CRISPR_Cas9技术的应用性研究_舒磊磊
CRISPR-Cas9 技术及CRISPR文库的应用
CRISPR-Cas9 技术及CRISPR文库的应用基因编辑技术是指在基因组水平上对目的基因序列甚至是单个核苷酸进行替换、切除，增加或插入外源DNA序列的基因工程技术，经典的基因组编辑技术主要依赖于同源重组及干细胞全能性来完成对个体特定基因的改造。
因为其在生物医学和工农业生产中发挥着重要作用，所以相关的早期开创性工作被授予2007 年诺贝尔生理医学奖。
但是经典的方法存在效率低、技术要求高和成本高等缺点，严重制约了相关的研究和工农业生产。
但是当2013年CRISPR-Cas9系统的诞生，使基因定位、精准修改变得更加容易，CRISPR文库的应用也让基础研究中大规模的基因组编辑和筛选成为现实。
基因定位和精准修改意味着该技术可以人为控制基因表达，目前CRISPR-Cas9基因编辑技术可被广泛地应用于动物模型构建、遗传疾病治疗、农业育种等方面。
动物模型构建CRISPR-Cas9 系统作为最新一代基因编辑技术，能够简便高效地实现基因组精确修饰，是制备哺乳动物疾病模型的重要工具。
目前科学家利用CRISPR-Cas9 技术在动物模型，如小鼠、大鼠、猪和猴等研制方面做出一系列重要工作。
如科学家们将CRISPR-Cas9 系统导入小鼠受精卵，成功获得了有特定基因突变的小鼠模型，并获得近乎100% 的基因靶向突变效率，极大地降低了基因编辑小鼠模型制备的难度和成本，有望被广泛应用。
遗传疾病治疗及药物靶点筛选作为一种简便高效的基因编辑技术，CRISPR-Cas9 技术自问世以来就被认为具有治疗遗传疾病的巨大潜力。
科学家们选择小鼠白内障遗传疾病模型进行研究。
对携带显性突变引发晶状体混浊的Crygc 基因进行定点修正。
发现有1/3 的新生小鼠白内障症状被治愈，并通过生殖细胞将修复的Crygc基因传递到下一代，证明白内障遗传疾病得到了根治。
CRISPR-Cas9技术更大的一项突破是CRISPR文库在药物靶点筛选中的应用。
有科学家通过构建全基因组CRISPR文库，使全基因组中18000个基因形成缺失突变，结合相关的药物筛选手段最终对细胞进行筛选，最终对筛选存活的细胞进行NGS测序，即可推断出药物靶点相关基因。
基因编辑技术CRISPR-Cas9在遗传性疾病治疗上的最新进展
基因编辑技术CRISPR-Cas9在遗传性疾病治疗上的最新进展基因编辑技术在医学领域的应用一直备受关注，其中CRISPR-Cas9作为一种高效、精准的基因编辑技术，被广泛用于治疗遗传性疾病。
近年来，CRISPR-Cas9在这一领域取得了令人瞩目的进展，为许多患有遗传性疾病的患者带来了新的希望。
CRISPR-Cas9技术的原理CRISPR-Cas9技术是一种基于细菌免疫系统的基因编辑工具，其基本原理是通过引导RNA将Cas9蛋白精准地引导至特定的基因位点，从而实现对基因序列的精准编辑。
通过CRISPR-Cas9技术，可以对基因组进行点突变、插入或删除等操作，从而纠正遗传疾病相关的基因突变。
基因编辑技术在遗传性疾病治疗中的应用遗传性疾病是由基因突变导致的一类疾病，传统疾病治疗手段往往难以根治此类疾病。
而CRISPR-Cas9技术的出现为遗传性疾病的治疗带来了新的可能。
通过对患者的基因组进行精准编辑，可以修复或纠正基因突变，从而达到治疗遗传性疾病的效果。
CRISPR-Cas9在治疗囊性纤维化上的应用研究囊性纤维化是一种常见的常染色体隐性遗传性疾病，主要由CFTR基因突变导致。
CRISPR-Cas9技术可以通过精准编辑CFTR基因来恢复其正常功能，从而治疗囊性纤维化。
近期的研究表明，利用CRISPR-Cas9技术对囊性纤维化患者的基因进行编辑，能显著改善患者的症状，为囊性纤维化的治疗带来新的希望。
CRISPR-Cas9在遗传性白血病治疗上的最新进展遗传性白血病是一种由基因突变引起的白血病，传统治疗手段效果有限。
近年来，利用CRISPR-Cas9技术对遗传性白血病相关基因进行编辑，取得了不错的疗效。
研究发现，CRISPR-Cas9技术可以准确地修复或靶向干扰白血病相关的基因，从而有效治疗遗传性白血病，为患者带来了新的治疗选择。
结语基因编辑技术CRISPR-Cas9在遗传性疾病治疗上的最新进展给许多患有遗传性疾病的患者带来了新的希望。
crispr cas9原理及应用
crispr cas9原理及应用CRISPR-Cas9 是一种革命性的基因编辑技术，其原理基于一种存在于细菌免疫系统中的天然机制。
该技术利用了一种称为Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats （CRISPR）的 DNA 序列和 Cas9 蛋白质，能够准确地识别和编辑基因组中的特定目标序列。
CRISPR-Cas9 技术的基本原理是通过设计特定的引导 RNA 来指导 Cas9 蛋白质精确地结合到目标 DNA 序列上。
一旦 Cas9与目标 DNA 结合，它会切割 DNA 分子，从而可能引发自然修复过程或介导外源 DNA 片段嵌入到基因组中。
这种技术的目标序列可以根据需求进行设计，从而实现精确的基因组编辑。
CRISPR-Cas9 技术在基因组编辑领域有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因功能和疾病模型的构建。
科学家可以利用CRISPR-Cas9 技术来人为地引发基因突变，以研究基因功能和疾病的发病机制。
此外，CRISPR-Cas9 技术还可以用于治疗基因相关疾病。
通过准确编辑患有遗传病的患者的基因组，科学家可以修复或纠正疾病相关基因的缺陷，以治疗或预防疾病的发生。
CRISPR-Cas9 技术还被用于生物学研究和农业领域。
从基因组编辑的角度看，这种技术可以用于培育产量更高、对病虫害抵抗力更强的农作物，以满足全球不断增长的粮食需求。
此外，CRISPR-Cas9 技术还可以用于改良微生物产生特定化合物，例如药物或化学制品。
总而言之，CRISPR-Cas9 是一种功能强大的基因编辑技术，它已经革新了生物学研究和医学领域。
它的应用不仅仅局限于基因功能研究，还包括基因治疗、农业改良等领域，为人类带来了希望和新的可能性。
