基于二代测序技术的宏基因组学分析

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基于宏基因二代测序技术的感染性疾病病原体筛查与快速诊断

基于宏基因二代测序技术的感染性疾病病原体筛查与快速诊断感染性疾病是指由各种病原体引起的疾病，包括细菌、病毒、真菌等。

在感染性疾病的筛查与诊断中，宏基因二代测序技术被广泛应用，并且在快速、灵敏、准确方面具有优势。

本文将探讨基于宏基因二代测序技术的感染性疾病病原体筛查与快速诊断的相关内容。

一、宏基因二代测序技术的原理：宏基因二代测序技术是通过对DNA或RNA进行快速、高通量的测序，将样本中的病原体基因组进行测序分析，从而实现对感染性疾病病原体的筛查与诊断。

该技术主要分为以下几个步骤：提取样本中的总DNA或RNA，构建测序文库，进行高通量测序，得到测序数据，通过生物信息学分析进行病原体定性与定量等分析。

二、宏基因二代测序技术在感染性疾病病原体筛查中的应用：1. 病原体全谱检测：宏基因二代测序技术能够对病原体基因组进行全谱检测，不受预先设定的病原体种类限制，能够检测到已知和未知的病原体，提供更全面的信息。

2. 病原体定量分析：通过统计测序数据中病原体相关的序列数量，可以对病原体的含量进行定量分析，从而判断感染的程度。

3. 比较分析和演化研究：通过对不同样本的测序数据进行比较分析，可以了解感染性疾病病原体的种类分布、演化关系等。

4. 抗药性检测：宏基因二代测序技术可以通过分析病原体基因组中的相关位点，判断病原体对抗生素的耐药性情况。

5. 宏基因组学研究：通过对感染性疾病病原体整个基因组的测序和分析，可以揭示病原体的遗传特征、致病机制等，为疾病的治疗和预防提供理论依据。

三、基于宏基因二代测序技术的感染性疾病病原体快速诊断的优势：1. 快速性：宏基因二代测序技术具有高通量和高速度的特点，能够在较短的时间内得到测序数据，从而快速进行病原体的筛查和诊断。

2. 灵敏性：宏基因二代测序技术能够对样本中微量的病原体进行检测和分析，提高病原体的检出率和灵敏度。

3. 准确性：通过对测序数据进行生物信息学分析，可以准确地鉴定病原体的种类，并提供详细的遗传信息，为疾病的治疗和预防提供准确的依据。

二代宏基因组测序数据标准分析流程

二代宏基因组测序数据标准分析流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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基于二代测序技术的基因组拷贝数变异测序联合核型分析技术在产前诊断中的应用价值

脊椎通常表示人体脊柱，位于背部正中，上端接颅骨，下端至尾骨尖，是身体的支柱，具有负重、减震、保护以及运动等功能，是人体重要组成部分[1]。

脊椎骨折是发上于脊柱上的骨折，是骨科常见骨折类型，多由暴力导致，严重影响患者生活质量，临床治疗过程中主要通过影像学检查对疾病进行有效诊断[2]。

本次主要研究X线平片、CT及磁共振成像对脊椎骨折的不同诊断价值，现将研究结果报道如下：1　资料与方法1.1一般资料选取在我院于2019年12月~2020年12月进行检查的的135例脊椎骨折患者作为本次研究对象，随机为甲组、乙组以及丙组，各45例。

甲组患者男性23例，女性22例，患者年龄19~69岁，平均年龄（43.56±15.85）岁；乙组患者男性25例，女性20例，患者年龄19~68岁，平均年龄（43.79±15.05）岁；丙组患者男性24例，女性21例，患者年龄20~69岁，平均年龄（43.34±15.46）岁。

纳入标准：①明确为脊椎骨折患者；②所有患者均为成年患者，不伴有语言交流障碍；③所有患者体内均无影响诊断仪器结果的相关金属制品；④本研究经伦理会批准且所有患者及患者家属均签署知情同意书。

