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宏基因组测序技术

检测方法

宏基因组测序技术检测标准

简介：

宏基因组测序介绍

宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，经过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就能够直接对环境中所有微生物进行测序。能够真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。当前又能够分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。

一、16s DNA/18s DNA/ITS测序

16sDNA是最常见的微生物物种分子鉴定的标签，，经过对样品中16sDNA测序能够鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。当前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，能够很好的避免此类问题。

二、宏基因组全测序

在这种测序方式中，我们能够假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就能够研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。能够发现新的基因，能够进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。另外，该项测序不单能够针对DNA水平，也能够针对全RNA进行基因表示水平的研究。

样品处理：

宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。

核酸提取：

宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = 1.8-2.0， 260/230 = 1.8-2.0，电泳检测DNA应是完整的一条带。

测序Sequencing

1)16S/18S测序：

Sanger测序：

用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先经过PCR将16S/18S序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导

入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130或ABI 3730进行毛细管电泳测序。

由于其测序准确率比较高，而通量非常低，现一般见做二代测序结果的验证。

454 Platform：

454平台主要包括两种测序系统：454 GS FLX+ System和454 GS Junior System。454 GS FLX+ System测序读长能够达到600-1000bp，通量450-700M，GS Junior System测序读长在400bp左右，通量在35M。

文库构建：

用fusion Primer扩增核糖体RNA，将已扩增的rRNA直接做乳液PCR，在GS FLX+ 和GS Junior系统上进行测序。

测序深度：

数据分析：

使用免费的软件包对微生物的种群多样性进行鉴定，并进行比较。

1.MEGAN：一个宏基因组分析工具，能够在大量的测序数据中对

测序结果进行聚类分析。

2.MG-RAST：用于注释宏基因组样品的全自动软件。

3.IMG/M：基于宏基因组序列微生物群体的功能性。

4.CAMERA：致力于微生物生态学研究。

5.CARMA：能够经过未拼接的序列来进行物种组成和微生物的遗

传潜力的研究。

6.GALAXY：用于高等真核生物的研究，例如昆虫等。

7.Greengenes：16S rRNA的数据库，能够用来做16S rRNA的比

对。

8.QIIME：针对454测序数据的宏基因组分析。

9.The Ribosome Database Project（RDP）：针对焦磷酸测序的

分析方法。

Miseq Platform：

Miseq平台读长能够是2X250bp或2X300bp。使用Miseq Reagent Kit V2能够产出7.5-8.5Gb的数据，使用Miseq Reagent Kit V3能够产出13.2-15Gb的数据。