宏基因组测序技术检测方法模板
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测方法首先，宏基因组测序技术的样品采集非常重要，需要选择适当的采样策略和方法。
采样点的选择应考虑生态系统的多样性和复杂性，同时要确保采样点的代表性和一致性，以便更准确的反映生态系统的特征。
其次，样品处理是宏基因组测序技术中的关键步骤之一、样品处理的目的是去除样品中的非目标DNA，并增加细菌和古菌的DNA含量。
常用的样品处理方法包括滤网富集、密度梯度离心和聚合酶链反应（PCR）等。
在DNA提取过程中，需要先将样品中的DNA分离出来。
DNA提取的方法有许多种，可以选择适合的方法根据不同的样品类型和目标物种。
常用的DNA提取方法包括酚-氯仿提取法、商用DNA提取试剂盒等。
在DNA提取后，需要进行文库构建。
文库构建是将DNA片段添加接头序列，并通过PCR放大，生成可以进行测序的文库。
文库构建的方法有多种，常用的包括文库制备试剂盒和自制接头序列等。
完成文库构建后，接下来是测序步骤。
目前宏基因组测序常用的技术是高通量测序技术，常见的有Illumina MiSeq、Illumina HiSeq和PacBio等。
不同的测序技术具有不同的优缺点，可以根据实验需求选择合适的测序技术。
最后是数据分析。
宏基因组测序获得的数据量庞大，需要进行有效的数据分析来获取有价值的信息。
数据分析可以包括序列质控、序列拼接、OTU聚类、物种注释、功能预测等。
数据分析的方法有多种，可以使用开源软件如QIIME和Mothur等，也可以使用商业软件如RDP和MetaPhlan 等。
总体而言，宏基因组测序技术的检测方法包括样品采集、样品处理、DNA提取、文库构建、测序和数据分析等步骤。
这些步骤需要结合具体的实验目的和实验条件来选择和调整，以保证获得准确、可靠和有意义的结果。
宏基因组测序技术的发展将为生物学、生态学和环境研究等领域提供更深入和全面的研究手段，推动相关领域的快速发展。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
最新：宏基因组二代测序技术在血液病患者感染病原诊断中的应用中国专家共识
最新：宏基因组二代测序技术在血液病患者感染病原诊断中的应用中国专家共识01.血液病患者感染临床送检mNGS适应证注,特殊样本包括组织.竹的、穿刺液.支气管肺泡液洗液等无菌来源或不易小夏获取的样本图1血液病患者病原宏基因组二代测序（mNGS）送检流程图1 .中性粒细胞缺乏（粒缺）伴发热【共识2］低危且无明显感染灶的患者，如经抗菌药物治疗≥7d未明显好转可考虑在送检血培养的同时送检外周血标本mNGS;高危患者初始经验性治疗72~96h无效时，推荐送检传统微生物学检测的同时送检血液mNGS o2 .血流感染(BSI)【共识3］疑似BS1患者，在留取血培养标本的同时留取血浆样本，于-80。
C暂存;如72h内血培养阴性且抗感染治疗无改善的患者，推荐将留存样本进行mNGS o疑似脓毒症的重症患者，建议送检血培养同时送检血mNGS o3 .下呼吸道感染【共识4］下呼吸道感染患者首选支气管肺泡灌洗液(BA1F)送检传统微生物学检测，难以进行支气管肺泡灌洗的患者，可以选择深部痰进行检测，并同时留取标本冻存。
如抗感染治疗≥72h感染症状无好转或影像学表现持续加重的患者，建议送检留存标本行mNGS检测。
如为重症下呼吸道感染或有快速进展为重症的危险因素患者，建议同时送检传统微生物学检测及mNGS o鉴于血液病患者肺部感染病原谱广，部分病原难以培养或传统检测不能覆盖，且混合感染常见，推荐对于经验性抗感染治疗无效及重症下呼吸道感染患者在完善传统微生物学检测的同时，采用BA1FmNGS进行病原诊断。
血液mNGS对于下呼吸道感染病原诊断效果局限。
4 .中枢神经系统感染(CNSI)【共识5］疑似CNSI,推荐脑脊液在送检传统微生物学检测的同时送检mNGS,在流程上建议选择DNA检测，仅在考虑RNA病毒感染时完善RNA 检测流程。
CNS1时外周血与脑脊液病原分离现象(脑脊液存在感染病原，而外周血不能检出)并不少见。
因此，对于疑似CNS1患者，不推荐外周血作为替代样本进行mNGS检测。
病原宏基因组测序实验方案
病原宏基因组测序实验方案
病原宏基因组测序实验方案是一种用于研究病原微生物群落内基因组的技术方法。
它通过测序病原体样本中的DNA或RNA，生成大量的测序数据，并利用生物信息学分析方法来解析样本中存在的病原体群落。