比较三组患者的性别以及年龄等一般资料不存在明显差异，P>0.05表示差异不具有统计学意义，存在可比性。

1.2方法所有患者收治入院后，医生询问患者基础病情并进行基础干预。

甲组患者均采用X线进行诊断，根据患者病情调整相应体位，以及仪器参数，对病灶部位进行X线平扫；乙组患者均采用CT进行诊断，设置机器相关参数，协助患者取合适体位，对其进行扫描诊断；丙组患者采用磁共振进行诊断，调整仪器相关参数，对患者病灶部位进行扫描，观察并记录三组患者影像学诊断结果。

1.3观察指标比较三组患者经不同仪器诊断后的诊断结果。

1.4统计学分析采用SPSS23.0统计软件对本次研究数据进行统计学分析。

计数资料采用百分比（%）表示，结果采用x2检验。

二代测序分析流程

二代测序分析流程Next-generation sequencing (NGS) has revolutionized the field of genomics by allowing researchers to rapidly sequence large amounts of DNA and RNA. 二代测序（NGS）已经彻底改变了基因组学领域，使研究人员能够快速测序大量的DNA和RNA。

This technology has enabled the analysis of entire genomes, transcriptomes, and epigenomes, providing a wealth of data that can be used to study genetics, disease, and evolution. 这项技术使得对整个基因组、转录组和表观基因组的分析成为可能，为研究遗传学、疾病和进化提供了大量的数据。

One of the key challenges in NGS is the analysis of the data generated, which requires a complex and multi-step process to extract useful information. 二代测序面临的关键挑战之一是分析生成的数据，这需要复杂且多步骤的过程来提取有用的信息。

The NGS analysis pipeline typically involves several key steps, including quality control, read mapping, variant calling, and downstream analysis. 二代测序分析流程通常包括几个关键步骤，包括质量控制、读片段比对、变异检测和下游分析。

二代测序(NGS)实验方案设计和应用

这里为您介绍二代测序的相关流程和应用。

随着人类基因组工程的完成，对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。

这些新的测序平台允许进行高通量测序，具有广泛的应用：∙全基因组从头测序或者重测序∙目标序列重测序∙转录组分析∙微生物组研究∙基因调控研究NGS 序列二代测序仪器有很多种组合，在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技术方面存在存在差异。

从规格和初始成本的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。

台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR一样，自己进行测序。

这些仪器可以和一些靶标序列富集技术相结合，用在一些临床的应用中，其中：选定的靶标基因用于深度分析，以检测稀有的突变，或者检测多样样本中（比如癌症样本）中的突变。

目前，这些仪器的通量在10 Mb到7.5 Gb之间，但是随着硬件，软件和试剂的持续改善，通量也在稳步增加。

高通量测序仪非常适合于大量的，基因组范围的研究，每次测序能测定600 Gb的序列。

一些这样的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度相对较短，这对于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为问题。

与此相反，也有一些仪器能测序的片段较长（达到2500 bp），但是其精度和测序能力（90 Mb）要低很多。

还有一些测序能力位于两者之间的仪器（~800 bp，700 Mb）。

因此，应用决定了哪一种仪器是最合适的。

有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。

这种技术中，根据一个DNA链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变，可以确定通过这个孔道的碱基。

这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体，而不需要生成新的DNA链。

DNA测序二代DNA测序的工作流程如下：∙DNA样本制备∙文库构建和验证∙文库分子大规模平行克隆扩增∙测序二代测序DNA样本的质量控制首先，评价基因组DNA的质量是非常必要的（完整性和纯度）。

基因组测序技术在宏基因组和微生物学研究中的应用

基因组测序技术在宏基因组和微生物学研究中的应用宏基因组和微生物学是现代生物学研究领域中最为重要的两个分支之一。

这两个分支采用了先进的分子生物学技术，使我们能够更好地了解生态系统的结构和功能。

其中，基因组测序技术是研究宏基因组和微生物学的重要工具之一，其作用在于揭示微生物在生态系统中的作用以及生态系统中所有微生物的任意物质代谢通路。

基因组测序技术在宏基因组研究中的应用宏基因组是特定环境内所有微生物的总DNA组成，其研究可以揭示生态系统的生物多样性、进化历史、生态功能以及环境变化对微生物群落结构和活性的影响。

