猪链球菌2型溶血素的化学修饰

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$%& 修饰的溶血素 &’&()*+, 图
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$%& 对溶血素活性的影响
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巯基、 二硫键的化学修饰
加入 $&&’()* 6JJ 后， 溶血素的溶血活性显著增强， 溶血价由处理前的 ,+ 增强为 ,+% （图 0） 。为确定是何种原因导致溶血素活性增强， 用 8KL" 处理 6JJ 作用过的溶血素， 其 溶血活性未有变化； 而用 /, M, 处理经 6JJ 作用过的溶血素， 其活力则恢复到未用 6JJ 处 理之前水平， 表明是因为二硫键的断裂引起空间构象的改变而导致溶血素活力的增强。 !". 精氨酸残基的化学修饰 用 % N +1%&&’()* 的 ,， 暗室 234 作用 +%5， 测定其相对 27丁二酮与溶血素在 ./++1%， 活力， 当 ,， 溶血素的活力仅为 +,1$（图 $） ， 表明精 27丁二酮浓度为 %1$ N +1%&&’()* 时， 氨酸残基是溶血素的活力必需基团。
［H］ 的方法并作改进， 将各种化学修饰剂配制成所需浓度， 在 &’( 下与 参照张树政等 JK 溶血素溶液 （& I $" *?GL#） 作用 $)， 分析残余溶血活性。用配制修饰剂的溶剂作对照。
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结果和分析
溶血素经化学修饰后的活性 （表 $） ，/0 10 、 M 种蛋白质修饰剂对溶血素进行修饰后的相对溶血活力差异较大 -234
猪链球菌 ! 型溶血素的化学修饰
方绍庆 陆承平"
（南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点实验室 南京 #2$$/:）
摘
要： 用 C33、 处 D# E# 、 C;FG、 ;CG、 .9HI、 .JK、 FGLJ、 #， "9C=6>-MN( 和 KH 等 / 种化学修饰剂，
研究其分子中氨基酸侧链基团与其溶血活性的关 理猪链球菌 # 型江苏分离株提纯的溶血素， 系。结果表明， 巯基、 氨基、 羧基和酪氨酸残基等与其溶血活性无关， 而色氨酸、 组氨酸和精氨 酸的化学修饰引起溶血活性的大幅度下降， 二硫键的化学修饰引起溶血活性的大幅度增强。 显示色氨酸、 组氨酸和精氨酸残基是该溶血素的活性必需基团， 二硫键的断裂可引起其活性 增强。 关键词： 猪链球菌，溶血素，化学修饰 中图分类号： O/"/P2 文献标识码： H 文章编号： 2$$%9%20/（#$$"）$"9$"/:9$:
（**?GL#） 4?,BF,@E;@+?,RL 0N" 0"N" $"N" $"N" &"N" $"N" $N" !N" !N饰 随着 -234 的浓度增加， 溶血素活力显著
下降， 当 -234 浓度为 0"**?GL# 时， 其相对活 力接近于零 （图 $） 。用 Q/’N" 的 $ *?GL# 羟胺 处理 0"**?GL# -234 作用过的溶血素， 使其分 子上的组氨酸恢复原状， 相对活力从 " 恢复到
修饰后， 溶血素活性几乎为 "； 溶血活力显著增强， 与对照相比， 活力提高近 -.. 作用后， 活力分别为 0!% 、 其它修饰剂的影响较小。 $0H 倍； 5=9、 0， &6丁二酮居中， $0N!% ，
表!
