病毒载体研究进展

重组病毒的生产和纯化
小量制备和纯化
场所
实验室
细胞培养 培养瓶 细胞裂解 反复冻融 病毒分离 离心
病毒纯化 密度梯度超速离心
制剂
缓冲液
保存
低温
ຫໍສະໝຸດ Baidu
大量制备和纯化
中试车间 转瓶、细胞工厂、发酵罐 机械法或化学法裂解 离心、超滤、萃取 浓缩、柱层析 配方
病毒载体与基因治疗产业化
基因治疗的三个核心部分
1、基因载体系统 2、基因表达系统 3、治疗基因
基因治疗产品的知识产权构成
GAL4 ER p65
muristerone
ZFHD-1 FKB12
FRAP P65
rapamycin
自我扩增型载体（self-amplifying vector）：
这类载体是以正链 RNA 病毒 Sindbis 病毒和 Semliki Forest 病毒为 基础的。用目的基因代替病毒的外壳蛋白编码序列，导入靶细胞中， 病毒的复制蛋白大量复制重组的基因组，mRNA 水平的大量增加导 致高水平的转导基因表达。自我扩增型载体的表现形式可以是 RNA，DNA 和重组病毒。
ITR
gene
pA
LTR
腺病毒载体：
ITR
单纯疱疹病毒载体：
gene
LTR
ITR
gene pA
gene
gene
gene
pac
ori
gene
gene
靶向性病毒载体
转导靶向性
改造病毒外壳/外膜
连接靶向性结合分子
Modified adenovirus
cell
转录靶向性（特异性）
组
肿
细
织
瘤
胞
特
选
周
异
合
物
细胞内包装
细胞外包装
常用的病毒载体的特点：
病毒载体
生物学特性
适用范围
反转录病毒载体 单链 RNA 病毒 8~10kb
腺病毒载体 双链 DNA 病毒 36kb
AAV 病毒载体 单链 DNA 病毒 ~5kb
可感染分裂细胞；
Ex vivo 基因治疗；
整合到染色体中；
肿瘤基因治疗。
表达时间较长；
有致癌的危险；
条件增殖型病毒载体（conditionally replicating vector）：
指可在某种特性的组织中产毒性复制，而在其它组织中不增殖的 病毒载体。这类病毒载体主要用于特异性裂解肿瘤细胞。如天然的腺 病毒突变株 Onyx-015 是 55Kdal E1B 基因功能缺失的腺病毒突变株， 可以选择性地在 p53 基因突变的肿瘤细胞中增殖，而在正常组织细胞 中不增殖。用这种突变株联合化疗治疗恶性肿瘤 II 期临床结果令人鼓 舞（Kirn D et al. 1998），已进入 III 期临床试验，从此，许多人工改 造的腺病毒突变体被用于肿瘤治疗研究中。
网膜等组织中表达较高；
基因治疗。
HSV 病毒载体 双链 DNA 病毒 152kb
具有嗜神经性；可逆轴突传 神经系统疾病的基
递；
因治疗；
可潜伏感染；
肿瘤的基因治疗。
容量大；
可感染分裂和非分裂细胞；
病毒载体研究方向
1、病毒包装系统 2、无病毒基因的病毒载体 3、靶向性病毒载体 4、可调控表达的病毒载体 5、嵌合型病毒载体 6、自我扩增型病毒载体 7、条件增殖型病毒载体 8、新病毒载体
病毒载体研究进展
吴小兵 （‘863’计划生物领域病毒基因载体研发基地）
基因载体系统
病毒载体系统
非病毒载体系统
DNA/RNA DNADNADNADNA
反腺腺单慢 裸
转病伴纯病
录 病 毒 载
毒 载 体
随 病 毒 载
疱 疹 病 毒
毒 载 体
体
体载
阳蛋 阳
离白 子质 脂复 质合
离 子 多 聚
嵌 合 物
体
复物 物
嵌合型病毒载体（hybrid viral vector）：
指将不同病毒的基因元件进行组合，形成的重组杂合病毒。如腺 病毒与 AAV 病毒的杂合体病毒，既具有腺病毒的感染性和基因组特性 （双链线状 DNA），又具有 AAV 病毒的染色体整合性（Lieber A et al. 1999）。各种病毒基因元件组合形成新的杂合载体的报道层出不穷，如 单纯疱疹病毒扩增子与 AAV 病毒杂合载体（Johnston KM et al. 1997）、 腺病毒与 EB 病毒复制子杂合载体（Tan BT et al. 1999）腺病毒与反转 录病毒杂合载体（Caplen NJ et al. 1999）等，不一而足。这些杂合载体 使重组病毒的特性多样化，以适应不同基因转移目的的需要。
病毒载体包装系统
组成：1、宿主细胞
2、辅助元件（辅助质粒、辅助病毒）
3、被包装的DNA/RNA
包含顺式作用元件
单因素生产系统（one-component system)
gag pol env

LTR
LTR
图1 反转录病毒包装系统示意图
双因素生产系统 (two-component system)
Ad Shuttle
HRE MDR1
MVM P4 B19 promoter HBV JCV EBV
P1 tTA P1 tTA
tetOp tTA
tetOp gene tetOp gene tetOp gene
ESTRADIOL
GAL4 ER VP16
合成的转录因子
RXR
EcR VP16
RU486
GAL4 PR VP16
Diphenol indene
E1a,b
293 cell
E1a,b
293 cell
JM17
图2 腺病毒包装系统示意图
无病毒基因的病毒载体
被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和 包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病 毒的外壳/外膜和感染性，但不表达病毒蛋白。
腺伴随病毒载体：
ITR
反转录病毒载体：
择
期
性
性
调
启
启
控
动
动
启
子
子
动
子
肿
双
病
瘤
特
毒
血
异
增
管
性
殖
内
启
的
皮
动
特
导
子
异
向
性
启
转
动
录
子
调
控
可调控表达的病毒载体
细胞的调控元件 病毒的调控元件 人工合成的调控元件
细胞特异性转录
四环素调控
细胞启动子 病毒启动子
albumin Tyrosinase or TRP-1 PSA MBP MCK GFAP NSE KDR/flt-1 AFP CEA erbB2
可感染分裂和非分裂细胞； In vivo 基因治疗；
不整合到染色体中；
肿瘤基因治疗；
外源基因表达水平高；
疫苗。
表达时间较短；
免疫原性强；
可感染分裂和非分裂细胞； In vivo 基 因 治
整合到染色体中；
疗；
无致病性；免疫原性弱；
Ex vivo 基因治疗；
可长期表达外源基因；
遗传病基因治疗；
在骨骼肌、心肌、肝脏、视 获得性慢性疾病的