西昌学院基础生物实验中心.

• 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被 氧化形成CO2、、NH3和醛，水合茚三 酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形 成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分 子和氨缩合生成有色物质。
(三)黄色反应
•
含有苯环结构的氨基酸，如酪氨 酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成 黄色物质，该化合物在碱性溶液中进 一步形成深 • 多数蛋白质分子含有带苯环的氨 基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不 易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色 反应。
五、【作业】
• 何谓蛋白质的等电点和沉淀反应？有何实 用意义？ • 实验总结
实验四 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
一、【实验目的】 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解 电泳技术的一般原理
二、【实验仪器与材料】
材料：醋酸纤维薄膜；电泳仪；培养皿； 玻璃板；白磁反应板；镊子；点样器 药品：巴比妥缓冲液；氨基黑；醋酸； 甲醇；乙醇
• 如果样品成分较多，而且彼此的Rf 值相 近，单向层析分离效果不佳，可用双向层 析法，即在长方形或方形滤纸的一角点样， 卷成圆筒形，先用第一种溶剂系统展开， 展开完毕吹干后转90º ，再放于另一种溶 剂系统中，向另一方向进行第二次展开， 如此各成分分离较为清晰。
• 四、【主要内容】 • 1．将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的 层析缸中。 • 2．取层析滤纸(长22cm、宽14cm)一 张。在纸的一端距边缘2~3cm处用铅笔 划一条直线，在此直线上每间隔2cm作 一记号
蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列 平衡：
• （二） 、 在水溶液中的蛋白质分子由于表面 生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗 粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可 因失去电荷和脱水而沉淀。 • 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 • (1)可逆的沉淀反应 此时蛋白质分子的结构 尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后， 蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保 持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐 析作用或在低温下用乙醇(或丙酮)短时间作用 于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。
二、实验要求
生化实验通过学习滴定，比色，层 析，电泳等生化制备基础实验技术，以 及实验方法，操作技术，仪器的使用， 来分析生物体中糖，蛋白质，核酸，酶， 维生素等生化物质及代谢过程，培养学 生具有初步的科学使用能力及严格的科 学作风，掌握基本的生化研究技能为深 入各学科研究打下良好基础。
三、课时安排
西昌学院基础生物实验中心
生物化学实验
一、 实验目的
生物化学是一门实验性学科，是生物 系专业基础课程。它的作用是为生物其他 学科提供必要的生物化学基础知识，通过 与各课程相配合的实验使学生受到有关生 物化学的基础实验技术训练，并验证与加 深理解课堂讲授内容，同时与应用测定技 术相结合，使学生扩大生化实验的应用范 围，提高分析问题解决问题的能力。
(四)考马斯亮蓝反应
• 考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色 调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕 红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后 变为蓝色。 • 它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。反应 速度快，约在2分钟左右时间达到平衡， 在室温一小时内稳定。在0.01~1.0mg 蛋白质范围内，蛋白质浓度与A 595nm 值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。
• 3．点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这 6个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散 的直径最大不超过3mm。 • 4．扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能 接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置 于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中 (点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线 1cm)。待溶剂上升15~20cm时即取出滤纸， 用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风 机热风吹干。
• 物质在纸上移动的速度可以用Rf表示： 色斑中心至原点中心的距离 Rf = ────────────── 溶剂前缘至原点中心的距离
• 物质在一定溶剂中的分配系数是一定的， 故移动速率（Rf值）也恒定，因此，可 以根据Rf值来鉴定被分离的物质。
• 纸层析法按操作方 法分成两类，即： 垂直型和水平型。 垂直型是将滤纸条 悬起，使流动相向 上或向下扩散；水 平型是将圆形滤纸 置于水平位，溶剂 由中心向四周扩散。
本实验总学时数为30学时 每次实验3学时
实验室要求
一、 实验课的目的 1、加深理解：加深对生物化学基本理论的理解。 2、掌握技术：掌握生物化学的基本实验方法和 实验技术（四大基本技术：离心、电泳、层析、 比色）及分子生物学的一些基本技术和方法。 3、培养能力：培养学生的思维能力、动手能力 和表达能力。 4、掌握精髓：科学的精髓是实事求是、敢于探 索、善于创新的精神，要对实验中出现的一切 反常现象进行讨论，并大胆提出自己的看法。
• 5．显色 用喷雾器均匀喷上0.1％茚三酮 正丁醇溶液然后置烘箱中烘烤5分钟 (100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑 点。 • 6．计算各种氨基酸的Rf值。
• 五、【作业】 • 1．何谓纸层析法？ • 2．何谓Rf值?影响Rf值的主要因素是什 么? • 3．怎样制备扩展剂? • 4．层析缸中平衡溶剂的作用是什么？
1.了解蛋白质的两性解离性质 2.学习测定蛋白质等电点的一种方法 3.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 4.了解沉淀蛋白质的几种方法及实用意义 5.了解蛋白质变性与沉淀的关系
6.掌握临床常规定性检验蛋白的方法
二、【实验仪器与材料】
材料：水浴锅；温度计；鸡蛋；乳钵 药品：醋酸；酪蛋白；醋酸纳；硝酸 银；硫酸铵；氯化钡；甲基红；碳 酸钠；氢氧化钠；盐酸；黄基水杨 酸
(二)茚三酮反应