该实验方案的实施步骤如下：
1. 样品采集与制备：首先，需要从疾病患者或环境中收集病原体样品。
样品可
以是血液、组织、粪便等。
接下来，需要对样品进行处理，包括提取DNA或RNA，并进行质量检测。
2. 文库构建：经过样品制备后，将提取得到的DNA或RNA进行文库构建。
这一步骤包括DNA片段化、连接测序引物、PCR扩增等。
构建好的文库将被用于下
一步的测序。
3. 测序：使用高通量测序技术，如Illumina测序平台，对构建好的文库进行测序。
该步骤将产生数百万条短读长序列，形成所谓的测序数据。
4. 数据分析：测序完成后，需要对产生的测序数据进行生物信息学分析。
这一
步骤包括序列拼接、质控、去除人类宿主序列、物种注释等。
通过这些分析方法，可以得到病原体群落的基因组组成和功能特征。
5. 结果解释和研究：最后，根据数据分析结果，可以解释病原体群落的组成和
特征。
这对于研究病原体的致病机制、药物抗性等具有重要意义。
病原宏基因组测序实验方案为研究者提供了一种全面了解病原体群落结构和功
能的方法。
它可以用于研究不同疾病的病原微生物组成，探究其与疾病发生发展的关系，并为疾病的预防、诊断和治疗提供重要依据。
同时，这一技术方法也有助于了解病原体的毒力机制、耐药性乃至新病原体的发现。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16sDNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法
空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法空气中的病原微生物是引起呼吸道感染等疾病的主要传播源之一。
传统的病原微生物检测方法需要分离纯化以后进行鉴定，耗时且存在一定的局限性。
而病原微生物宏基因组测序技术的发展为快速、准确地鉴定空气中的病原微生物提供了新的方法。
病原微生物宏基因组测序是通过对空气中微生物的DNA进行高通量测序，利用得到的DNA序列信息进行微生物的鉴定和分类。
该技术可以检测到空气中的各类微生物，包括细菌、真菌、病毒等，并能够对它们的种属、数量和功能进行分析。
病原微生物宏基因组测序鉴定方法的具体步骤如下：1. 样品采集：通过空气采样器将空气中的微生物收集到培养基或滤膜上。
采集的样品可根据需要选择特定的时间段和空间位置，如医院、实验室或公共场所。
2. DNA提取：对采集到的微生物样品进行DNA提取，将微生物DNA 纯化并浓缩，以便后续的测序分析。
常用的DNA提取方法包括化学法、机械法和磁珠法等。
3. 文库构建：将提取到的微生物DNA进行文库构建，即将DNA片段连接到测序适配体上。
文库构建的方法有多种，如PCR扩增、转座子测序等。
4. 高通量测序：将构建好的微生物DNA文库进行高通量测序，目前常用的测序技术包括Illumina测序、PacBio测序和IonTorrent测序等。
高通量测序可产生大量的DNA序列数据，用于后续的分析和比对。
5. 数据分析：通过对测序得到的DNA序列数据进行分析，包括序列比对、物种注释、功能注释等。
常用的分析工具有QIIME、mothur、MG-RAST等。
分析结果可以得到微生物的种属信息、相对丰度以及功能特征等。
病原微生物宏基因组测序鉴定方法的优势在于其高通量、快速、准确的特点。
相比传统的培养方法，宏基因组测序可以检测到更多种类的微生物，并能够对微生物的功能进行分析。
此外，宏基因组测序还可以检测到低浓度的微生物，具有更高的灵敏度。
病原微生物宏基因组测序鉴定方法在医学、生物安全等领域具有广泛的应用前景。
病毒宏基因组测序
40
Eukaryotic DNA viruses
No. of samples
30
20
10
0
Unclass. ABneeAtallloptovhriarqiGtduoaaermeqviumrueCUasviMtrinrocucaorlssqvatuisarseud.vseCinriurocsvoivruiBrBsaiedbgaueoUvminruocGslvaMyiUsrrusoan.ssvcPtilrroaNueslvsyasion.ruGmosveaimBrvuoiirsncidaivapierairdvaoevirus
病毒宏基因组测序又称宏病毒组（Virome），是在宏基因组学理论的基础上，结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科分支。宏