基因组测序技术在宏基因组研究中的应用已经发生了革命性的变化。

20年前，我们主要依靠相对较为耗时、费力和不精确的第二代测序技术（Sanger测序）来研究宏基因组。

随着第三代DNA测序技术的发展，基因组测序技术已经变得更加快速、更加准确，并且也更易于使用。

基因组测序技术使我们能够获取宏基因组内包含的各种微生物的全基因组序列，从而使研究人员可以在更精细的水平上分析其群体结构和生态作用。

基因组测序技术可以被应用于三种相互接续的方法中：第一种是从宏基因组数据中识别出不同的微生物，并了解宏基因组中各种微生物的数量和丰度。

第二种方法是确定不同微生物菌株之间的基因转移事件，从而了解它们在环境內是否相互作用；最后，第三种方法是根据功能基因的分类及其相对丰度，预测不同微生物在生态系统中所扮演的角色。

基因测序技术在微生物学研究中的应用另一端，微生物学是一门研究微生物的学问，包括细菌、病毒、真菌、原核生物和其他小型生物。

微生物是环境与生态系统中的重要组成部分，其中细菌是自然界中天然存在的物种，还是人工选择的工业化生物反应器和生物转化过程中极重要的生物体。

微生物的功能涉及DNA复制、转录、翻译和代谢通路等许多方面，因此对微生物基因组的研究必须采用高效的基因测序技术。

幸运的是，随着第三代测序技术的发展，微生物学研究中的基因组测序已经变得更加快速、准确和可靠。

细菌比较基因组学分析新手指南

新手指南篇：基于二代测序数据的比较基因组分析摘要现在高通量测序既快又便宜，足以被视为细菌研究的重要工具，并且在公共领域有数以千计的细菌基因组序列供比较分析。

越来越多不同的群体研究，像临床和公共卫生实验室，进行细菌基因组分析，它们感兴趣与细菌遗传学和进化相关的广泛话题。

例如疫情分析及致病性和耐药性的研究。

在这个初学者的指南中，我们的目标是，为那些生物信息学背景的个人分析细菌基因组数据提供了一个切入点，让他们来回答自己的研究问题。

我们假设读者熟悉遗传学和序列数据的基本性质，但不承担任何计算机编程技能。

涉及的主要议题是组装，contig排序，注释，基因组比较及提取共有的输入信息。

每个部分均使用公开可用的大肠杆菌数据和免费的软件工具，所有这些都可以在台式计算机上被执行。

介绍和目的现在高通量测序既快又便宜，足以被视为细菌研究的重要工具。

越来越多不同的群体研究，像临床和公共卫生实验室，进行细菌基因组分析，它们感兴趣与细菌遗传学和进化相关的广泛话题。

例如疫情分析及致病性和耐药性的研究。

如今细菌的基因组序列，可以在许多实验室内部产生，仅需要使用台式测序仪数小时或数天，如Illumina的MiSeq，Ion Torrent PGM或者Roche 454 FLX Junior。

这些许多数据在公共数据库中可用，允许进行广泛的比较分析；例如截止到2013年2月GenBank数据库包含>6500细菌基因组，其中2/3是处于草图形式（即呈现为一组片段序列，并非单一序列代表全基因组）。

在这个初学者的指南中，我们的目标是，为个人想利用全基因组序列数据进行从头组装基因组回答以在更广泛的研究目标范围内的问题提供一个切入点。

该指南并非针对那些希望执行数百个基因在同一时间的自动化处理;在常规的微生物学诊断实验室的使用顺序的一些讨论是在文献中可用的[8]。

我们假设读者熟悉遗传学和序列数据的基本性质，但不承担任何计算机编程技能，而我们使用，可以在台式计算机（在Mac，Windows或Linux）上执行的例子。

基于二代测序技术的宏基因组学研究

基于二代测序技术的宏基因组学研究引言：宏基因组学研究是对环境样品中的微生物群落进行整体性的基因组测序和分析。

相比于传统的分离培养方法，宏基因组学能够获得更全面和准确的微生物信息，从而更好地理解微生物的生态功能和生物多样性。

随着二代测序技术的广泛应用，宏基因组学研究取得了突破性进展。

本文将介绍二代测序技术在宏基因组学研究中的应用以及其带来的优势。

二代测序技术的应用：二代测序技术，包括Illumina HiSeq、Illumina MiSeq和Ion Torrent PGM等，以其高通量、高灵敏度和较低成本的特点，已经成为宏基因组学研究领域的主流技术。

