溶液中的肽链的三维结构，进而可对活
细胞中的蛋白质进行分析，这意味着可以测得 接近生理状态下的样品，也能测出如蛋白质链 中极易活动、改变部分的动态的结构。这种方 法绕过了结晶、X－射线衍射成像分析等难点， 直接分析自然状态下的蛋白质的结构。
的蛋白的结构与功能的分析 目的基因的获得及预测 改造基因序列（定点突变等） 改造后的基因序列进行表达 分离纯化表达产物，检测
这个步骤实际上是对现有蛋白的改造。
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蛋白质工程的方向
基因水平上的蛋白质改造：即在基因水平上
改变蛋白质一级结构，以调节蛋白质的二、 三、四级结构和功能；DNA合成技术用于蛋白 质功能片段多肽基因的合成，可创造结构和 功能全新的蛋白质。 蛋白质水平上的修饰（即基因翻译后的蛋白 质修饰）:对蛋白质分子进行化学修饰和生物 修饰，延长蛋白质的稳定性。
第六章 蛋白质工程 PROTEIN ENGINEERING
6.1 概述
6.2 蛋白质结构分析
6.3 蛋白质结构测定与预测 6.4 蛋白质工程的研究方法 6.5 蛋白质工程的应用
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第一节 概述
诞生于20世纪80年代初； 1983 年，美国加州基因公司 Ulmer
在 SCIENCE(VOL.219) 上 发 表 以 “ Protein Engineering”为题的 专论，一般将此视为蛋白质工程 诞生的标志. 北大张龙翔等在对胰蛋白酶结构 与功能研究的基础上 , 在国内最 早提出蛋白质工程研究的设计与 构想。
Kendrew（1917 - 1997 ）， Perutz（1914 - 2002 ）。（ 1962年）
1957年Kendrew用这种方法给出第一张三维蛋白
质结构——肌红蛋白的0.6nm的真实图像； 1959年Perutz完成血红蛋白0.55nm分辨率的晶 体结构；
15
X－射线晶体衍射分析的缺点
X－射线晶体衍射仪
16
3.1.2核磁共振（NMR）
科学家在1945年发现磁场中的原子核会吸收一定 频率的电磁波，这就是核磁共振现象。由于不同的 原子核吸收不同的电磁波，因而通过测定和分析受 测物质对电磁波的吸收情况就可以判定它含有哪种 原子，原子之间的距离多大，并据此分析出它的三 维结构。
不过，最初科学家只能
11
3.1蛋白质三维结构测定
根据蛋白质的状态，测定蛋白质三维结构的方法分为两
大类：
X射线晶体衍射法（X-ray crystallography）和中子 衍射法测定晶体中的蛋白质分子构象
核磁共振法（nuclear magnetic resonance，NMR）、 园二色性光谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫 外差光谱法和氢同位素交换法等测定溶液中的蛋白质 构象。
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研究的核心内容
蛋白质结构分析（X－射线衍射、NMR） 高级结构的预测和分子设计
蛋白质的修饰与表达
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第二节 蛋白质结构分析
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蛋白质分子的结构有4个严格的层次，即蛋白质的
一级至四级结构。 蛋白质的一级结构（primary structure）是指多 肽链的氨基酸残基的排列顺序。 线性多肽链在空间折叠成特定的三维空间结构，称 为蛋白质的空间结构或构象。蛋白质的空间结构包 括：二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和 四级结构。