病毒组直接以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，能够快速准确的鉴定出环境中所有的病毒组成，在病毒发现、病毒溯源、微生物预警等研究方面具 测序策略与深度
分析内容
项目周期
病毒宏基因组测序
自然群体
DNA/cDNA总量≥3ug，浓度≥50ng/ul，无降解，无粘稠、无颜色异常，无RNA/蛋白质污染； 干冰寄送，使用无DNase管子存放，标记清晰。
（病毒富集、核酸提取和反转录、随机扩增可参考raw data
集数据库比对 基于reads的整合注释
多样本标准分析 丰度热图
主成分分析 聚类分析
显著性差异分析
35～75个自然日
案例解析
［案例一］ 针对炎症性肠病病毒基因组变化的研究[1]
本研究对剑桥、芝加哥、洛杉矶三个地区感染炎症性肠病（IBD）的人 群及其健康家属的粪便进行高通量测序，结果显示：在三组人群中有尾 目噬菌体和小噬菌体科物种相对丰度最高，并且两种病毒相对丰度呈负 相关趋势。比较剑桥地区IBD样本与对照，揭示了噬菌体丰度不成比例 主要与IBD有关，并初步验证肠病毒与IBD有关。
宏基因组测序的流程
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1. 样品采集和DNA提取。
从目标环境中采集样品，例如土壤、水或动物肠道。
宏基因组测序技术检测方法
简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = ， 260/230 = ，电泳检测DNA 应是完整的一条带。
宏基因组二代测序报告、标本类型、送检保存要求、标本运输、内容解释及微生物致病概率分级
送检mNGS宏基因组二代测序报告情况、标本类型、送检保存要求、标本运输要求、测序情况、内容解释、微生物致病概率分级及解读宏基因组二代测序(mNGS) 是基于核酸检测的微生物鉴定技术其非预设性、高通量等优点而得到广泛应用。
下呼吸道感染主要包括社区获得性肺炎、医院获得性肺炎、免疫抑制宿主肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管扩张症合并感染等类型，临床表现多样，感染微生物种类复杂，感染和定植鉴别困难，加之mNGS 技术本身存在的局限性，mNGS 诊断效力的发挥有赖于选择恰当患者、采用适宜标本以及进行合理解读。
需送检mNGS情况(1) 免疫抑制宿主疑似发生LRTI 且临床表现提示非CAP 常见病原微生物所致者；(2) LRTI 患者发病初期即出现需要使用血管活性药物的感染性休克、需要有创机械通气的呼吸衰竭、多脏器功能不全等危及生命的状况时；LRTI 经规范经验性抗感染治疗48—72 h 后，感染症状仍持续加重或影像学快速进展者；(3) 聚集性发病疑似具有传染性、但无法明确病原体的LRTI；有特殊病史且经验性治疗无效，病情较为严重的LRTI；临床考虑特殊病原体(感染且病势迅疾或迁延者，常规培养困难或所在医疗机构无法提供可靠的传统检测方案时；(4) 患者有LRTI 症状或影像表现，经规范抗感染治疗后病灶吸收延迟、病程迁延，需鉴别是否由非感染性疾病所致，可以在常规病原微生物检测、感染生物标志物、病理等相关检查同时送检mNGS 以帮助鉴别诊断。
不建议送检 mNGS情况(1) 免疫功能健全宿主罹患LRTI（包括重症肺炎)，经过规范的经验性抗感染治疗病情已好转；(2) LRTI 已通过其他方法获得病原学结果，与临床特点相符，或针对性治疗有效；(3) 无法获取优质标本。
mNGS 标本类型在LRTI 的病原微生物诊断中，可用于mNGS 检测的标本包括痰(含诱导痰)、气管吸引物、支气管肺泡灌洗液（BALF）、经支气管肺活检（TBLB）标本、经支气管内超声（EBUS）活检标本、经皮肺穿刺活检标本、血液等。
高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识ppt课件
鼓励微生物学、遗传学、临床医学等相关领域的专家加强跨学科合作， 共同推动高通量宏基因组测序技术在病原微生物检测中的临床应用和研 究进展。
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样本质量
01
样本采集和处理环节对测序结果至关重要，需要严格
控制样本质量，避免污染和误差。
数据分析