它可以同时测序大量的DNA片段，并通过信息处理和生物信息学分析还原出原始宏基因组信息。

优势：相比于传统的Sanger测序技术，二代测序技术在宏基因组学研究中有如下优势：1.高通量：二代测序技术可以同时测序大量的DNA片段，可以快速获得大规模的宏基因组数据。

2.高灵敏度：二代测序技术可以检测到微生物群落中低丰度的微生物，从而更全面地了解微生物的组成和功能。

3.构建很多样的文库：二代测序技术可以通过不同的文库构建方法，对不同类型的微生物进行详细的研究，包括环境样品中的细菌、真菌、古菌等。

4.可组装长序列：通过二代测序技术，可以获得长序列，从而更好地了解微生物的基因组结构和功能。

5. 低成本：相对于传统的Sanger测序技术，二代测序技术的成本更低，更适合大规模的宏基因组学研究。

应用：二代测序技术在宏基因组学研究中有多个应用。

首先，通过测序环境样品中的16SrRNA基因，可以对微生物群落进行结构和组成的分析。

其次，通过全基因组测序，可以了解微生物的基因组结构和功能，从而揭示微生物的生态功能和代谢途径。

此外，二代测序技术也可以用于病原体的鉴定和微生物耐药基因的检测。

结论：二代测序技术已经成为宏基因组学研究领域的主流技术，通过快速、高通量和低成本的特点，可以获得大规模的宏基因组数据，从而更好地了解微生物的组成和功能。

基于二代测序技术的宏基因组学分析

基于二代测序技术的宏基因组学分析宏基因组学是一门研究微生物群落的遗传多样性和功能的学科。

随着高通量测序技术的快速发展和应用，二代测序技术如Illumina公司的MiSeq和HiSeq平台已经成为宏基因组学研究中最常用的方法之一、本文将介绍基于二代测序技术的宏基因组学分析的工作流程和一些常用的分析方法。

首先，宏基因组学研究的核心是从环境样品中提取DNA，并进行PCR扩增来构建测序文库。

在这一步骤中，研究者需要设计适当的引物来扩增感兴趣的基因序列，例如16SrRNA基因用于细菌和古菌的研究，ITS区域用于真菌研究，或者全基因组扩增用于功能基因的分析。