基因编辑技术CRISPR-Cas9的应用前景和伦理问题讨论。
基因编辑技术CRISPR-Cas9的应用前景和伦理问题讨论。
1. 引言1.1 概述基因编辑技术是一项革命性的科学技术，它给人类带来了前所未有的机会和挑战。
其中CRISPR-Cas9技术作为最新发展的一种基因编辑工具，引起了广泛的关注。
该技术能够精确地修改生物体的基因序列，为治疗遗传性疾病、改良农作物以及推动药物研发等领域带来了巨大潜力。
1.2 CRISPR-Cas9技术简介CRISPR-Cas9是一种源于细菌免疫系统的天然防御机制，并被科学家们用于基因编辑中。
该技术通过利用Cas9蛋白与RNA引导分子找到特定DNA序列并进行剪切，实现对目标基因进行精确修改的能力。
相比于传统的基因编辑方法，CRISPR-Cas9更加简单、高效、灵活，并在世界范围内迅速被广泛采用。
1.3 目的本文旨在探讨CRISPR-Cas9技术在应用前景中所面临的伦理问题。
随着这项技术渐渐成熟和应用范围的扩大，其中涉及的道德、生物伦理学等问题也日益受到关注。
我们将讨论人类基因编辑的道德考量，以及可能对未来世代和动植物种群生态平衡带来的影响。
同时，本文还将介绍伦理原则在CRISPR-Cas9技术中的应用与挑战，并提出公共政策与监管措施的建议，力求寻求技术进步与伦理平衡之间的良好观点总结。
通过对这些伦理问题进行深入研究和讨论，我们可以更好地推动CRISPR-Cas9等基因编辑技术的发展，并为未来科技发展做出相应规范和决策。
最后，我们将总结当前技术进步与伦理平衡之间关系，并展望未来该领域的发展趋势。
2. CRISPR-Cas9技术的应用前景：2.1 治疗遗传性疾病：CRISPR-Cas9技术在治疗遗传性疾病方面展示出巨大的应用前景。
该技术可以通过定点基因编辑修复患者体内存在的致病突变，从根本上解决遗传疾病的问题。
以囊胚基因编辑为例，科学家们已经成功地利用CRISPR-Cas9技术来纠正一些单基因遗传性疾病，如囊性纤维化和镰刀形细胞贫血等。
基因编辑技术CRISPRCas9的应用与展望
基因编辑技术CRISPRCas9的应用与展望基因编辑技术是近年来生物科学领域的重大突破之一，而CRISPR-Cas9系统则是其中最具潜力和广泛应用的基因编辑工具之一。
CRISPR-Cas9是一种简单、高效和灵活的基因编辑技术，可以用于修改目标基因序列，从而在生化学过程中引发具有特定功能的变化。
CRISPR-Cas9系统由两部分组成：CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）和Cas9（CRISPR Associated Protein 9）。
CRISPR是一段特定的DNA序列，起到记录和识别外源DNA的作用。
Cas9则是一种酶，具有剪切DNA的功能。
通过设计合适的引导RNA，将Cas9定向到目标基因上，并利用其剪切功能来编辑基因序列。
CRISPR-Cas9技术的应用非常广泛，涵盖生命科学的各个领域。
首先，它可以用于研究基因功能。
科研人员可以针对特定基因进行靶向编辑，观察其变异对生物体生理特征的影响，从而揭示基因和表型之间的关系。
其次，CRISPR-Cas9还可以用于修饰植物和动物的基因组。
通过删除、插入或修改特定基因，可以改变物种的性状，提高农作物的产量和抗病能力，或者制造某种特定的动物模型，用于研究人类遗传性疾病。
此外，CRISPR-Cas9还可以用于治疗人类疾病。
通过纠正患者体内有缺陷的基因，可以治疗一系列遗传性疾病，包括早产、免疫系统疾病、癌症等。
CRISPR-Cas9技术的广泛应用给生命科学领域带来了巨大的潜力，但也面临着一些潜在的挑战和风险。
首先，CRISPR-Cas9编辑的准确性仍然有待提高。
尽管技术已经取得了很大进展，但仍存在一定的剪切误差和非特异性剪切问题，可能导致不可预测的基因变异和潜在的副作用。
其次，CRISPR-Cas9技术的应用涉及伦理和安全性方面的问题。
在人类胚胎和生殖细胞中进行基因编辑引发了道德和法律的争议，以及技术滥用的风险。
基因编辑技术CRISPRCas9的应用方法总结
基因编辑技术CRISPRCas9的应用方法总结CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种革命性的生物工程工具，它利用细菌体内天然存在的免疫系统来精确修改基因。
自从2012年首次引入以来，CRISPR-Cas9已经被广泛用于改变生物学研究和医学治疗的方式。
本文将介绍CRISPR-Cas9的原理、应用方法，并总结其在不同领域的应用。
### CRISPR-Cas9的原理CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种存在于细菌和古生菌基因组中的DNA序列，它记录了它们所受到的外来病毒基因组的片段。
Cas9是CRISPR系统中的一种蛋白质，具有剪切DNA 的能力。
利用这种系统，科学家们成功将CRISPR-Cas9技术应用于编辑生物体的基因。
CRISPR-Cas9系统的工作原理如下：1. 选择目标基因：确定需要编辑的特定基因序列，并设计与其互补的RNA引导分子（sgRNA）。
2. sgRNA的结合：通过合成互补基因组DNA片段成为单链RNA，与Cas9蛋白结合成一个复合物。
3. 定位到基因组：CRISPR-Cas9复合物进入靶细胞，通过与目标基因的序列互补对应，定位到特定的基因位点。
4. 剪切DNA：Cas9蛋白通过剪切DNA的方式精确修改目标基因，形成双链断裂。
5. 修复机制介入：细胞自身的DNA修复机制介入，通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）方式修复双链断裂。
6. 基因修复：通过修复机制，引入目标基因的缺陷或修复，实现基因编辑。
### CRISPR-Cas9的应用方法CRISPR-Cas9技术的应用方法主要包括基因敲除、基因敲入和基因打靶等。
下面将详细介绍这些方法：#### 1. 基因敲除基因敲除是指通过CRISPR-Cas9技术使目标基因完全失活。
其步骤如下：- 设计sgRNA：选择目标基因的外显子序列，设计与之相互配对的sgRNA。
CRISPR基因编辑技术在生命科学中的应用