02 高通量测序产生的数据量庞大，需要建立完善的数据
分析流程和标准，确保结果的准确性和可靠性。
技术更新
03
随着测序技术的不断发展和进步，需要保持对新技术
的关注和应用，不断提高检测水平和效率。
06 总结和展望
02 高通量宏基因组测序技术 在实验室的应用
样本收集和处理
样本选择
选择适当的临床样本，如血液、 尿液、呼吸道分泌物等，根据患 者的症状和疑似病原体进行针对
性收集。
样本处理
对收集到的样本进行适当的处理 ，如离心、过滤等，以去除杂质
和富集病原微生物。
核酸提取
采用合适的核酸提取方法，如磁 珠法、柱层析法等，提取样本中
未来高通量宏基因组测序技术在病原微生物检测中的潜力 和前景
技术迭代升级
随着技术的不断发展，未来高通量宏基 因组测序技术的检测精度、效率和成本 等方面将持续优化，为病原微生物检测 提供更加可靠的技术支持。
VS
多组学联合分析
宏基因组测序技术可以与其他组学技术（ 如代谢组学、蛋白质组学等）进行联合分 析，深入挖掘病原微生物与宿主之间的相 互作用机制，为临床诊断和治疗提供更加 全面的信息。
05 案例分析和经验教训
案例介绍
案例背景
01
介绍某疫情的情况，包括疫情规模、影响范围、病原微生物特
环境微生物宏基因组检测 高通量测序法-编制说明
国家标准《环境微生物宏基因组检测高通量测序法》编制说明（一）工作简况1、任务来源随着高通量测序技术的快速发展，对环境微生物的研究已经摆脱了对于微生物培养技术的依赖，进入了大数据，高通量的领域。
随着人们对环境微生物认识的不断加深，在环境监测、治理，工、农业生产及健康评估、疾病诊断等领域，微生物的重要性正在不断凸显。
而环境微生物的检测，即对环境中微生物的种类与丰度进行定性、定量，则是所有科学研究与实践应用的基础，直接关系着科研结果的可信度与生产应用的可靠性。
尽管基于高通量测序的环境微生物检测如此重要，但目前国内却始终没有相对应的标准出台。
复杂的环境微生物群落，不规范的检测方法，极易造成数据的混乱及结论、结果的矛盾，严重影响了这一先进技术在各领域的推广和应用。
在此背景下，本标准开始酝酿萌芽。
本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC 387）提出并归口。
根据国标委综合〔2018〕83号文件《国家标准化管理委员会关于下达2018年第四批推荐性国家标准计划的通知》，正式确认立项，本项目计划编号为20184468-T-469 ，名称为环境微生物宏基因组检测高通量测序法，计划在2020年完成。
本标准负责起草单位：深圳华大生命科学研究院。
本标准参加起草单位：深圳华大基因科技有限公司、深圳基因产学研资联盟、中国测试技术研究院、深圳华大临床检验中心。
本标准主要起草人：陈冰、肖亮、钟焕姿、贾慧珏、李俊桦、姜华艳、李倩一、吴昊、李陶莎、唐美芳、钟宏彬、周媛。
2、目的和意义本标准从样品采集，保存与运输，实验室处理到数据产出等方面给出了较为明确的要求，规定了基于高通量测序技术检测微生物的方法，适用于使用高通量测序技术，利用宏基因组学方法进行环境微生物检测和鉴定分析的机构。
这一标准的建立和普及能够使得基于高通量测序的环境微生物检测技术流程做到规范化、统一化，进而在样本的可靠度和产出数据的通用性方面有显著的提升。
同时，这一标准的推广和实施，能够使得高通量测序技术的应用领域得到极大拓展，让环境、农业、健康等涉及微生物检测的各个行业有更统一和顺畅的评估、交流语境，并有力的推动这些行业的发展，从病原菌的检测，环境检测到疾病的诊断、分型，甚至是疾病状态的预测和干预，本检测技术都能发挥巨大的作用，为全民健康及工农业技术进步提供有力的保障和支持，促进科研及相关领域经济的发展。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序（metagenomics sequencing）是一种用于研究微生物群落组成和功能的技术。
它通过对环境样本中的DNA进行高通量测序，可以获取到微生物群落的整个基因组信息，包括群落中各种微生物的组成、丰度以及功能特征。
首先是样品采集。
宏基因组测序可以应用于各种环境样品，包括土壤、水体、肠道、皮肤等。
样品采集时需要注意避免污染，并选择适当的采集方法和样品保存条件，以确保得到代表性的样品。
其次是DNA提取。
由于微生物在环境中通常以微量存在，所以需要进行DNA提取以获取足够的DNA样本。