提取到的DNA样品会经过质量检测和浓缩后，用PCR方法扩增目标基因序列或整个基因组。

提取到的DNA样品经过扩增后，可以进行两种主要的二代测序方法，即全基因组测序和目标基因测序。

全基因组测序是对DNA样品进行整个基因组的测序，可以获得更全面的基因组信息，但由于数据量大，需要更高的测序成本和计算资源。

另一种是目标基因测序，主要针对特定的基因序列进行测序，数据量较小，更适合于大规模的样品处理。

得到测序结果后，需要对测序数据进行质控处理，包括去除引物序列、质量剪切、去除低质量的reads等等。

然后，将高质量的reads进行序列比对、细菌分类和功能注释等分析。

常用的宏基因组学分析软件包括QIIME、Mothur和MG-RAST等。

在分析中，最常用的方法是对16S rRNA基因进行分类和定量分析。

通过比对测序reads和数据库中的已知序列，可以获得样品中细菌和古菌的组成。

此外，也可以通过测序数据进行基因丰度分析，以了解样品中各个基因的相对丰度。

除了基因组组成分析，宏基因组学也可以用于功能基因的研究。

通过对测序数据进行功能注释，可以了解样品中不同基因的功能。

通常，会将测序reads比对到已知的功能基因数据库，如KEGG、COG和GO等，获得基因功能分类和丰度信息。

此外，基于二代测序技术的宏基因组学还可以进行微生物群落的多样性分析。

第二代测序技术——新一代基因组测序技术原理及应用

第二代测序技术——新一代基因组测序技术原理及应用第二代测序技术是基于Sanger测序技术的改进和发展而来的，也是新一代基因组测序技术。

它具有高通量、高效率和低成本的特点，能够快速而准确地测序大量的DNA或RNA分子。

本文将介绍第二代测序技术的原理以及在基因组测序领域的应用。

首先，DNA样本需要经过PCR扩增，将其复制成足够数量的DNA分子，以便后续的测序过程。

扩增完成后，样本会转化为一个DNA库。

接下来，DNA库会被片段化。

传统的第二代测序技术中，会将DNA库分为较小的片段，通常长度为几百到几千碱基。

这些片段可以通过物理方法进行片段化，如超声波等。

而在一些新兴的第二代测序技术中，如Nanopore测序和单细胞测序等，可以直接对DNA进行测序，无需片段化。

然后，在片段化后的DNA片段上进行连接处理。

连接可以用于将适配体引入到DNA片段的两端，以便进行后续的测序反应。

接着，需要对连接后的DNA片段进行定量处理，以确保在后续的测序反应中能够控制好DNA的浓度。

最后，进行测序反应。

第二代测序技术包括很多种不同的测序方法，如Illumina测序、454测序、Ion Torrent测序等。

这些方法基本都是通过测量DNA分子释放的荧光信号或其它信号，来确定碱基的顺序。

此外，第二代测序技术还可以应用于转录组测序。

转录组测序可以检测特定组织或细胞中所表达的所有基因。

通过转录组测序，可以了解在不同生理状态下基因的表达水平变化，以及不同基因之间的调控网络等。

除了全基因组测序和转录组测序，第二代测序技术还可以应用于表观基因组测序。

表观基因组测序可以检测DNA上的化学修饰，如甲基化和羟甲基化等。

这些化学修饰可以影响基因的表达和调控，从而对生物体的发育和疾病等起到重要作用。

此外，第二代测序技术还可以应用于单细胞测序、宏基因组测序、博弈测序、环境样品的测序等。

这些应用领域的发展和成熟，进一步拓宽了第二代测序技术的应用范围。

总结起来，第二代测序技术是一种高通量、高效率和低成本的基因组测序技术。

宏基因组二代测序技术在儿童细菌性脑膜炎病原诊断中的价值

细菌性脑膜炎是儿童常见的中枢神经系统感染性疾病，具有较高发病率和病死率，每年在全球范围内造成数十万人死亡，且30%~50%遗留永久性神经系统后遗症，因此早期诊断尤为重要。

目前诊断细菌性脑膜炎的金标准仍然是脑脊液培养，但在进行病原学检测之前抗菌药物的广泛使用会影响脑脊液中活菌数量，使得培养阳性率减低从而增加临床病原确诊及目标治疗的难度。

因此，快速有效的病原学检测方法一直是细菌性脑膜炎的临床研究热点，亦是治疗成功的关键因素。

宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技术可以检测患儿样本中的所有潜在微生物，较传统培养法具有检测周期短、检测范围宽、阳性率高的优点，尤其适用于传统培养法无法明确病原菌或需要迅速明确病原菌的患儿，近年来越来越受到临床医生的关注。

现回顾性分析2019年1月1日至2020年12月31日于复旦大学附属儿科医院住院并诊断为“细菌性脑膜炎”或“化脓性脑膜炎”或“中枢神经系统感染”患儿的临床资料，比较脑脊液mNGS与培养的结果，探讨mNGS技术在儿童细菌性脑膜炎病原诊断中的应用，为儿童细菌性脑膜炎的早期病原学诊断提供一定依据和帮助。

对象和方法一、对象回顾性分析2019年1月1日至2020年12月31日于复旦大学附属儿科医院住院并诊断为“细菌性脑膜炎”或“化脓性脑膜炎”或“中枢神经系统感染”的189例患儿的临床资料。

纳入标准：根据2019年“儿童社区获得性细菌性脑膜炎诊断与治疗专家共识”，确诊病例、临床诊断病例、疑似诊断病例均纳入本次研究；排除标准：（1）资料不完整且达不到疑似病例的诊断标准；（2）院内获得如颅脑占位、手术、外伤后细菌性脑膜炎；（3）实验室确诊非细菌性脑膜炎，包括病毒性脑炎、真菌性脑炎、结核性脑炎、支原体、立克次体和寄生虫颅内感染等；（4）免疫性脑炎、无菌性脑炎（川崎病、Still病等）、遗传代谢性脑损伤。