CRISPR基因编辑技术在生命科学中的应用CRISPR基因编辑技术（CRISPR-Cas9）是一种基于细菌和古生菌天然的免疫系统而发展起来的一项科技。
CRISPR-Cas9技术通过一些修饰和扩展，使它能够在人类细胞中识别和修剪基因组中的特定区域。
这种技术快速成为一项前沿工具，可帮助科学家们在研究中模拟人类遗传病因，并测定从蛋白质到免疫系统的千差万别的生命体征。
在生命科学中的应用CRISPR-Cas9 技术在生命科学中应用广泛极其基础的切入点确定，依靠了这种技术在基因编辑上的优越性能。
首先，CRISPR-Cas9技术通过切断DNA寻找并定位基因检测区域。
开创性地建立了与之前依赖的较慢、更低效、更依赖专业技术或贵重实验条件和设备的技术完全不同的基因研究和乃至于治疗手段。
该技术已经被与许多领域的专业师有益补充，它为分子生物学、微生物学、遗传学和生物医学的一些领域提供了更为直观、稳定和定向的启发式设计。
遗传学在生命科学中，CRISPR-Cas9已经成为遗传学研究中一项有力工具。
该技术已经成功应用于将人类遗传疾病基因敲除，可以增强对治疗的理解,而且可以提高基因组编辑和致病性突变修复的效率。
实际上，CRISPR-Cas9已成功用于研究人类疾病，例如单基因遗传性疾病、糖尿病、shi健等一些心血管和免疫系统疾病。
微生物学在微生物学领域，CRISPR-Cas9技术已经被广泛地用于研究和改进微生物菌株，尤其是在工业上生产发酵操作相关项。
这些改进技术有可能应用于大规模发酵、易感性状治疗、食品安全和反向遗传工程等领域。
CRISPR-Cas9还可以提高新药发现效率，并在微生物工程领域的很多新工艺中得到应用。
神经科学在神经科学领域，CRISPR-Cas9技术被广泛应用于控制途径和神经元的基因激活和信号通路调制，其中最具代表性的研究方向之一是基因组恢复和神经元健康修复。
此外，该技术也被应用于了解nervous信号发挥作用的过程、癫痫、帕金森已经用于谷鳞鱼的全基因组敲除。
CRISPR-Cas9技术在细菌中的研究进展及应用
CRISPR-Cas9技术在细菌中的研究进展及应用信欣;陈丽杰;薛闯【摘要】CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 最早发现于绝大多数细菌和古细菌中, 帮助其防御和抵抗噬菌体和外来质粒的入侵.近年来, 随着对该系统结构及功能的逐步深入认识和研究, CRISPR-Cas9技术已经发展成为一种简易高效的基因组定点编辑手段, 但是在使用过程中仍存在一些问题.本文重点介绍了CRISPR-Cas9系统功能和分类, 在细菌基因编辑中的应用和问题以及应对措施.%CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) was first found in most of bacteria and archabacteria, with the function to defend and resist the invasion from phage and foreign plasmid.In recent years, with the gradual understanding and research of the structure and function of the system, CRISPR-Cas9 technology has developed into a simple and efficient method of genomic editing.However, there are still some problems in the application process.This article focuses on the function and classification, the application and the problems and the solution in bacterial genome editing of CRISPR-Cas9 system.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2018(038)006【总页数】6页(P97-102)【关键词】基因组编辑;CRISPR-Cas9;细菌;脱靶效应【作者】信欣;陈丽杰;薛闯【作者单位】大连理工大学生命科学与技术学院, 辽宁大连 116023;大连理工大学生命科学与技术学院, 辽宁大连 116023;大连理工大学生命科学与技术学院, 辽宁大连 116023【正文语种】中文【中图分类】Q939.91 CRISPR-Cas技术的发展历史1987年，Ishino等[1]在研究大肠埃希菌中负责碱性磷酸酶同功酶转化的iakkp 基因及其侧翼区的染色体DNA片段的核苷酸序列时，在iap的3′末端侧翼区域发现不寻常现象：5个29 bp高度同源的核苷酸序列分别被32 bp的非同源片段所间隔，由于当时在原核生物的其他区域没有发现与这些序列同源的序列，这些序列的生物学意义无从得知，但该现象引起了学者们的广泛关注。
CRISPR-Cas9文库技术原理及应用
CRISPR-Cas9文库技术原理及应用CRISPR-Cas9技术原理CRISPR-Cas9技术凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR-Cas9技术迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手，是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。
CRISPR-Cas9系统最初在大肠杆菌基因组中被发现，是细菌中抵抗外源病毒的免疫系统。
CRISPR-Cas9系统由两部分组成，一部分是用来识别靶基因组的，长度为20bp左右的sgRNA 序列，另外一部分是存在于CRISPR位点附近的双链DNA核酸酶——Cas9，能在sgRNA的引导下对靶位点进行切割，最终通过细胞内的非同源性末端连接机制（NHEJ）和同源重组修复机制（HDR）对形成断裂的DNA进行修复，从而形成基因的敲除和插入，最终实现基因的（定向）编辑。