提取方法通常使用商业化的DNA提取试剂盒，其原理大致相同：首先破解细胞壁和细胞膜，释放DNA，并经过一系列的沉淀和洗涤步骤，最终得到纯化的DNA。
然后是测序。
宏基因组测序技术常用的测序平台包括Illumina HiSeq，PacBio SMRT和Oxford Nanopore等。
其中Illumina HiSeq平台是目前最为广泛应用的测序平台。
测序时将建好的文库片段与测序芯片上的测序引物配对，通过不同的测序方法（如合成DNA链延伸和荧光信号检测等）获取DNA片段的序列信息。
最后是数据分析。
宏基因组测序所得到的海量数据需要进行生物信息学分析，以解读数据中的信息。
数据分析包括序列质量控制、去除主机DNA、去除低质量序列、进行序列拼接和比对、物种分类和功能注释等。
其中物种分类可以使用16S或18SrRNA基因序列进行，功能注释可以使用基因数据库进行。
通过这些分析，可以获取样品中各种微生物的组成和丰度，并了解其功能特征。
总结来说，宏基因组测序技术的检测方法包括样品采集、DNA提取、建库、测序和数据分析等几个重要步骤。
这些步骤通常需要借助一系列的实验方法和设备来完成。
宏基因组测序技术的快速发展，为我们深入了解微生物群落提供了有力的工具，也为环境保护、农业生产、医学研究等领域提供了更加准确、细致的数据支持。
宏基因组纳米孔测序在病原体检测中的方法学研究演示稿件
详细描述：通过纳米孔测序技术对某病原体进行检测，能够快速准确地检测出病原体的基因组序列，为后续的诊断和治疗提 供有力支持。
案例二
总结词
灵敏度高、特异性好
详细描述
将纳米孔测序技术与传统的病原体检方法进行比较，结果显示纳米孔测序技术在灵敏度和特异性方面 均优于传统方法，能够更早地发现病原体，提高诊断的准确性。
研究意义
推动病原体检测技术的进步
通过对宏基因组纳米孔测序在病原体检测中的方法学研究，有助于改进和完善现有的检 测技术，提高检测的灵敏度和特异性，为防控传染病提供更有效的技术支持。
保障公共卫生安全
准确的病原体检测有助于及时发现和控制疾病的传播，保护公众的健康和安全，维护社 会稳定和经济发展。
促进跨学科交流与合作
04
宏基因组纳米孔测序在病原 体检测中的应用
病原体检测方法比较
传统培养法
依赖于病原体的生长和分离，耗时长，灵敏度 低。
分子生物学方法
如PCR、基因芯片等，灵敏度高，但需已知病 原体特异性序列。
宏基因组测序
无需预先知道病原体信息，可检测未知病原体，提供全面的微生物群落信息。
纳米孔测序在病原体检测中的优势
该研究涉及生物学、医学、生物信息学等多个学科领域，有助于促进不同学科之间的交 流与合作，推动相关领域的发展。
02
纳米孔测序技术概述
纳米孔测序技术原理
纳米孔测序技术基于电泳原理，通过测量DNA分子通过纳米孔时的电信号变化来 识别DNA序列。
当DNA分子通过纳米孔时，会引起孔内电场的变化，这种变化与DNA分子序列 相关，通过检测电场变化可以读出DNA序列。
案例三：纳米孔测序技术在其他领域的应用
总结词：应用广泛
宏基因组测序及分析
研究思路
瘘管奶牛牛
将柳枝稷样品置于牛牛的瘤胃中培 养72小小时，然后对附着在柳枝稷 样品上的所有微生生物进行行基因组 分析。
Illumina GAIIx ＋Illumina HiSeq2000 测序建库：200,300,3k,5k 双端测序：2*125、2*200、2*75
15
研究结果
总共识别了27,755 与碳水水化合水水物绑定模块或具有催化功能的候选基因
物种组成16s18sits10代谢通路分析物信息分析三基因功能分析11cog注释cazyme注释物信息分析三基因功能分析12物信息分析四个性化分析基于筛选因对样品进聚类分析13什么是宏基因组研究宏基因组研究的分析流程宏基因组研究的相关应用14研究案例science
迪康金金诺NGS应用用交流会
宏基因组研究在肠道微生生物中的最新研究应用用
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研究案例（三）
Gut：运动可能增加肠道菌群多样性 背景：研究表明，肠道菌群多样 性的减少与肥胖及其他健康问题 相关，而而肠道菌群多样性的增加 则有利于新陈代谢和免疫。
运动可能对肠道菌群的多样性产 生生有益影响。
Clarke, S.F., et al., Exercise and associated dietary extremes impact on gut microbial diversity. Gut, 2014.