本研究获得复旦大学附属儿科医院伦理委员会批准［（2021）395］，豁免患儿知情同意。

宏基因组二代测序报告、标本类型、送检保存要求、标本运输、内容解释及微生物致病概率分级

送检mNGS宏基因组二代测序报告情况、标本类型、送检保存要求、标本运输要求、测序情况、内容解释、微生物致病概率分级及解读宏基因组二代测序(mNGS) 是基于核酸检测的微生物鉴定技术其非预设性、高通量等优点而得到广泛应用。

下呼吸道感染主要包括社区获得性肺炎、医院获得性肺炎、免疫抑制宿主肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管扩张症合并感染等类型，临床表现多样，感染微生物种类复杂，感染和定植鉴别困难，加之mNGS 技术本身存在的局限性，mNGS 诊断效力的发挥有赖于选择恰当患者、采用适宜标本以及进行合理解读。

需送检mNGS情况(1) 免疫抑制宿主疑似发生LRTI 且临床表现提示非CAP 常见病原微生物所致者；(2) LRTI 患者发病初期即出现需要使用血管活性药物的感染性休克、需要有创机械通气的呼吸衰竭、多脏器功能不全等危及生命的状况时；LRTI 经规范经验性抗感染治疗48—72 h 后，感染症状仍持续加重或影像学快速进展者；(3) 聚集性发病疑似具有传染性、但无法明确病原体的LRTI；有特殊病史且经验性治疗无效，病情较为严重的LRTI；临床考虑特殊病原体(感染且病势迅疾或迁延者，常规培养困难或所在医疗机构无法提供可靠的传统检测方案时；(4) 患者有LRTI 症状或影像表现，经规范抗感染治疗后病灶吸收延迟、病程迁延，需鉴别是否由非感染性疾病所致，可以在常规病原微生物检测、感染生物标志物、病理等相关检查同时送检mNGS 以帮助鉴别诊断。

不建议送检 mNGS情况(1) 免疫功能健全宿主罹患LRTI（包括重症肺炎)，经过规范的经验性抗感染治疗病情已好转；(2) LRTI 已通过其他方法获得病原学结果，与临床特点相符，或针对性治疗有效；(3) 无法获取优质标本。

mNGS 标本类型在LRTI 的病原微生物诊断中，可用于mNGS 检测的标本包括痰(含诱导痰)、气管吸引物、支气管肺泡灌洗液（BALF）、经支气管肺活检（TBLB）标本、经支气管内超声（EBUS）活检标本、经皮肺穿刺活检标本、血液等。

宏基因组第二代测序技术监测病原体序列数指导肺孢子菌肺炎治疗一例

·病例报告·宏基因组第二代测序技术监测病原体序列数指导肺孢子菌肺炎治疗一例严家丽　景玉婷　蔡俊翔　张伟铮　许银姬【摘要】　肺孢子菌肺炎是由肺孢子菌引起的肺部感染性疾病，多见于免疫功能低下者。

针对非人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）感染的肺孢子菌肺炎一线治疗药物以磺胺甲口恶唑为主，推荐疗程２～３周，免疫功能低下的重症患者可适当延长疗程。

目前，对于用药疗程的把握，仍依靠临床医师的经验，缺乏直接动态的监测工具。

现报道１例以第二代测序（ＮＧＳ）技术动态监测病原体序列数，指导非ＨＩＶ感染的肺孢子菌肺炎抗真菌治疗疗程的病例，以供临床重症复杂病例借鉴。

【关键词】　二代测序；肺孢子菌肺炎；病原体序列数；治疗疗程【引用本文】　严家丽，景玉婷，蔡俊翔，等．宏基因组第二代测序技术监测病原体序列数指导肺孢子菌肺炎治疗一例［Ｊ］．上海医学，２０２１，４４（５）：３４８３５０．ＤＯＩ：１０．１９８４２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ．０２５３９９３４．２０２１．０５．０１３基金项目：国家自然科学基金（８１８３０１１４）作者单位：５１００００　广东广州，广州中医药大学附属第二临床医学院（严家丽）；广东省中医院呼吸与危重症医学科（景玉婷、蔡俊翔、许银姬），检验科（张伟铮）通信作者：许银姬，电子邮箱为ｘｕｙｉｎｊｉ＠ｇｚｕｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ１　临床资料　患者男，５９岁，因“血糖升高２１年余，四肢末端麻木８年，下肢水肿１周”于２０１８年６月２６日收入广东省中医院内分泌科。