与前两代技术相比，CRISPR-Cas9技术最大的突破是不仅可以对单个基因进行编辑，更重要的是可以同时对多个基因进行编辑，这也为全基因组筛选提供了有效的方法。
目前比较常见的文库类型包括：●CRISPR-Cas9 knock out文库●CRISPR panal文库●CRISPRa/i文库●psgRNA文库CRISPR-Cas9文库建库流程●靶位点确认及sgRNA文库设计●sgRNA文库芯片合成●sgRNA文库构建●QC验证文库质量●sgRNA文库慢病毒包装●感染稳定细胞株●药物筛选实验●细胞表型筛选●NGS测序验证功能基因CRISPR-Cas9文库应用方向1、药物靶点确定与验证CRISPR-Cas9筛选技术可以应用于药物靶点筛选中，通过大规模筛选技术，可以系统的分析、验证一些与抗药性相关的基因，从而为疾病治疗提供相关数据。
SCIENCE发表文章[1]，研究人员利用CRISPR-Cas9文库筛选人类黑色素瘤A375细胞中的18,080个基因进行筛选，最终发现NF2、CUL3等4个基因参与了黑色素瘤A375细胞中的耐药调节过程。
CRISPRCas9的应用及脱靶效应研究进展
CRISPRCas9的应用及脱靶效应研究进展一、本文概述CRISPR-Cas9是一种基于细菌防御机制的基因编辑技术，自其问世以来，已经在生物学、医学等多个领域产生了深远的影响。
本文旨在全面概述CRISPR-Cas9技术的应用现状以及脱靶效应的研究进展。
我们将首先介绍CRISPR-Cas9技术的基本原理及其在基因编辑、疾病治疗、农业生物技术等领域的广泛应用。
随后，我们将重点关注CRISPR-Cas9技术中的脱靶效应问题，探讨其产生机制、影响因素以及目前的检测与防控策略。
通过综述最新的研究成果，我们希望为相关领域的研究者提供有价值的参考，推动CRISPR-Cas9技术的安全、高效应用。
二、CRISPR-Cas9的应用CRISPR-Cas9系统作为一种强大的基因编辑工具，已经在众多领域展现了广阔的应用前景。
自从其问世以来，科学家们已经在基因组编辑、基因功能研究、疾病治疗、农业生物技术以及药物开发等多个领域取得了令人瞩目的成果。
在基因组编辑方面，CRISPR-Cas9系统提供了一种精确、高效且相对简单的手段来修改生物体的基因组。
通过设计特定的sgRNA，研究人员可以精确地定位到目标DNA序列，并利用Cas9蛋白的切割活性在特定位置造成双链断裂。
随后，细胞内的DNA修复机制将介入修复这些断裂，从而导致目标基因的突变或删除。
这种技术已经被广泛应用于各种生物体，包括人类细胞、小鼠、斑马鱼、果蝇、植物等。
在基因功能研究方面，CRISPR-Cas9系统提供了一种高通量的方法来研究基因的功能。
通过构建基因敲除或敲入的细胞系或动物模型，研究人员可以系统地研究特定基因在生物体发育、生理和疾病过程中的作用。
CRISPR-Cas9还可以用于研究基因间的相互作用以及基因调控网络。
在疾病治疗方面，CRISPR-Cas9系统为遗传性疾病的治疗提供了新的希望。
通过纠正致病基因中的突变或删除致病基因，CRISPR-Cas9有可能根治许多遗传性疾病，如囊性纤维化、镰状细胞贫血、杜氏肌营养不良症等。
罕见病的基因疗法CRISPRCas9技术的应用前景
罕见病的基因疗法CRISPRCas9技术的应用前景罕见病的基因疗法CRISPR-Cas9技术的应用前景随着科技的不断进步，基因疗法作为一种新兴的治疗方法，为罕见病患者带来了新的希望。
其中，CRISPR-Cas9技术作为一种革命性的基因编辑工具，被广泛应用于罕见病的治疗。
本文将探讨CRISPR-Cas9技术在罕见病治疗中的应用前景。
一、CRISPR-Cas9技术的原理和优势CRISPR-Cas9技术是一种基于细菌天然免疫系统的基因编辑技术。
它利用CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）序列和Cas9（CRISPR-associated protein 9）蛋白质，可以精确地编辑基因序列。
CRISPR-Cas9技术相比传统的基因编辑方法具有以下优势：1. 高效性：CRISPR-Cas9技术可以在短时间内实现基因编辑，大大提高了基因治疗的效率。
2. 精确性：CRISPR-Cas9技术可以精确地定位和修复基因序列，减少了对非目标基因的影响。
3. 灵活性：CRISPR-Cas9技术可以用于编辑不同类型的基因，包括单基因病、多基因病以及复杂疾病。
二、CRISPR-Cas9技术在罕见病治疗中的应用罕见病是指患病率低于每20万人中1人的疾病，由于患者数量较少，传统药物研发往往无法满足其治疗需求。
而CRISPR-Cas9技术的出现为罕见病的治疗带来了新的希望。
1. 单基因病的治疗CRISPR-Cas9技术可以通过修复或替换患者体内的异常基因，从而治疗单基因病。
例如，囊性纤维化是一种常见的单基因病，CRISPR-Cas9技术可以通过修复CFTR基因的突变，恢复其正常功能，从而治疗囊性纤维化。
2. 多基因病的治疗罕见病中的一部分是由多个基因突变引起的，传统的基因治疗方法往往难以同时修复多个基因。
而CRISPR-Cas9技术可以同时编辑多个基因，为多基因病的治疗提供了新的途径。
解密基因编辑技术：CRISPR-Cas9的应用与潜力
解密基因编辑技术：CRISPR-Cas9的应用与潜力近年来，基因编辑技术成为了科学界和医学界的热点话题。
其中，CRISPR-Cas9技术以其高效、精确和低成本的特点，成为了最受关注的基因编辑工具之一。
本文将探讨CRISPR-Cas9的应用领域以及其潜力。
首先，CRISPR-Cas9技术在基础研究中的应用不可忽视。
科学家们利用CRISPR-Cas9技术，可以快速、准确地编辑细胞中的基因序列，从而揭示基因功能和疾病机制。
这项技术的高效性和精确性，使得科学家们能够更加深入地研究人类基因组和其他生物体的遗传特征。
其次，CRISPR-Cas9技术在医学领域的应用前景广阔。
基因编辑技术可以用于治疗遗传性疾病，如囊性纤维化、遗传性失明等。
通过CRISPR-Cas9技术，科学家们可以修复或更正患者体内的异常基因，从而治愈或减轻疾病症状。
