宏基因组功能基因筛选
完整版)宏基因组测序讲解
完整版)宏基因组测序讲解宏基因组测序的目的是研究藻类物种的分类、与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部、微生物与环境以及与宿主的关系。
宏基因组，也称为微生物环境基因组或元基因组，是由Handelsman等于1998年提出的新名词。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的微生物研究方法。
它通过功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系为研究目的。
一般XXX包括从环境样品中提取基因组DNA，进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组文库是一种重要的研究工具，可以利用转入大肠杆菌中的宏基因组DNA载体，使以前无法研究的不可培养微生物的DNA得到复制、表达，从而进行研究。
所有带有宏基因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。
对于宏基因组文库的DNA进行分析，有很多分析方法，主要分为表型功能筛选和序列基因型分析两类。
表型功能筛选是利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因，例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。
而序列基因型分析则是对文库中所有或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究，例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。
一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，并尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。
XXX是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的新的微生物研究方法。
它主要通过功能基因筛选和测序分析来研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。
在宏基因组学研究中，样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集是非常关键的步骤。
提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。
宏基因组学
广义的宏基因组：特定环境下所有生物遗传物质的总和 狭义的宏基因组：特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和
宏基因组测序（Metagenomics Next Generation Sequencing,mNGS)
NGS:也称高通量测序，是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。 mNGS:m指宏基因组。mNGS指宏基因组二代测序，以特定环境中整个微生物群落作为研究对象，利 用高通量测序平台进行基因组DNA测序，DNA不需要进行PCR扩增，测序结果具有较好的无偏性， 不仅可以提示微生物群落的物种组成，更能获需段序列分析不依赖 于任何已知序列信息进行筛选。其中以功能筛选法最为常用。
能够直接发现全新的活性物质和功能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子 缺陷：
工作量大,效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。
谢谢！请大家批评指正
其前端关键性技术是环境DNA(e DNA)的提取A的提取
直接提取法（原位提取法） 不经过样品中微生物的培养和分离，通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释 放，并对DNA进行纯化。 操作简便、省时、成本低，所获得DNA具有较好的完整性，并能够代表某一生境的微生物群落多样性。 但常会出现细胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题，所以一般需要进一步的 DNA纯化处理，同时所提取获得的DNA片段较用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来，再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物 细胞提取DNA。 该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较少，纯度较高、DNA完整性好(20kb~大、DNA得率较低，其产率只是直接裂解法的1%~10%,且获得的DNA往 往不能完全代表样品所在生境的生态学多样性。
宏基因组测序技术
宏基因组测序技术
宏基因组测序技术（MGST）是指对环境或生态系统样品中所有微生物的基因组进行混