既往有非霍奇金淋巴瘤（经典型套细胞淋巴瘤，Ⅳ期）病史，２０１８年２月３日—５月２１日接受６个疗程ＲＣＨＯＰ方案（利妥昔单抗＋多柔比星＋长春新碱＋环磷酰胺＋泼尼松）化学治疗（简称化疗）；既往胃镜检查提示霉菌性食管炎。

入院前１周患者即有气促，入院后气促症状明显加重，伴发热；体温达３８．１℃；伴咳嗽、咳痰，无创呼吸机辅助通气下经皮动脉血氧饱和度（ＳｐＯ２）为８６％～９３％。

From 16S rDNA测序 To 宏基因组学研究—技术发展及异同点

From 16S rDNA测序To 宏基因组学研究—技术发展及异同点展开全文主要内容：1.16S rDNA测序2.宏基因组测序3.宏基因组的由来及发展过程4.16S rDNA测序与宏基因组的优势和局限性5.16s rDNA测序与宏基因组技术差异—————————————————————1. 16S rDNA测序1.1什么是16S rDNA测序16S rDNA测序技术：目前，主要指基于高通量测序技术，完成16S rDNA部分或全部基因序列，用于解释样本中或样本组间物种分布、丰度、差异、进化等关系。

同时，还可以利用真菌18S、ITS和功能基因（Gene Family）完成类似的研究。

1.2为什么选择16S rRNA基因①16S rRNA基因的序列有10个保守区和9个高变区（V1-V9：长度分布范围约30~100bp）之分。

②保守区为所有细菌共有，细菌间无差别，能反映生物物种的亲缘关系，可变区具有属或种的特异性，序列则随菌间的亲缘关系不同而有一定的差异，所以能揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标。

③根据保守区设计引物位点，扩增可变区获得的序列可以用于菌种鉴定。

一种快速、廉价的菌种鉴定方法。

④16S rRNA基因测序随后被发现能够将细菌分类到新种，甚至新属中。

⑤用来描述从未被成功培养的新物种。

说明：16S rDNA=16S rRNA Gene2.宏基因组测序2.1 什么是宏基因组测序宏基因组测序：目前，是指基于高通量测序技术，研究收集到的来源于特定条件下环境样品的所有遗传物质。

2.2宏基因组与16S rDNA测序之间的“相爱相杀”从宏基因组的严格定义来说，宏基因组的概念是不包含仅分析现有环境样品中部分基因（例如：16S rRNA）的研究，因为针对部分基因的研究并没有提供环境中所有遗传物质潜在的信息。

然而，针对这些部分基因群落谱系研究又经常和这种严格定义的“真实”宏基因研究形成互补2.3 “广义” 和“狭义” 宏基因组广义宏基因组：是指特定环境下所有生物遗传物质的总和，它决定了生物群体的生命现象。