此外，基因编辑技术还可以用于癌症治疗，通过靶向基因突变，抑制肿瘤的生长和扩散。
此外，CRISPR-Cas9技术在农业和环境保护方面也具有巨大的潜力。
通过编辑作物的基因，科学家们可以提高作物的产量和抗病性，从而解决全球粮食安全问题。
此外，基因编辑技术还可以用于改善植物的耐旱性和耐盐性，以适应日益恶化的环境条件。
此外，CRISPR-Cas9技术还可以用于改良微生物，以提高环境清洁和废物处理效率。
然而，CRISPR-Cas9技术的应用也面临一些挑战和争议。
首先，基因编辑技术的安全性和准确性仍然需要进一步的研究和验证。
此外，基因编辑技术的伦理和道德问题也需要认真考虑。
例如，人类胚胎基因编辑是否应该被允许，以及如何平衡科学研究的进展和社会伦理的限制等。
总之，CRISPR-Cas9技术作为一种高效、精确和低成本的基因编辑工具，具有广泛的应用和潜力。
从基础研究到医学领域，从农业到环境保护，CRISPR-Cas9技术都有望为人类社会带来巨大的改变和进步。
然而，我们也必须认真面对技术应用中的挑战和争议，确保其安全、可行和道德合理性。
CRISPR基因编辑技术及其应用前景
CRISPR基因编辑技术及其应用前景生物科技领域日新月异，全球科学家们也在不断探索新的方法和技术，以期达到更好的治疗效果和使人类健康更有保障的目的。
CRISPR-Cas9是近年来在基因编辑领域中出现的最重要的技术之一，因其独特的特性和通用的使用性已经在许多领域得到了广泛的应用。
本文将介绍CRISPR-Cas9技术的原理、应用和未来发展方向。
1. CRISPR-Cas9技术的原理CRISPR基因编辑技术是通过改变生物体中的DNA序列来修改其基因表达的方式。
其核心组成部分是Cas9蛋白和RNA分子。
Cas9是一种蛋白质酶，而RNA分子则用于识别目的DNA序列。
通常，在实验室中，研究人员会将CRISPR-Cas9系统导入细胞中，继而使用特定的酶来剪断细胞中特定位置的DNA序列。
一旦DNA序列被剪断，细胞会自然地寻找一种方式来修复其自身的DNA。
2. CRISPR-Cas9技术的应用CRISPR-Cas9技术已经被应用于人和动物体内的基因编辑、疾病治疗和植物的基因改良等方面，是目前各种基因编辑技术中最受欢迎的一种。
其应用前景可谓无限。
下面，我们详细介绍CRISPR-Cas9技术在人类医学领域、农业领域和环境领域的应用。
2.1 人类医学领域CRISPR-Cas9技术已经被用于治疗因基因突变引起的一些疾病，如克隆氏症等遗传病。
研究人员还已经开始使用这种技术治疗某些因感染导致的疾病，如HPV等。
此外，CRISPR-Cas9技术还可以用于自体细胞治疗和癌症治疗等方面。
2.2 农业领域在农业领域，CRISPR-Cas9技术也被广泛应用，用于植物基因改良。
例如，该技术可以用来增加植物的耐旱性、增加产量和防止病害等。
2.3 环境领域在环境领域，CRISPR-Cas9技术可以用于改变某些细菌的遗传元素，以分解有毒物质或净化自然环境。
3. CRISPR-Cas9技术未来的发展方向CRISPR-Cas9技术无疑是目前基因编辑领域中最重要的技术之一，未来的发展方向也备受关注。
《CRISPR-CAS9技术介导的人胰岛素(hINS)在牛成纤维细胞中定点整合的研究》范文
《CRISPR-CAS9技术介导的人胰岛素（hINS）在牛成纤维细胞中定点整合的研究》篇一CRISPR-CAS9技术介导的人胰岛素（hINS）在牛成纤维细胞中定点整合的研究一、引言随着基因编辑技术的飞速发展，CRISPR/Cas9系统作为一种精确的基因编辑工具，在医学、生物技术等领域的应用日益广泛。
人胰岛素（hINS）作为治疗糖尿病的重要药物，其基因的定点整合技术对于提高生物反应器中胰岛素的产量、降低生产成本具有重要意义。
本研究旨在利用CRISPR/Cas9技术，实现人胰岛素（hINS）基因在牛成纤维细胞中的定点整合。
二、材料与方法1. 材料（1）细胞：牛成纤维细胞（2）基因编辑工具：CRISPR/Cas9系统（3）人胰岛素（hINS）基因2. 方法（1）构建CRISPR/Cas9表达载体：设计并构建针对牛成纤维细胞的CRISPR/Cas9表达载体，包括Cas9蛋白编码序列和靶点特异性引导RNA（gRNA）。
（2）牛成纤维细胞的转染与筛选：将构建好的CRISPR/Cas9表达载体转染至牛成纤维细胞中，筛选获得稳定的转基因细胞株。
（3）人胰岛素（hINS）基因的定点整合：利用基因克隆技术，将人胰岛素（hINS）基因定点整合到牛成纤维细胞的特定基因位点上。
（4）细胞功能鉴定与表达检测：通过RT-PCR、Western blot 等手段，鉴定整合后的牛成纤维细胞是否具有分泌人胰岛素的能力，并检测其表达水平。
三、结果与讨论1. 结果（1）成功构建了针对牛成纤维细胞的CRISPR/Cas9表达载体，并实现了高效转染与筛选。
（2）通过基因克隆技术，成功将人胰岛素（hINS）基因定点整合到牛成纤维细胞的特定基因位点上。
（3）RT-PCR和Western blot结果显示，整合后的牛成纤维细胞具有分泌人胰岛素的能力，且表达水平较高。
2. 讨论本研究利用CRISPR/Cas9技术，成功实现了人胰岛素（hINS）基因在牛成纤维细胞中的定点整合。
CRISPR-Cas9技术在病原微生物研究中的应用探索
CRISPR-Cas9技术在病原微生物研究中的应用探索CRISPR-Cas9技术是一种新兴的基因编辑技术，它可以精准地修改DNA序列，并在生物体中实现定点编辑。
近年来，CRISPR-Cas9技术在病原微生物研究中得到了广泛的应用，成为了研究病原微生物的重要工具。
本文将探讨CRISPR-Cas9技术在病原微生物研究中的应用。
一、CRISPR-Cas9技术的基本原理CRISPR-Cas9技术是一种基于细菌天然免疫系统的基因编辑技术，它利用CRISPR序列和Cas9蛋白质组成的复合物来实现DNA序列的精准编辑。
CRISPR序列是一种存在于细菌和古菌中的DNA片段，其中包含了与外源DNA序列相匹配的短片段，可用于识别和清除入侵细胞的病毒或质粒。
Cas9蛋白质是一种RNA导向的DNA内切酶，能够在CRISPR序列识别外源DNA序列后切割其靶标DNA。