合测序。
与传统微生物组学研究方法不同，该技术不需要分离和培养微生物，可以将整个
生态系统中全部微生物的基因组信息同时得到，包括细菌、真菌、古菌以及病毒等。
MGST可以广泛应用于环境、农业、医学、食品安全等领域的研究。
在环境领域，可以通过MGST研究不同环境系统的微生物多样性、生态功能和生态系统变化等。
在农业领域，该技术可用于评估土壤微生物群落结构和功能，为农业生产提供参考。
在医学领域，MGST
可用于研究人和动物体内微生物群落的变化、病原微生物的筛选及预防与治疗。
MGST的技术流程包括：
1. DNA提取：将样本中微生物的总DNA提取出来。
2.文库构建：基于高通量测序技术对DNA样本进行文库构建，其中包括搭建文库、分
离目标DNA片段、连接DNA适配体、PCR扩增等步骤。
3. 测序：对文库样品进行测序，可以使用Illumina、PacBio、Oxford Nanopore等
先进测序平台。
4. 数据处理与分析：通过对测序数据进行质量控制、序列拼接、聚类分析、物种注
释等处理与分析，得到微生物群落多样性和功能的分布情况。
随着技术的发展，MGST的应用范围将进一步扩大，为自然界和人类社会带来更多的福利。
(完整版)宏基因组测序讲解
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16sDNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16sDNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
宏基因组技术的原理及应用
宏基因组技术的原理及应用简介宏基因组技术（Metagenomics）是一种研究环境中各种微生物群落的遗传信息及功能性基因的技术。
它能够快速、高效地分析和描述海量的微生物基因组数据，为微生物研究提供了一种全新的方法。
原理宏基因组技术的核心原理是通过直接从环境样品中提取微生物的DNA或RNA，而不是通过培养分离的方式来研究微生物群落的遗传信息。
其主要的实验过程包括：样品采集、DNA/RNA提取、建立文库、高通量测序等。
样品采集宏基因组技术的第一步是采集环境样品。
样品的选择是非常重要的，因为不同的环境中会存在不同的微生物群落。
常见的样品包括土壤、水体、肠道等。
DNA/RNA提取样品采集完毕后，需要对样品进行DNA/RNA提取。
提取方法会根据样品的不同进行相应的调整。
DNA/RNA提取的质量和效果直接影响后续的实验结果。
建立文库提取到的DNA/RNA需要进行文库的构建。
文库是指将DNA/RNA样本转化为可供测序的DNA文库。
文库建立的方法也有多种，例如PCR扩增、文库构建试剂盒等。
高通量测序文库建立完成后，需要进行高通量测序。
高通量测序可以快速、平行、高效地测定众多微生物群落中的DNA/RNA序列信息。
常见的测序方法有Illumina HiSeq、Ion Torrent等。
应用宏基因组技术在各个领域都有广泛的应用，下面列举几个常见的应用。
生态学研究宏基因组技术可以帮助研究者深入了解生态系统中微生物群落的组成结构以及其功能。
通过对环境样品进行宏基因组测序，可以获得丰富的微生物遗传信息，进而揭示微生物在生态系统中的功能和相互作用。
疾病研究宏基因组技术在疾病研究方面也有着重要的应用。
通过对人体肠道微生物的宏基因组测序，可以揭示人体肠道微生物群落的组成与变化，进而探索某些疾病与微生物群落的关联。
发现新基因宏基因组技术也为发现新基因提供了新的途径。
通过宏基因组测序，可以获得大量未知序列，并通过对这些未知序列的分析和比对，发现新的功能性基因。
宏基因组测序讲解
或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组研究将使人们摆脱物种界限，揭示更高更复杂层次上的生命运动
在目前的基因结构功能认识和基因操作技术背景下，细菌宏基因组细菌多样性。如宏基因组
并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。一般
DNA 的提取、与载体连接和在宿主细胞建立中克隆[17]equence based screening)两种方法。
宏基因组学的研究步骤
一般包括从环境样品中提取基因组DNA，克隆DNA 到
蛋白等的试剂盒，在食品工业、NA构建
模式微生物并不能把所
DNA表达出来，降低了表型筛选的效率。宏基因组表型筛选的效率
从上万个克隆中一般只能筛选到几个有用的克隆。这表明宏基因组学的提
但受限于技术瓶颈，还未在实际工作中产生理论
DNA提取方法的改进[68]。
(细胞提取法)。直接裂解法是将
继而抽提纯化，包括物理法(如冻融法、
)和化学法、酶法等。不同直接裂解法的
此法操作容易、成本低、DNA提取率高、
但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小(1-50kb)，难以
DNA，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，
DNA。此法可获得大片段
4个步骤。特别要指出的是，在基
其研究目标通常是测定单一物种的基因组序列；而在宏基因
(community)的混合基因组序