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研究思路
平均身身体质量指数（BMI），用用于衡量体重指标，运动员组被试的平均身身体质 量指数（BMI）是29.1
样本收集：
40名专业橄榄球运动员；此外还有23名是正常BMI组（BMI≤25），23名 则属于高高BMI组（BMI≥28）46个样本作为对照组。(肠道样本和血血液样本)
完整版宏基因组测序讲解
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组（Metage nome）（也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome,或元基因组）。
是由Handelsman等1998年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature", 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学（或元基因组学，metagenomics）就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组DNA,进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组（Metage nome）（也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome,或元基因组）。
是由Handelsman等1998年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature", 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学（或元基因组学，metagenomics）就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组测序
宏基因组测序结题报告项目名称:XXXXXX客户单位:XXXXXX报告单位:XXXXXX报告日期:XXXXXX目录一、项目信息 (1)二、项目流程 (2)2.1 项目执行流程 (2)2.1.1 DNA提取及检测 (2)2.1.2 文库构建及质检 (2)2.1.3 Hiseq测序 (2)2.2 生物信息分析流程 (3)2.3 项目分析内容 (4)三、项目结果报告 (5)3.1 测序数据预处理 (5)3.1.1 测序数据过滤与拼接 (5)3.2 基因预测及丰度分析 (6)3.2.1 基因预测 (6)3.2.2 非冗余基因集的构建 (7)3.2.3 Core-pan基因分析 (8)3.2.4 基因数目差异分析 (9)3.3 物种注释分析 (11)3.3.1 物种注释 (11)3.3.2 物种相对丰度 (13)3.3.3 优势物种分析 (15)3.4 功能注释分析 (16)3.4.1 eggNOG功能注释 (16)3.4.2 KEGG注释 (17)3.4.3 基于CAZy数据库功能注释（高级分析） (19)3.4.4 基于ARDB数据库功能注释（高级分析） (21)3.5组间差异显著性分析 (23)3.5.1 PCA分析 (23)3.5.2 Anosim分析 (24)3.5.3 NMDS分析（高级分析） (25)3.5.4 PCoA分析 (26)3.5.5 Test (27)3.5.6 STAMP差异分析（高级分析） (29)3.5.7 LEfSe分析 (30)3.5.8 Random forest分析（高级分析） (31)3.6 环境因子关联分析 (33)3.6.1 RDA/CCA分析 (33)3.6.2 Cytoscape网络分析（高级分析） (34)四、参考文献 (35)一、项目信息二、项目流程2.1 项目执行流程2.1.1 DNA提取及检测基因组DNA提取采用公司自主研发的meta提取流程完成，其中微生物细胞破碎采用了玻璃珠研磨结合化学裂解及酶解等方法，最大程度的还原微生物的组成。
从16S rDNA测序到宏基因组【宏基因组数据的假设检验】
Fro m 16S rD N A测序To宏基因组学研究—宏基因组数据的假设检验CONTENTS主要内容1宏基因组数据假设检验介绍2宏基因组数据及假设检验分析1.宏基因组数据假设检验介绍随着人类微生物研究从技术发展和基础科学发现向转化医学和环境研究的转变，统计假设检验的应用将变得越来越重要。
假设检验：一种统计过程，用以确定所收集的数据是否提供了足够的证据来接受一个无效的假设。
统计学假设检验临床研究科学研究应用体系建立良好客观地判断来自多个组别的数据是来自同一分布还是不同分布。
多少样本才能达到特定效能水平支持组别的差异明确四个问题：1）生成数据的分布是什么？2）效应值（Effect size）有多大？3）什么样的检验统计量将被用来拒绝或不拒绝无效假设？4）需要怎样的统计学性能水平？P<0.05 80%检验功效；P<0.01 90%检验功效。
1.3P值、检验功效、效应值和样本量是相关的如果P值和检验功效保持不变，则较大（较小）的效应值会导致较小（较大）的样本量。
假设P值和效应值大小保持不变，增大（减小）样本量将增大（减小）研究的检验功效。