.;OGF $ >F;:F,@R 5=9 -234 34<= 2-4 5678 97 0， &6-+;BF@CG -.. /0 10 4?,@E?G
［%， 0］ 意义 。蛋白质的化学修饰是研究蛋白结构与功能的重要手段， 侧链基团化学修饰的一
个重要作用是探测活性部位的结构。试验是在纯化了猪链球菌 # 型江苏分离株溶血素的 基础上， 采用了二硫苏糖醇等 / 种化学修饰剂对其氨基酸侧链基团进行了化学修饰， 以期 确定其活性基团。
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材料和方法
溶血素的提取
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微 生 物 学 报 !"#$ %&"’()&(*(+&"$ ,&-&"$
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猪链球菌 # 型是猪的重要病原菌之一， 能产生多种毒力因子， 溶血素是其中重要的一
［2 Q "］ ［!］ 种， 几乎所有的强毒株均产生溶血素， 且其具有良好的免疫原性 。宋厚辉等 从基因 ［:］ 指出， 猪链球 水平证实， 国内分离株的猪溶血素基因与国外报道的高度同源。 *6>’RS 等
菌 # 型分离株的溶血素为巯基活化的溶血素， 但未阐明其活性基团。因此， 对猪链球菌 # 型溶血素进行化学修饰， 探明其活性中心， 对阐明病原菌的致病机理及疫苗设计具有重要
图!
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&’() 对溶血素活性的影响
2PPFB@ ?P -234 ?, );F*?GCR+, ;B@+S+@C
表明溶血素分子中组氨酸的残基为活力 !"% ， 必需基团。
2期
方绍庆等：猪链球菌 , 型溶血素的化学修饰
2O3
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色氨酸残基的化学修饰
采用不同浓度的 !"# 在 $% &&’()* 的醋酸盐缓冲液中与溶血素反应， 测定其相对活 力。随着 !"# 浓度的增加， 溶血素活力显著下降， 当 !"# 浓度为 + &&’()* 时， 溶血素活力 只有原活力的 ,$（图 ,） ， 并且随着 !"# 浓度的继续增加， 溶血素活力不再变化。 !"# 导 致活性的丧失， 是由于对色氨酸的修饰， 还是由于肽链的断链引起的， 需要进一步判断。 进而用 +%% 倍于溶血素量 （摩尔比） 的 !"# 在 $%&&’()* 醋酸盐缓冲液 （ ./ 01%） 中与溶血 素反应， 以不加 !"# 的溶血素液作对照， 作用于 ， 然后进行 电泳， 电泳结 234 +5 #6#789:; 果显示被 !"# 处理过的溶血素在凝胶上仍为一条带 （图 2） 。
作者简介： 方绍庆 （2/0%9） ， 男， 硕士， 研究方向为兽医病原微生物学及免疫学， 现工作单位： 烟台出入境检验检疫 局， 邮政编码： #%!$$$。 收稿日期： 修回日期： #$$#9$09$:， #$$"9$29#2
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合作倍比稀释， 随后每孔加入 !" 置 &’( 孵育 $)， 测定溶血价。以煮沸灭 # $% 人红细胞， ! 活 $"*+, 后的样品作为空白对照。 !"# 化学修饰剂 二硫苏糖醇 （ -..） ， 二硫键修饰剂； 双氧水 （ /0 10 ） ， 巯基修饰剂； 二乙基焦碳酸盐 ， 组氨酸残基修饰剂； 碳化二亚胺 （ 2-4） ， 羧基修饰剂； （ 5678） ， 酪氨酸 （-234） 56乙酰咪唑 残基修饰剂， 以上为 9+:*; 公司产品。对氯汞苯甲酸 （ 34<=） ， 巯基修饰剂， 为 >?@) 公司产 品。56溴化琥珀亚胺 （5=9） ， 色氨酸残基修饰剂； 琥珀酸酐 （ 9ABB+,+B ;,)CDE+DF， ， 氨基修 97） 饰剂； （0， ， 精氨酸残基修饰剂， 以上为上海化学试剂公司产品。所 0， &6丁二酮 &6-+;BF@CG） 有试剂均为分析纯或电泳级纯度。 !"$ 化学修饰的方法
［5］ 。 致
通过 : 种蛋白质侧链残基修饰剂对猪链球菌 ! 型溶血素进行化学修饰， 初步确定了 色氨酸、 组氨酸、 精氨酸残基及二硫键与其溶血活性相关， 但究竟哪个基团或哪些基团参 与了溶血作用， 或哪些基团参与了其结合作用， 还需进一步深入研究。 参 考 文 献
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