这种差别的关键就பைடு நூலகம்，绝大多数细菌是不可培养的，因此没有足够的研究材
分离特定环境生物DNA
DNA的做法，而是首先直接收集能
然后利用各种理化方法破碎微生物，使
DNA，再利用密度梯度离心等方法进行分离纯化。
宏基因组测序及分析
宏基因组测序及分析宏基因组测序及分析是一种用于研究多种微生物群落中的所有基因的方法。
与传统的小基因组测序方法不同，宏基因组测序涉及到从环境样品中提取DNA并进行测序，以获得整个微生物群落的基因信息。
宏基因组测序的目的是了解不同微生物在特定环境中的功能、结构和相互关系，为我们进一步研究微生物的生态系统功能和微生物群落的组成提供重要的信息。
16SrRNA基因测序是一种广泛应用的技术，用于研究微生物群落的组成和结构。
16SrRNA基因是细菌和古菌中高度保守的基因，它具有多个高度保守的区域和变异的区域。
通过测序这些特征区域，我们可以识别细菌和古菌的分类和亲缘关系。
通过分析16SrRNA基因序列的方法，我们可以了解微生物群落的多样性和物种组成。
这种方法使我们能够在环境中准确鉴定微生物，并研究它们在不同环境中的生态功能。
元转录组测序是一种用于研究微生物群落在特定环境条件下的功能和活动的方法。
元转录组测序可以提供有关微生物在特定环境条件下活跃的基因和产生的蛋白质信息。
通过测序环境样品中的RNA转录产物，我们可以测定微生物在特定环境条件下的基因表达情况。
这种方法可以帮助我们了解微生物在不同环境中的功能和适应策略，以及它们如何参与环境过程和生态系统功能。
宏基因组测序及其分析可以应用于多个领域，包括环境微生物学、人类肠道微生物组学、食品安全和重要农作物的微生物组学等。
通过研究不同环境中微生物群落的组成和功能，我们可以了解微生物的生态学角色，并且可以应用这些知识来改善环境管理、人类健康和生态系统保护。
总之，宏基因组测序及分析是一种强大的工具，可以帮助我们揭示微生物群落的多样性、结构和功能。
这项技术在许多领域有着广泛的应用，为我们了解微生物的生态学角色和环境生态系统功能提供了重要的信息。
随着技术的不断发展和成熟，宏基因组测序及分析将在未来得到更加广泛的应用和重要性。
宏基因组测序技术检测方法
简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = ， 260/230 = ，电泳检测DNA 应是完整的一条带。
宏基因组功能基因筛选
通过设计特异的PCR引物，扩增得到ITS序列，然后两端加上接头，便可利 引物，扩增得到 序列， 通过设计特异的 引物 序列 然后两端加上接头， 的高通量测序技术对ITS进行测序分析，以获得环境样品中真菌 进行测序分析， 用Illumilla的高通量测序技术对 的高通量测序技术对 进行测序分析 等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。 等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。
载体
一般选用质粒、粘粒或者 载体来构建， 一般选用质粒、粘粒或者Fosmid 比较复杂的化合物，因其基因簇较大 对生物合成比较复杂的化合物， 断小于 则无法完整克隆。 ，则无法完整克隆。 细菌人工染色体（ 细菌人工染色体（BAC）载体能克隆 ）载体能克隆100 kb以上的大插入片断 以上的大插入片断 完全有可能克隆到完整的代谢基因簇途径， ，完全有可能克隆到完整的代谢基因簇途径，但是其拷贝数目 和表达量低。 和表达量低。因而可选库，达到其拷贝数量可以诱导控制的目的，在必要时可诱导 增加载体拷贝数以获得大量DNA进行亚克隆和序列分析。 进行亚克隆和序列分析。 增加载体拷贝数以获得大量 进行亚克隆和序列分析
功能驱动筛选
生物活性水平的筛选， 生物活性水平的筛选，即根据重组克隆产生的新活性进行 功能筛选。采用各种活性检测手段检测筛选分离阳性克隆子， 功能筛选。采用各种活性检测手段检测筛选分离阳性克隆子， 结合生化分析和插入片段序列分析，进而对其进行深入研究。 结合生化分析和插入片段序列分析，进而对其进行深入研究。 如可在各种选择性平板上通过可见性状筛选产生脂酶、 如可在各种选择性平板上通过可见性状筛选产生脂酶、淀 粉酶等活性克隆子。 粉酶等活性克隆子。本策略能够直接发现全新的活性物质和功 能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子， 能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子，但工作量大 ，效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。 效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。
宏基因组筛选的原理和流程
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宏基因组mags的挑选标准
宏基因组MAGs挑选标准宏基因组学中，宏基因组MAGs（Metagenome-Assembled Genomes）的挑选对于深入了解微生物群落的组成和功能至关重要。
为了确保所选MAGs的有效性和代表性，必须遵循一系列标准。
