百日咳杆菌毒素

百日咳杆菌毒素

自从1909年发现百日咳杆菌对热不稳定毒素（heat-labile toxin, HLT）或称皮肤坏死毒素后，百日咳杆菌的活性物质不断被分离和提纯，其中与致病有关的物质陆续被发现。与百日咳杆菌致病有关的物质除荚膜外，尚有百日咳杆菌的菌毛成分、内毒素（endotoxin）、百日咳毒素（pertussis toxin, PT）和腺苷酸环化酶/溶血毒素（adenylate cyclase/hemolysin toxin, ACT）等：内毒素即百日咳杆菌脂多糖（LPS）；百日咳毒素由于其多重作用而有不同的命名，如因能提高小鼠对组织胺、5-羟色胺等的敏感性而被称作组织胺敏感因子（histamine-sensitizing factor, HSF），因能促进白细胞、淋巴细胞增生又被称作白细胞增生因子或称淋巴细胞增生因子（leukocytosis promoting factor, LPF），因能使百日咳杆菌粘附于呼吸道纤毛上而使细胞损伤导致阵发性咳嗽又被称作气管细胞毒素（tracheal cytotoxin, TCT）；ACT能促进巨噬细胞内的cAMP增加而抑制巨噬细胞功能，而且此环化酶毒素又能活化胰岛B细胞导致大量胰岛素分泌而有被称作胰岛素活化蛋白（islets-activating protein, IAP）；百日咳杆菌有菌毛血凝素（fimbrial hemagglutinin, FHA）和白细胞增生因子-血凝素（lymphocytosis-promoting factor hemagglutinin, LPF-HA），使病人淋巴细胞增多，两者对小鼠均有免疫保护活性。近年对百日咳杆菌的研究热点主要集中在调控百日咳毒素表达的天然启动子和百日咳疫苗的研制上。现将起主要毒素及疫苗的研究进展分述如下。

一.内毒素(1-3)

百日咳杆菌脂多糖又称耐热毒素，是百日咳杆菌的被膜成分。与其他细菌的内毒素同样，其介导活性的主要部分为LPS的类脂A（lipid A）结构。

1.化学性质早期采用热酚/水法提取百日咳杆菌的LPS（Westphal et al, 1952），以后有人用超速离心进行纯化并用各种蛋白酶处理以得到高纯度的LPS，各种不同菌株获得的LPS产量为6~34mg/g细菌干重。

百日咳杆菌内毒素的主要特征是含有两种不同成分的LPS，分别称作LPS-Ⅰ和LPS-Ⅱ。LPS-Ⅰ和LPS-Ⅱ两者比例为2：3。两组分均存在于百日咳Ⅰ相菌和部分Ⅳ相菌。这两组分的差别在于分子的类脂部分不同，一种分子的类脂连着2-3个脂肪酸而另一种含有3-5个脂肪酸，而且脂肪酸的组成也较特殊，含有罕见的2-甲基-3-羟基葵酸和2-甲基-2-羟基四葵酸，其他的成分如磷酸盐、葡萄糖胺、四葵酸、3-羟基四葵酸和3-羟基葵酸大致一致。类脂部分与多糖以3-脱氧-2-辛酮糖酸（KDO）分子相连，但KDO分子在两种LPS 中磷酸化程度不同。将百日咳杆菌LPS用4mol/L HCl在100℃水解，得到一种含分支的三糖，即4-O-（2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基）-6-O-（2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基尿嘧啶）-D-吡喃葡萄糖。此分子皆存在于两种LPS中。用质谱法精确测定百日咳杆菌LPS的类脂部分的分子量，结合31P-NMR的结果推断的百日咳杆菌类脂A的结构见图1。

2.百日咳杆菌LPS的毒性百日咳杆菌LPS具有明显的致热原性、Shwartzman反应、佐剂活性并具有增强对感染的非特异抵抗力活性等，现将百日咳杆菌LPS的活性小结于表1。

表1 百日咳杆菌LPS的生物学活性

试验方法结果

小鼠体重增长试验（18-20g 小鼠）注射24h，体重改变的最大剂量为1.07μg

家兔热原性试验2μg/kg剂量，最大平均升

高温度为2℃

家兔局部Shwartzman反应阳性反应的敏感剂量介于

12.5-200μg

保护反应：诱导小鼠对伤寒、大肠杆菌、肺双、绿脓杆菌和金葡菌感染的非特异性抵抗力（LPS和各菌攻击，相隔3天）LPS剂量在12.5-200μg，对所有攻击菌具有显著保护作用，最大保护作用是对肺双，最弱保护作用是对绿脓

佐剂作用：在流感病毒疫苗对小鼠的佐剂活性抗病毒血凝素抗体年度增高2.5倍

二．对热不稳定毒素(4)

百日咳杆菌培养于合适的固体或液体培养基中，从陈旧培养基的上清液或新鲜收集的百日咳杆菌破碎后离心所得的上清即可得到HLT。

1．HLT的理化性质在不同型分离得到的HLT含量和毒性不一，光滑型新分离培养物含有较大量毒素，而小菌落变种具有高度毒性。从新鲜细菌破碎提取的HLT毒性较强。提取的流程如下：6% NaCl洗下培养于马铃薯甘油血培养基的百日咳杆菌→35℃干燥3天→与NaCl结晶混合磨成粉→高速离心→DEAE-纤维素吸附，在pH值7.1下0-1mol/L NaCl梯度洗脱→硫酸铵盐析活性组分再溶即得到高度纯化的HLT