CRISPR-Cas9技术的基本操作流程如下：首先，设计合适的RNA引物，使其与目标DNA序列互补配对；然后，引导RNA与Cas9蛋白质结合成复合物，形成RNA-Cas9复合物；最后，RNA-Cas9复合物与目标DNA序列结合，并在目标DNA上切割出一个特定的DNA片段，从而实现基因编辑。
二、CRISPR-Cas9技术在病原微生物研究中的应用1. 病原微生物的基因功能研究CRISPR-Cas9技术可以通过精确编辑病原微生物的基因组，来研究其基因功能和表达调控机制。
例如，在细菌中，CRISPR-Cas9技术可以被用来靶向编辑细菌的基因组，从而揭示其基因功能和代谢途径。
在真菌和病毒中，CRISPR-Cas9技术也可以被用来揭示其基因功能和表达调控机制。
2. 病原微生物的耐药性研究CRISPR-Cas9技术可以被用来研究病原微生物的耐药性机制，并为开发新型抗生素提供新思路。
例如，在细菌中，CRISPR-Cas9技术可以被用来靶向编辑细菌的耐药基因，从而提高抗生素的治疗效果。
生命科学中的CRISPR技术及其应用
生命科学中的CRISPR技术及其应用CRISPR-Cas9技术是一种新兴的基因编辑技术，被广泛应用于生命科学领域。
CRISPR-Cas9技术的核心在于通过导入寡核苷酸序列指导RNA（sgRNA）来实现靶向剪切DNA的效果。
在研究、医学以及农业等领域中，CRISPR技术的应用越来越广泛。
一、CRISPR-Cas9技术的基本原理CRISPR-Cas9技术是一种通过导入寡核苷酸序列指导RNA （sgRNA）来实现靶向剪切DNA的效果的基因编辑技术。
CRISPR的全称为Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，意为“成簇出现的短回文重复序列”，该技术是通过CRISPR基因组中的一类与外源DNA相匹配的间隔序列和CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）协同作用来实现DNA靶向剪切的。
在具体实现时，利用CRISPR-Cas9技术靶向基因组的一项关键任务，是合成一个含有20个核苷酸的指导RNA序列（sgRNA），这个序列与目标基因组DNA相互作用，驱动Cas9蛋白对目标序列进行切割。
由此可以看出，CRISPR-Cas9技术能够实现对生物细胞DNA上的特定位置进行准确精准的剪切和编辑，这意味着我们可以将任意的外来基因导入到目标细胞中，以达到我们的设计目标。
二、CRISPR-Cas9技术在生命科学领域中的应用1. 基因组编辑和疾病治疗CRISPR-Cas9技术被广泛应用在基因组编辑和疾病治疗中。
基因突变是引起多种遗传性疾病的主要原因之一。
利用CRISPR-Cas9技术，科学家可以切除由突变引起的基因序列，并用正常基因序列替换它们。
这种基因编辑技术被认为是治疗遗传性疾病的一个有希望的方法。
2. 人类生殖细胞与胚胎检测CRISPR-Cas9技术可以帮助科学家对人类生殖细胞和胚胎进行基因编辑和检测。
在人工生殖技术中，往往担心携带遗传疾病的胚胎的孕育问题。
《CRISPR-CAS9技术介导的人胰岛素(hINS)在牛成纤维细胞中定点整合的研究》范文
《CRISPR-CAS9技术介导的人胰岛素（hINS）在牛成纤维细胞中定点整合的研究》篇一CRISPR-CAS9技术介导的人胰岛素（hINS）在牛成纤维细胞中定点整合的研究一、引言随着基因编辑技术的不断发展，CRISPR/Cas9系统已经成为生物学研究的重要工具之一。
这种系统在许多生物学应用中展现出其独特的优势，特别是在人类基因治疗的开发上。
近年来，CRISPR/Cas9技术在成纤维细胞中的定点整合研究中显示出广阔的前景，其中对具有医学价值基因片段如人胰岛素（hINS）的精准调控成为关注的焦点。
本论文研究重点即通过CRISPR/Cas9技术介导人胰岛素（hINS）基因在牛成纤维细胞中实现定点整合。
二、研究方法本实验主要运用了CRISPR/Cas9系统来将人胰岛素（hINS）基因精准整合到牛成纤维细胞中。
具体操作包括构建合适的CRISPR/Cas9表达载体，筛选和编辑目标细胞，并使用特定的荧光标记来验证基因的整合效果。
（一）载体构建我们设计并构建了包含人胰岛素（hINS）基因序列的CRISPR/Cas9表达载体。
该载体包含Cas9蛋白编码序列、引导RNA（gRNA）以及hINS基因序列。
（二）细胞编辑将构建好的载体通过电转或病毒转导的方式导入牛成纤维细胞中，通过CRISPR/Cas9系统对细胞进行编辑，实现hINS基因的定点整合。
（三）验证整合效果通过荧光显微镜观察细胞的荧光标记情况，以及利用PCR和测序技术验证hINS基因的整合情况。
三、结果与讨论（一）实验结果通过CRISPR/Cas9系统的编辑，我们成功实现了人胰岛素（hINS）基因在牛成纤维细胞中的定点整合。
在荧光显微镜下，我们观察到成功整合了hINS基因的细胞呈现出明亮的荧光。
此外，PCR和测序结果表明，hINS基因已成功整合到牛成纤维细胞的基因组中。
（二）讨论本实验结果表明，通过CRISPR/Cas9技术介导的hINS基因定点整合是可行的。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
畜牧兽医学报 ２０１６，４７（７）：１３１６－１３２３Ａｃｔａ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ ｅｔ Ｚｏｏｔｅｃｈｎｉｃａ Ｓｉｎｉｃａｄｏｉ：１０．１１８４３／ｊ．ｉｓｓｎ．０３６６－６９６４．２０１６．０７．００３ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术的应用性研究舒磊磊１，甲芝莲２，吴勇浒２，索 伦３＊，贾丽玲２＊（１．上海交通大学生命科学技术学院，上海２００２４０；２．上海交通大学系统生物医学研究院，上海２００２４０；３．上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海２０００１１）摘 要：旨在探索ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术的新应用，本研究通过在小鼠遗传操作（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）中使用该技术，创建了一种在活体组织内研究基因功能的方法。