以下是挑选MAGs时需要关注的10个主要方面：1. 基因组完整性：基因组的完整性是评价MAGs质量的重要指标。
完整的基因组可以提供更全面的基因信息和进化背景，有助于准确反映微生物的生态和功能角色。
2. 基因组可培养性：理想的MAGs应具备可培养性，以便进行后续的实验验证和深入研究。
如果MAGs来源于难以培养的微生物，则可能影响实验的可重复性和解释性。
3. 功能多样性：MAGs应展现出丰富的代谢和生态功能多样性，以便更好地理解微生物群落在生态系统中的作用。
4. 生态适应性：选择那些在特定生态位中表现出高度适应性的MAGs，有助于深入了解该生态位中的生态和进化机制。
5. 进化代表性：选择具有广泛进化代表性的MAGs，有助于更好地理解微生物的进化历程和系统发育。
6. 样本独特性：确保所选MAGs在样品中具有独特性和代表性，以避免冗余或交叉污染。
7. 测序深度与覆盖度：足够的测序深度和覆盖度是保证MAGs质量的前提。
高覆盖度可以降低基因组的组装误差，提高基因注释的准确性。
8. 数据质量与可信度：对测序数据进行严格的质量控制，去除低质量的序列和噪音，以提高数据可信度和后续分析的准确性。
9. 基因可注释性：具有高可注释性的MAGs有助于深入了解其基因结构和功能，提高研究价值。
10. 生物信息学分析可行性：最后，所选MAGs应具有进行各种生物信息学分析的可行性，包括基因预测、注释、系统发育分析等。
这有助于充分利用这些数据，进行全面的生物学解读。
遵循这些标准将有助于挑选出高质量的宏基因组MAGs，为微生物生态学、进化生物学和系统生物学等领域的研究提供有力支持。
宏基因组功能基因筛选PPT文档共33页
41、实际上，我们想要的不是针对犯 罪的法 律，而 是针对 疯狂的 法律。 ——马 克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就 像影子 跟随着 身体一 样。— —贝卡 利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进 步。— —杰弗 逊 44、人类受制于法律，法律受制于情 理。— —托·富 勒
45、法律的制定是为了保证每一个人 自由发 挥自己 的才能 ，而不 是为了 源自缚他 的才能 。—— 罗伯斯 庇尔
46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
宏基因组功能基因筛选
SIGEX载体特点
一种操作子捕获 (operon trap) 载体 多拷贝，稳定性好 含有一个标记基因（如gfp），能够与受底物诱导的操作子 基因片段共表达 标记基因前有自身可诱导启动子，能够检测自连的载体； 标记基因前有RBS位点和起始密码子，避免形成融合蛋白
表达，利用“功能驱动筛选”，筛选得到相应的功能基因
高通量检测、筛选
功能基因、新型酶
Clone into vector
eg plasmid, cosmid phosmid, BAC
Introduce into host eg E. coli
Metagenomic library
sequence
Screen for specific sequences by PCR or hybridisation
—功能基因筛选（策略二）
Metagenomics involves constructing DNA libraries from environmental DNA
Environmental sample
Extract metagenomic DNA
Construct 16S (18S) rRNA gene library using PCR
异位裂解法：采用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来, 然后采 用较温和的方法抽提DNA, 如先采用尼可登介质密度梯度离心分离微 生物细胞, 然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解, 脉冲场凝胶电泳回收 DNA。 可获得大片段DNA (20～500 kb) 且纯度高, 但操作繁琐, 成本高, 有 些微生物在分离过程中可能丢失, 温和条件下一些细胞壁较厚的微生 物DNA难以抽提出来。
宏基因组测序
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组 ( Metagenome)(也称微生物环境基因组 Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学，metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组 ( Metagenome)(也称微生物环境基因组 Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学，metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
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细菌16S rRNA的V3或V6区的测序分析