• 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色 物质外，所有a-氨基酸及一切蛋白质都能和茚 三酮反应生成蓝紫色物质。 • β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应。尿 素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈 现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚 三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定 就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中， 应严防干扰物存在。 • 该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨 基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基 酸定量测定方法。
三、【实验原理】
（一）双缩脲反应 尿素加热至l80℃左右，生成双缩脲 并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能 与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应 称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键， 其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。 可用于蛋白质的定性或定量测定。
• 双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所 有。含有一个肽键和一个——CS—— NH2，——CH2—NH2，——CRH— NH2，——CH2——NH2——CHNH2—— CH2OH或——CHOHCH2NH2等基团的物 质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。NH3也 干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色 的络离子Cu(NH3)42+。因此，一切蛋白质或 二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲 反应的物质不—定都是蛋白质或多肽。
二、 生化实验室规则和要求
1、预习： 课前要预习实验教材，了 解实验目的、原理，熟悉操作规程。 2、秩序： 自觉遵守纪律，维护教学 秩序，不准迟到、早退，保持安静， 严禁谈笑打闹，听从教师指导，未 经教师同意，不得随意离开实验室。
3、整洁： 实验台面必须保持整洁， 仪器药品要井然有序，公用试剂用毕，应立 即盖严放回原处，勿使药品试剂撒在实验台 面和地面。 实验完毕，需将药品试剂排列整齐，仪 器要洗净倒置放好。 全体同学由班长安排轮流值日，负责当 天实验室卫生、安全和一些服务性工作，经 教师上吸附着 水（约含20%—22%）是经常用的固定 相，此类有机溶剂如醇、酚等为常用的流 动相。把欲分离的物质加在纸的一端，使 流动溶剂经此移动，这样就在两相间发生 分配现象。由于物质分配系数的不同，就 逐渐在纸上集中于不同的部位。在固定相 中分配趋势较大的成份，随流动相移动的 速度就慢；反之，在流动相分配趋势较小 的成分，移动速度就快。
• 层析法是近代生物化学最常用的分析法之 一，此法可以分离性质极为相似、而用一 般化学方法难以分离的各种化合物，如各 种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。 • 层析法有多种类型，根据所用两组分不同 分为以下几类：吸附层析、分配层析、离 子交换层析、凝胶层析和亲和层析等；根 据操作方式不同分为：柱层析、薄层层析 和纸层析等。
• (2)不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构 发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶 于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固， 蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属 于此类。 • 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条 件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性 蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白 质也未必都已变性。
• （三）、正常人尿中只含微量蛋白质，不 能用临床常规方法测定出来。用临床常规 方法能检查出蛋白质的尿称为蛋白尿。患 肾脏病的人(如患肾小球肾炎、肾盂肾炎) 往往有蛋白尿，因而
• 尿中蛋白质的检查在临床上具有重要的诊 断意义。
四、【主要内容】
1.蛋白质等电点的测定 2.蛋白质的沉淀与变性 3.尿蛋白定性检验
实验一
氨基酸的分离鉴定 -----纸层析法
一、【实验目的】
• 学习纸层析的基本原理，掌握氨基酸分离 鉴定的操作技术，学会分析未知样品。 二、【实验仪器与材料】
• 层析缸；喷雾器；层析滤纸；扩展剂；氨 基酸溶液；显色剂
三、【实验原理】
• 层析是利用混合物各组分物理化学性质 （如：溶解度、吸附能力、电荷和分子量 等）的差别，使各组分在支持物上集中分 布在不同区域，借此将各组分分离。 • 层析系统分为两个相：固定相和流动相。 由于各组分受固定相的阻力和受流动相的 推力影响不同，各组分移动速度也各异， 从而使各组分得以分离。此法首先用于有 色物质的分离，故又称色层析法。
4、节约： 使用仪器、药品、试剂 及各种物品必须厉行节约，并节约水电。 应特别注意保持药品和试剂的纯净，严 防混杂、乱用和污染。 使用和洗涤仪器应小心仔细，防止 损坏，贵重仪器使用前应熟悉使用方法， 严格遵守操作规程，严禁随意开动，发 现故障后应立即报告指导教师，不要自 己动手检修，如有损坏按学校规定赔偿。
三、【实验原理】
（一）、蛋白质分子的解离状态和解离程 度受溶液的酸碱度影响。 当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒 上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既 不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的 pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各 有其特异的等电点。 在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化， 可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电 点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液 pH值。
5、安全：时刻注意防火、防水、防 电、防危险品、防事故，以免发生意外。 实验室内严禁吸烟。 使用乙醚、苯、乙醇、丙酮等易燃品 时，不允许在电炉、酒精灯上直接加热。 如有危险发生，应首先关掉电源；有 机溶剂着火时，勿用水泼，以免扩大燃 烧面积，可用沙土、灭火器具灭之。 实验室内一切物品未经本室负责教 师批准，严禁携带出室外，有毒物品尤 其如此。借物必须办理登记手续。
四、【主要内容】
内容：蛋白质和氨基酸与显色剂反应呈 现一定的颜色反应 步骤： 双缩尿反应； 茚三酮反应； 黄色反应； 考马斯亮蓝反应
五、【作业】
• 通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质 和氨基酸的方法?它们的原理? • 实验总结
实验三 蛋白质性质实验（二） 蛋白质的等电点测定和沉淀反应
一、【实验目的】
实验二 蛋白质的性质实验（一） ----蛋白质及氨基酸的呈色反应
一、【实验目的】 1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主 要连接方式 2.了解蛋白质和氨基酸的呈色反应原理 3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸 的方法。
二、【实验仪器与材料】
蛋白质溶液（新鲜鸡蛋清加水配制 的溶液）； 大豆提取液；头发；指甲； 考马斯亮蓝；尿素；氢氧化钠；硫 酸铜；氨基酸；茚三酮；