纯化的HLT为蛋白质，存在于细菌的细胞壁，超速离心在1.4S，分子量约为89Kd，含14.6%的氮和1.4%还原糖，无脂类和磷酸根，能被胰蛋白酶消化，但不被DNA酶或RNA酶消化。纯化的HLT最小致死量为6-10μg/小鼠，对豚鼠的最小皮肤坏死剂量为0.01μg 。HLT在5-22℃保存于水溶液两天，活性就尚失25%，37℃两天或40℃9小时95%的毒性消失，因此称作对热不稳定毒素。利用这一性质，可以在37℃用0.3%的福尔马林脱毒制备类毒素。干燥的HLT的毒性相对较稳定，保存于50%葡萄糖或蔗糖也可保持稳定性，但碱性有利于毒素的破坏。

2.HLT的毒性与致病性HLT为一种高度毒性蛋白，其毒性在体内及体外均可损伤各种组织，能引起气管和支气管纤毛上皮细胞炎症和坏死，在百日咳致病上具有重要意义。

用纯化的HLT给豚鼠和小鼠腹腔或静脉内注射，肝脏、脾脏和肾脏出现明显坏死、充血、出血和退行性变。将粗提的HLT感染绵羊、猪和鸡，也引起皮肤坏死，其毒性反应和家兔与豚鼠试验相似。典型者，当小鼠注入HLT后，脾脏苍白和明显萎缩，在7天内脾脏平均重量自51mg降至13mg，组织学检查末发现红髓，仅有少许脾小体，在小体之间空隙充满结缔组织，淋巴细胞大量减少，肝脏的重量也减少并出现轻度细胞萎缩，腹腔伴有腹水。

HLT能直接作用于呼吸中枢，提高吸气和呼气反射中枢的兴奋性。

HLT对体外培养组织细胞有杀伤作用，如HeLa细胞、鸡胚肺上皮细胞、原代鼠胚及KB细胞具有杀伤作用。

HLT对神经组织的作用表现在：注射少量毒素于豚鼠、小猫或小狗脑内或脑膜中，引起动物惊厥和大脑损伤的症状，豚鼠通常在5-24小时内死亡。典型的组织学变化是：脑细胞发生水肿，脑膜血管周围、神经组织和脑室等都有白细胞浸润，细胞核变化，胞浆颗粒性物质减少和空泡形成。

3.HLT的免疫性先前认为HLT无抗原性，后来证实HLT粗制品经福尔马林脱毒后，能使儿童和实验动物产生抗体，该抗体能中和HLT皮肤坏死作用和致死活性。HLT不易在体内显示抗原性的原因可能是HLT为弱抗原性，容易在动物体内被破坏，尤其脾或淋巴结阻止毒性作用不能刺激抗体产生，且HLT与菌细胞浆内结合，致使不能很好刺激机体产生抗体，如用类毒素，则能刺激机体产生抗体。

用HLT抗毒素能保护小鼠腹腔内百日咳杆菌的攻击，而免死于毒血症；抗毒素对鼻内攻击百日咳杆菌而至的动物肺部感染也有保护作用；但用百日咳杆菌攻击小鼠脑内则无保护作用。这些结果致使百日咳杆菌HLT的保护性抗原研究尚未得出定论，但大多数人认为百日咳的抗度免疫极为重要，在制备疫苗苗时应该含有HLT类毒素。

三.百日咳毒素（PT）(5-14)

由于以前提取和制备的差别以及百日咳毒素的多种生物学活性，致使百日咳毒素有许多别名。现在从基因的角度已经清楚，百日咳毒素是6个亚基组成的蛋白复合物，但只有5个亚单位，即S1、S2、S3、S4、S5之间的比例为1：1：1：2：1而形成6个亚基的复合物，分子量为105Kd。

1.PT的制备与纯化PT在先前用不同的纯化方法得到后，在某方面观察到效果而被命名为不同的名称。这里介绍Munoz等（1981）的方法，这一方法相比较而言得到较纯的PT，而其他的方法要么太粗或者把6个亚基给将解了。将百日咳杆菌培养于Stainer和Scholte综合液体培养基中，经36℃孵育5天，除去菌细胞的上清液用冰醋酸调pH至6.5，然后每升中加入0.5g/ml的ZnCl220 ml，离心收集沉淀物，按上清也量每升加入10%Na2HPO4溶液37ml，使Zn-蛋白复合物溶解，离心取沉淀，用50mmol/L的Tris-HCl NaCl 缓冲液pH8.0（TNB）37ml抽提两次以上，混合抽提液，以5mmol/L Tris-HCl pH8.0 16ml连续透析3次，进一步离心收集沉淀物，再以0.1mol/L焦磷酸钠pH10.5提取，其抽提物再以低pH的TNB等容积稀释，未溶的沉淀物再按上述方法提取两次以上。将此含有PT的抽提物进行Sepharose CL-6B（

2.5×90cm）层析，