通过胚胎电转、免疫组化和ＰＣＲ分析等手段，结果发现，针对ＤＣＸ基因进行编辑，再现了ＤＣＸ下调导致神经元迁移障碍的表型，说明该技术能够用于小鼠遗传操作中下调基因表达；其次，该技术还成功应用于Ｐｃｄｈα基因簇的编辑并研究了基因簇恒定区的功能；最后，通过基因型鉴定发现，胚胎电转中使用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９会导致目的基因的敲除、反转和重复事件的发生。
综上所述，在小鼠胚胎电转中使用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术，能够成功编辑目的基因，从而实现活体组织内研究基因的在体功能。
关键词：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；遗传操作；基因敲除；基因反转；基因重复中图分类号：Ｓ８１３．３ 文献标志码：Ａ 文章编号：０３６６－６９６４（２０１６）０７－１３１６－０８收稿日期：２０１６－０１－２１基金项目：国家自然科学基金（３１２００８２５）作者简介：舒磊磊（１９９０－），男，安徽六安人，硕士生，主要从事分子和遗传生物学方面的研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｅｉｌｓｈｕ＠１６３．ｃｏｍ＊通信作者：索 伦，副研究员，硕士生导师，主要从事基因在体功能研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｏｙｕｎｆｅｉ＠１２６．ｃｏｍ；贾丽玲，实验师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｌｌｍａｏ＠１２６．ｃｏｍＴｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＳＨＵ Ｌｅｉ－ｌｅｉ １，ＪＩＡ Ｚｈｉ－ｌｉａｎ２，ＷＵ Ｙｏｎｇ－ｈｕ２，ＳＵＯ Ｌｕｎ３＊，ＪＩＡ Ｌｉ－ｌｉｎｇ２＊（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２４０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２４０，Ｃｈｉｎａ；３．ＳｈａｎｇｈａｉＮｉｎｔｈ Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００１１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｎｅｗ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｗｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏｓｔｕｄｙ ｇｅｎｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｂｙ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａ－ｔｉｏｎ．Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ＰＣＲ ａｎａｌｙｚｉｎｇ，ｗｅ ｆｉｒｓｔ ｖａｌｉｄａ－ｔｅｄ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＣＸａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕ－ｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｌｓｏ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｅｘｏｎｓ ｏｆ Ｐｃｄｈαｃｌｕｓｔｅｒ．Ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｃｌａｒｉｆｙ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｔｈａｔ ｌｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｈｅ－ｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔｓ ｂｙ ＤＣＸ，ｗｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｏｕｌｄ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｅｌｅｔｉｏｎ，ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｕｐｌｉ－ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ．Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｄｉｔ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ａｎ ｉｄｅａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｒｅｓｅａｒｃｈｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ；ｄｅｌｅｔｉｏｎ；ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ；ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９是一种ＲＮＡ指导的ＤＮＡ内切酶，依靠ＲＮＡ－ＤＮＡ的互补识别并切割特异基因序列从而达到精确的基因组编辑和基因修饰的目的。