华大测序仪原理

华大测序仪原理华大测序仪是基于第二代测序技术的高通量测序仪器之一，主要应用于基因组学、转录组学、表观基因组学、元基因组学等领域。

华大测序仪的原理就是通过对DNA或RNA分子进行扩增，并将其分解为碎片，然后在微孔板中单独定位，再通过高通量并行测序，最终完成对DNA或RNA序列的分析及鉴定。

1. DNA/RNA的扩增人体细胞内DNA或RNA分子随处可见，但它们的数量都非常有限，无法直接进行测序分析。

首先需要通过PCR或RT-PCR技术进行扩增，得到数量足够、且质量优良的模板分子，以保证后续的测序分析。

2. 碎片化扩增得到的DNA/RNA分子大小一般较大，不利于高通量的并行测序。

需要将其分解为较小的碎片，一般长度在100-500bp左右。

目前，碎片化的主要方法有两种：一种是通过超声波或宏观力作用（如剪切、机械剪断等）制备；另一种则是通过内切酶的加入，在选择性的酶切条件下将其分解为更加均匀的碎片。

3. Adaptor连接碎片化后的DNA/RNA分子不能直接用于测序分析，需先加入adaptor。

adaptor是由两个常规序列和一根特殊的链接序列组成，可以将DNA/RNA分子固定在微孔板的定位孔中。

Adaptor是测序中非常关键的一个步骤，因为它决定了测序过程中PCR引物的结合及范围。

4. 美国Oxford Nanopore等公司推出的第三代测序技术则采用了与第二代不同的原理，其基本思路是在纳米管道中测序，通过电信号检测碱基即可完成测序分析。

5. 聚合物酶扩增adaptor连接完成后，测序板上的每一个孔位都有了一个DNA/RNA分子，并且这些分子都是有序排列的。

而聚合物酶扩增则是将PCR反应体系引入到微孔板中，通过引物扩增模板分子，将其扩增至足够的数量。

该过程采用局部扩增的方法，即在每个孔位内单独进行反应，使得每个孔位内扩增得到的DNA/RNA分子数量大致相同，并且扩增过程也不会互相干扰。

6. 并行测序聚合物酶扩增完成后，每个孔位内都有成千上万个DNA/RNA分子，这些分子内的序列相同，但在适当的PCR条件下，它们会产生微小的变异，因此会产生很多亚型。

宏基因组的二代测序技术在初治失败社区获得性肺炎患者病原菌检测中的应用价值

临床肺科杂志2021年8月第26卷第8期
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例初治失败CAP患者送检的mNGS的检测结果进行分析，了解初治失败CAP患者的病原菌分布情况,并与传统病原菌检测方法相比较,以期为临床抗感染治疗提供指导。
资料与方法
研究对象 2019年5月1日至2020年12月31日安徽医科大学第四附属医院呼吸与危重症医学科收治的 87例初治失败CAP患者。病例纳入标准：1）符合社区获得性肺炎的诊断标准;2）抗生素治疗至少72 小时后，体温持续＞38 T和（或）临床症状（不适、咳嗽、咳痰、呼吸困难）仍存在［2］ &具体标准如下:发
结果
一、87例初治失败CAP患者病原体阳性结果分布情况
1 75例非重症CAP患者病原体分布情况75 例患者共分离到31种微生物，总株数为80, mNGS 共检出80株,传统方法检出6株，其中传统方法检测阳性患者使用mNGS方法均检出同一种病原菌。在分离到的31种微生物中，细菌（32/80）感染最常见，细菌感染中最常见的为副流感嗜血杆菌（6/ 32），其次为肺炎链球菌（5/32）、肺炎克雷伯菌（4/ 32）、流感嗜血杆菌（3/32）。其次为结核分支杆菌感染（20/80）,再次为真菌（11/80）及病毒（11/80）, 真菌感染中白色念珠菌最常见（5/11），病毒感染中巨细胞病毒最常见（5/11 ）。非典型病原体3株（鹦鹉热衣原体1株，肺炎支原体1株，嗜肺军团菌1 株），非结核分支杆菌2株（1株为鸟型分支杆菌复合群,1株为脓肿分支杆菌）（见表2 ）。
无 31( 35.63) 75(86.21) 68(78.16) 40(45.98) 36(41.38) 29( 33.33) 18(20.69)
二、标本留取
所有患者于入院后常规留取痰液进行细菌培养、真菌培养、抗酸染色、涂片检查,并完善G实验、 GM实验、肺炎支原体抗体、呼吸道8种病毒、巨细胞病毒、EB病毒等检查。所有患者在初治失败后行支气管镜检查，并进行肺泡灌洗术，同时留取2份支气管肺泡灌洗液（BALF），一份送本院检验科进行传统病原学检查（细菌培养、真菌培养、涂片、抗酸染色、GM实验），另一份外送华大基因公司进行病原菌高通量测序检测。所有患者均签署针对mNGS 高额费用知情同意书。mNGS标本的采集、保存和运输严格按照公司标准化规范执行。