这说明了为什么在设计一个实验时必须指定这四个参数（P值、检验功效、效应值和样本量）。
2.宏基因组数据及假设检验分析数据结构展示SampleTaxaReads/Sample 12……K1X11X12……X1K X1* 2X21X22……X2K X2*………………………………N X N1X N2……X NK X N* Reads/Taxon X*1X*2……X*K数据的标准化或规范化问题：转换数据应该基于坚实的理论基础和特定的目的。
在不同分组中比较感兴趣的分类单元问题：不同组间推断某一分类单元特殊性。
重要的是分类单元不是研究人员通过查看数据得知哪些分类单元最不一样，而是应用检验来证明他们所观测到的不同是真实的。
当想要比较不同类群的物种丰富度时，将数据标准化到一个共同的尺度是很重要的。
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宏基因组测序技术
检测方法
宏基因组测序技术检测标准
简介：
宏基因组测序介绍
宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，经过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就能够直接对环境中所有微生物进行测序。
能够真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
当前又能够分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序
16sDNA是最常见的微生物物种分子鉴定的标签，，经过对样品中16sDNA测序能够鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
当前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，能够很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序
在这种测序方式中，我们能够假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就能够研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
能够发现新的基因，能够进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
另外，该项测序不单能够针对DNA水平，也能够针对全RNA进行基因表示水平的研究。
样品处理：
宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：
宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = 1.8-2.0， 260/230 = 1.8-2.0，电泳检测DNA应是完整的一条带。
测序Sequencing
1)16S/18S测序：
Sanger测序：
用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先经过PCR将16S/18S序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导
入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130或ABI 3730进行毛细管电泳测序。
由于其测序准确率比较高，而通量非常低，现一般见做二代测序结果的验证。
454 Platform：
454平台主要包括两种测序系统：454 GS FLX+ System和454 GS Junior System。
454 GS FLX+ System测序读长能够达到600-1000bp，通量450-700M，GS Junior System测序读长在400bp左右，通量在35M。
文库构建：
用fusion Primer扩增核糖体RNA，将已扩增的rRNA直接做乳液PCR，在GS FLX+ 和GS Junior系统上进行测序。
测序深度：
数据分析：
使用免费的软件包对微生物的种群多样性进行鉴定，并进行比较。
1.MEGAN：一个宏基因组分析工具，能够在大量的测序数据中对
测序结果进行聚类分析。
2.MG-RAST：用于注释宏基因组样品的全自动软件。
3.IMG/M：基于宏基因组序列微生物群体的功能性。
4.CAMERA：致力于微生物生态学研究。
5.CARMA：能够经过未拼接的序列来进行物种组成和微生物的遗
传潜力的研究。
6.GALAXY：用于高等真核生物的研究，例如昆虫等。
7.Greengenes：16S rRNA的数据库，能够用来做16S rRNA的比
对。
8.QIIME：针对454测序数据的宏基因组分析。
9.The Ribosome Database Project（RDP）：针对焦磷酸测序的
分析方法。
Miseq Platform：
Miseq平台读长能够是2X250bp或2X300bp。
使用Miseq Reagent Kit V2能够产出7.5-8.5Gb的数据，使用Miseq Reagent Kit V3能够产出13.2-15Gb的数据。