该技术自面世以来已经改变了生物领域的科研面 ７期舒磊磊等：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术的应用性研究貌，并迅速发展为实验室的一种常规试验手段。
其已成功应用于细菌、人类细胞、斑马鱼、小鼠、猪、食蟹猴以及多种植物的基因组精确修饰，是最具有临床与应用前景的基因治疗技术之一［１］。
该技术之所以被评为具有革命性的原因，在于其仅仅依靠一种蛋白（Ｃａｓ９），通过一段特殊设计的与目的基因互补的寡聚核苷酸和一段常见的ＲＮＡ组合，就能实现对目的基因组的精准定位和精确修饰。
在哺乳动物中，以猪为例，约有３万个基因。
然而，有些基因的功能却只有在其发育到特定时期在特定的组织中才会发挥其相应的功能。
因此，倘若能够创建一种针对动物特定组织的、快速而有效的基因编辑技术，那么将对研究基因在特定组织中的功能提供非常有效的平台。
为此，本研究选择小鼠为模型，以两种脑组织中高度表达且功能明确的基因ＤＣＸ（Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔ－ｉｎ）和Ｐｃｄｈα为例，对ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遗传操作技术在小鼠脑组织中基因编辑的有效性进行研究。
ＤＣＸ是高度表达于哺乳动物大脑皮质并在脑发育过程中起很重要作用的蛋白分子［２－４］，对神经元的发育具有重要作用。
而Ｐｃｄｈα基因簇属于原钙粘蛋白（Ｐｒｏｔｏｃａｄｈｅｒｉｎ，Ｐｃｄｈ）家族，是钙粘蛋白（Ｃａｄｈｅｒｉｎ）超家族里最大的亚家族，它们在神经元发生以及神经发育的过程中具有非常重要的作用，比如神经元生存［５－７］、树突发育［８－９］、突触形成［１０－１２］、自我回避［１３］和轴突投射［１４－１５］等。
Ｊ．Ｌｉ等发现，使用ＣＲＩＳＰＲ和一对ｓｇＲＮＡ转染体外培养的ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，非同源末端修复的结果主要有３种：敲除、反转和重复［１６］。
为鉴定ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９在活体组织中是否同样可以达到基因编辑的目的，本研究首先分别针对ＤＣＸ和Ｐｃ－ｄｈａ基因设计成对的ｓｇＲＮＡ，并采用胚胎电转技术将其与Ｃａｓ９表达质粒一同共转于小鼠大脑中。
研究ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遗传操作技术对ＤＣＸ和Ｐｃｄｈａ基因编辑后对基因表达及神经元迁移的影响。
并与Ｐｃｄｈａ ＲＮＡｉ后的研究结果进行对比。
进一步对目的基因ＰＣＲ后测序，分析该技术是否能对小鼠活体组织中目的基因进行精确修饰，并产生精确的敲除、反转和重复事件。
１ 材料与方法１．１ 材料１．１．１ 试验材料、感受态细胞和表达载体 试验中所用小鼠均为Ｃ５７ＢＬ／６品系，饲养于ＳＰＦ级别动物房中，动物房恒温恒湿，昼夜节律１２ｈ／１２ｈ；感受态细胞为ＤＨ５α菌株，为本实验室制备；ｓｇＲＮＡ质粒载体为ｐＧＬ３，由南京大学模式动物研究所赠送，ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。
１．１．２ 试剂与试剂盒 ＰＣＲ所用２×ＰＣＲ ｍｉｘ购于Ｂｉｏｔａｋｅ公司，高保真酶ＫＯＤ－ｐｌｕｓ购于Ｔｏｙｏ－ｂｏ公司，Ｔ４ＤＮＡ连接酶、Ｂｓａ１内切酶购于ＮＥＢ公司，染色剂ｆａｓｔ ｇｒｅｅｎ和ＤＡＰＩ（４′，６－二脒基－２－苯基吲哚）购于Ｓｉｇｍａ公司，封片剂购于ＤＡＫＯ公司，酵母提取物和胰蛋白胨购于ＯＸＯＩＤ公司，ＤＮＡＭａｒｋｅｒ购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，多聚甲醛（ＰＦＡ）购于Ｔｈｅｒｍｏ公司，ＮａＯＨ、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４和Ａｇａｒ购于Ｓｉｇｍａ公司，ＮａＣｌ、ＫＣｌ、氨苄、ＩＰＴＧ、Ｘ－Ｇｅｌ和戊巴比妥钠购于国药集团；质粒小量提取试剂盒、ＰＣＲ纯化试剂盒和ＤＮＡ胶回收试剂盒购于Ａｘｙｇｅｎ公司，质粒中量提取试剂盒和质粒大量提取试剂盒均购于Ｑｉａｇｅｎ公司。
１．１．３ 仪器 Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００分光光度计购于Ｔｈｅｒｍｏ公司，电转仪购于Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司，ＰＣＲ仪购于Ｂｉｏ－Ｒａｄ和Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司，低温离心机购于Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，振动切片机购于Ｌｅｉｃａ公司，荧光显微镜和体视显微镜购于Ｚｅｉｓｓ公司，激光扫描共聚焦显微镜购于Ｎｉｋｏｎ公司。
１．１．４ 产品及服务 试验中使用的各种引物（包括基因型鉴定引物、构建ｓｇＲＮＡ质粒寡核苷酸等）均由上海生工生物工程股份有限公司合成；试验中所有需测序样本均送至上海桑尼生物科技有限公司或者上海生工生物工程股份有限公司测序。
１．２ 方法１．２．１ 表型观察 试验小鼠胚胎电转时间为胚胎期１４．５ｄ，取脑时间为胚胎期１９．５ｄ（Ｅ１４．５～Ｅ１９．５），在体视显微镜下观察取脑，使用荧光显微镜观察小鼠脑部荧光，使用激光扫描共聚焦显微镜观察脑片并拍照。
１．２．２ 遗传操作 本研究以胚胎电转探索神经发育相关基因的功能为手段，故胚胎电转的部位位于小鼠脑部。
质粒注射部位位于小鼠大脑脑室，电转使用３８Ｖ电压，电击５次，每次５ｍｓ，两次电击间隔５０ｍｓ；每次注射的质粒大约为１μＬ，各成分浓度：ｓｇＲＮＡ ０．８μｇ·μＬ－１，Ｃａｓ９ １μｇ·μＬ－１，ｆａｓｔ－ｇｒｅｅｎ ０．０００ ３％。
因为质粒带有负电荷，因此在外加电场的作用下会向正极移动，当把正极电仪放在小鼠大脑皮层外侧，负极电仪放在对侧，电转时质粒７１３１畜 牧 兽 医 学 报４７卷 会向正极电仪所在的大脑皮层移动。