Ashelford 等（2005）通过对4383个细菌16S rDNA的序列 进行比对分析，表明16S rDNA 全长序列中包含9个可变区 （V1-V9）和10个保守区。其中保守区反映生物物种间的亲 缘关系，可变区则表明物种间的差异。
Chakravorty 等（2007）总结16S rDNA 的序列，及其中 九个9个可变区和10个保守区的位置和长度，并指出不同的 可变区适合不同菌群的鉴定分析。其中V3（约60 bp）和V6 区（约70 bp）可以分别用来鉴定大多数细菌。
SIGEX
Functional screening for expression of particular phenotype
细菌16S rRNA的测序分析
16S rDNA指的是细菌基因组中编码核糖体16S rRNA 分子的对 应的DNA序列，也就是16S rRNA 的编码基因。其长度大约为 1500 bp 通过16S rDNA的测序，可以分析环境的群落构成，以及进行细 菌的分类和进化分析。
异位裂解法：采用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来, 然后采 用较温和的方法抽提DNA, 如先采用尼可登介质密度梯度离心分离微 生物细胞, 然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解, 脉冲场凝胶电泳回收 DNA。 可获得大片段DNA (20～500 kb) 且纯度高, 但操作繁琐, 成本高, 有 些微生物在分离过程中可能丢失, 温和条件下一些细胞壁较厚的微生 物DNA难以抽提出来。
，效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。
SIGEX
SIGEX（Substrate-induced gene-expression
screening），即底物诱导基因筛选，其基本原理 为：代谢相关基因通常由相应的化合物（如底物或 者代谢）与载体中的特定标签（如GFP）共表达的克隆子， 就能够筛选到相应的筛选
—功能基因筛选（策略二）
Metagenomics involves constructing DNA libraries from environmental DNA
Environmental sample
Extract metagenomic DNA
Construct 16S (18S) rRNA gene libratagenomic Library
通过PCR 或者杂 交筛选特定序列
SIGEX
通过功能筛选特 定表型的阳性克 隆
基于宏基因组分离筛选功能基因 的四个技术要素
环境样品DNA制备 DNA Preparation
自然产品筛选平台
载体 Vector
Natural Product Discovery Platform
Uchiyama et al.,Nature,2009
SIGEX载体特点
一种操作子捕获 (operon trap) 载体 多拷贝，稳定性好 含有一个标记基因（如gfp），能够与受底物诱导的操作子 基因片段共表达 标记基因前有自身可诱导启动子，能够检测自连的载体； 标记基因前有RBS位点和起始密码子，避免形成融合蛋白
宏基因组功能基因的筛选
WCX 2011年3月17日
目 录
宏基因组简介 宏基因组的常用研究方法
16S (
宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
宏基因组（Metagenome）
• Metagenome作为一个新名词最初由美国科学家 Handelsman 及其研究组于1998年提出，定义为 “the Genomes of the Total Microbiota Found in
功能驱动筛选
生物活性水平的筛选，即根据重组克隆产生的新活性进行
功能筛选。采用各种活性检测手段检测筛选分离阳性克隆子， 结合生化分析和插入片段序列分析，进而对其进行深入研究。 如可在各种选择性平板上通过可见性状筛选产生脂酶、淀 粉酶等活性克隆子。本策略能够直接发现全新的活性物质和功
能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子，但工作量大
ITS 1 和ITS 2 是中度保守区域, 其保守性基本上表现为种内相对一 致,种间差异比较明显。IT S 的序列分析能实质性地反映出属间、 种 间以及菌株间的碱基对差异,此外ITS 序列片段较小、 易于分析, 目 前已被广泛应用于这种特点使ITS 适合于真菌物种的分子鉴定以及属 内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。
Uchiyama et al.,Nature,2009
SIGEX筛选流程
Yun and Ryu，Microbial Cell Factories，2005
SIGEX的优点和缺点
优点
能够筛选到新的代谢相关基因 诱导底物不需要经过特殊修饰 避免了引入酶切位点的麻烦和切断目的基因的可能 结合流式细胞术，适于高通量克隆和筛选
缺点
不能筛选组成型表达的基因 仅针对能进入细胞质的底物 仅适用于插入片段带有自身启动子的情况 出发菌株须与宿主菌株近缘 T载体容量有限，>10kb的基因或操纵子难以克隆 与GFP反向插入的目的基因将漏检 目的基因与GFP之间有转录终止子的情况将漏检
Yun and Ryu，Microbial Cell Factories，2005
高通量克隆ORF ——The Gateway® system
Gateway技术原理 Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染 色体之间发生的λ嗜菌体位点特异重组系统的重组整合 与切出反应（attB x attP →attL x attR）BP和LR两个 反应构成的。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克 隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门 克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载 体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转 移目的序列到一个或更多个目的载体。
Nature”， 即指任何特定环境样品中全部微生物
遗传物质的总和, 并且目前主要是指环境样品中细 菌和真菌基因组的总和。
Metagenome
VS
Genome
目 录
宏基因组简介 宏基因组的常用研究方法
16S ( 宏基因组的测序
三种筛选方法的比较
目 录
宏基因组简介 宏基因组的常用研究方法
16S ( 宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
宏基因组测序
宏基因组DNA提取
Illumina 高通量测序
组学系统分析
高通量基因克隆
利用测序结果，经序列比对分析， PCR直接扩增、克隆相关功能基因
宿主Host
高通量筛选 High Throughput Screening
环境样品DNA制备
原位裂解法：将土壤样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理, 继而抽提纯 化。 此法操作容易、成本低、DNA提取率高、偏差小, 但由于强烈的 机械剪切作用, 所提取的DNA片段较小(1-50 kb)，且腐殖酸类物质也 难以完全去除。
Clone into vector
eg plasmid, cosmid phosmid, BAC
Introduce into host eg E. coli
Metagenomic library
sequence
Screen for specific sequences by PCR or hybridisatifosmid为载体，其功能筛选宿主局限于大肠杆菌，但大肠
杆菌并不是一个很理想的高效表达外源基因的宿主细重要。
序列驱动筛选
基于DNA序列水平的筛选。根据某些已知的相关功能基 因的保守序列或相似序列设计杂交探针或PCR引物，通过杂交 或PCR扩增筛选阳性克隆子。 此方法的优点是可能筛选获得某一类结构或功能的蛋白 质中的新分子，且能利用基因芯片技术大大提高筛选效率， 缺点是必须对相关基因序列有一定的预先了解，较难发现全 新的活性物质及其功能编码基因。表达，利用“源自能驱动筛选”，筛选得到相应的功能基因
高通量检测、筛选
功能基因、新型酶
载体
一般选比较复杂的化合物，因其基因簇较大 ，则无法完整克隆。 细菌人工染色体（BAC）载体能克隆100 kb以上的大插入片断 ，完全有可能克隆到完整的代谢基因簇途径，但是其拷贝数目 和表达量低。因而可选要时可诱导 增加载体拷贝数以获得大量DNA进行亚克隆和序列分析。
16S rDNA
通过设计特异的PCR引物，扩增得到V3或V6区的序列，然 后两端加上接头，便可利用Illumilla的高通量测序技术对V3或 V6区进行测序分析，以获得环境样品中细菌等物种分类、物 种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。
真菌ITS的高通量测序分析
ITS(Internal Transcribed Spacers )，即核糖体内转录间隔 区 ，是位于 28S rDNA的3’端与 18S rDNA的 5’端之间的序列 ITS常用于真菌的分类研究，其长度一般为650-750 bp ITS包含ITS1和ITS2两个区域。其中ITS1 位于 18S rDNA和 5.8S rDNA之间，ITS2位于 5.8S rDNA和 28S rDNA之间
The Gateway® system 克隆ORFeome
利用The Gateway® system 的高通量、快捷、方便等特点，可以克 隆得到生物体的ORFeome，即全部编码蛋白质的ORF组成
Brandner et al., BMC Genomics,2008
ORFeome的用途
得到生物体的ORFeome后，通过高通量诱导ORF
BP和BL反应
Matsuyama and Yoshida，2009
Gateway 技术优点
不需要传统的酶切、连接方法 利用位点特异性重组，省时省力,可以实现高通量克隆 利用了ccdB选择方法，以确保高效率的分离重组克隆, 典型的效率是>95% 在目的基因（或者开放阅读框(ORF)克隆进Gateway® 入 门载体后，可以很容易将它转移到任何目的载体， 创建各种各种各样的表达克隆