共价法固定化胰蛋白酶的研究

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酶的固定化技术

摘要：酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。

酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。

经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。

因此酶的固定化技术研究已成为十分引人注目的领域。

本文简要介绍了固定化酶技术的概念、制备方法(包括传统固定化技术、传统固定化技术的改进方法、新型固定化技术) 及其在化学化工、食品行业、临床医药、生物传感器和环境科学等领域中的应用现状与存在的问题,并对固定化酶技术的应用前景进行了展望。

关键词：固定化酶；制备；应用；磁性载体；定向固定固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。

酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。

与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。

固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。

固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。

物理方法包括物理吸附法、包埋法等。

物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。

但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。

化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。

介孔材料SBA-15固定化胰蛋白酶的研究

ｉｍｍｏｉｚｅｅｚｍｅｔｐｓｉｈｗａｓｅｌｄｉｅｃａｎｌｆＢＡ一５ｂｂｌｅｔｎｙｙｉｗｈｃｓｓｍｂｅｔｈｎｅｏＳｉｈｒｎａｎｈ１ｙｉｍｍｅｓｏｔｏ．ｈｆｅｔｆｍｍｏｉｚｔｎｃｎｉｏｓｒｉｎｍｅｈｄＴｅｅｃｓｉｏｂｌａｉｏｄｔｎｉｏｉｓｃｓｅｚｍｅｃｎｅｔａｉｎｐａｕｄｔｎｔｅａｓｒｅｍｏ￣ｏｎｙＢＡ一ｔｅｔｅｍａａｄｏｅａｉｎｌｔｂｌｉｆｈｕｈａｎｙｏｃｎｒｔ，ＨｖｌｅａｉｏｈｂｏｂｄａｕｏｎｍｅｆｚｍｅｉＳｅｎ１，ｈｒｌ５ｈｐｒｔａｓｉｔｓｏｅｎｏａｉｅｔｉｍｍｏｉｚｄｅｚｍｅｗｅｅｓｄｅ．ｄｔｅｂｓｅｚｍｅｃｎｅｔｔｎａｄｉｂｌｎｙｒｔｉｄＡｎｅｔｎｙｏｃｎｒｉｉｅｕｈａｏｎｍｍｏｉｚｔｎｔｒ／ｄ１，ｅｐｃｉｅｙｕｄｒｂｌｉｉｗｅｅ５ｍｇｍｌｉｏｍｅａｎａｈｒｓｅｔｌ，ｎｅ０ｖｗｈｃｈｂｏｂｄａｕｔｆｅｚｍｅｒａｈｄ２．／．ｔｗａｌｏｎｈｔｈｈｒａｄｏｅａｉｎｌｓｂｌｉｓｏｅｉｉｔｅａｓｒｅｍｏｎｎｙｅｃｅ３６ｍｇｇＩｈｏｓａｓｆｕｄｔａｅｔｅｏｔｍｌａｐｒｔａｔｉｔｆｈｍｍｏｉｚｄｎｏａｉｅｔｂｌｅｉｅｚｍｅｃｓｐｒｕｔｒｌＢＡ一ｓｓｏｏｂｏｄｓｐｏｒｍｍｏｉｚｔｎｏｎｙｒｉｈｒｔｎｔｏｅｏｅｆｅｅｚｍｅＳｌａｍｅｏｏｓｍａｅｉｈｔｒｉｏａＳ５ｗａｈｗｎｔｅａｇｏｕｐｒｆｔｏｉｂｌｉｆｉｏａ

固定化酶

固定化酶的制备及应用摘要：本文主要从酶的固定化载体、固定化方法等方面介绍了固定化酶制备中的研究进展情况，并且从医药、食品、环保、等方面其在其中的新应用出发，对固定化酶在新领域中的应用作了综述，给固定化酶研究的发展前景进行了展望，并且指出了今后酶固定化研究的主要方向是多酶的固定化及制备高活性、高负载、高稳定性的固定化酶。

固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项技术。

以往用的酶绝大多数是水溶性性的酶。

这些水溶性的酶催花结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的进一步发展。

60年代后，在美学研究领域内涌现出固定化酶，最早被称为“水不容酶”或“固相酶”，此技术将水不溶性的自然酶与不溶性载体相结合，成为不溶于水的酶的衍生物。

固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。

利用固定化技术，解决了酶应用过程中的很多问题，为酶的应用开辟了新的前景。

如可使所使用的酶、细胞能反复使用，使产物分离提取容易，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化，故在20世纪70年代后得到迅速发展。

其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新技术。

1固定化酶的优缺点1.1 优点（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；（2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；（3）稳定性显著提高；（4）可长期使用，并可预测衰变的速度；（5）提供了研究酶动力学的良好模型。

（6）酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保证，成本低。

1.2缺点（1）酶固定化时酶的活力有所损失，同时也增加了固定化的成本。

（2）比较适应水溶性底物和小分子底物。

（3）不适于多酶反应，特别是需要辅酶的反应。

2.固定化酶的制备原则（1 ）必须注意维持酶的催化活性及专一性。

酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性中心，为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构成活性中心的氨基酸残基不发生变化。

固定化酶载体材料的研究进展

1 对固定化酶载体材料性能要求
存和操作稳定性，酶活性损失较小。
成性质稳定、生物相容性高、并且具有高强度、
由于固定化酶载体材料对酶的性质影响
2.2 合成有机高分子载体
适于工业化生产的固定化酶载体材料，仍然是
极大，因此，对载体材料的种类和性能要求十分
合成有机高分子材料由于其化学、物理性固定化酶技术研究领域的重要课题。
天然多糖类化合物比较适合担当酶的载 PCVA 进行交联反应，得亲水性显著改善的球学报，1998(2):66-68.
体材料，此类材料具有无毒，传质性能好和丰富状载体，载体与胰蛋白酶进行偶联反应制备了 [5]潘丽军，陈实公，赵妍嫣.多孔淀粉接枝聚合
易的等特点，主要有壳聚糖、海藻酸钠和淀粉固定化胰蛋白酶，该固定化酶的比活大幅提高。物为载体固定化纤维素酶的研究[J].食品科学,
效果，近年来也有学者通过制备磁性壳聚糖微程度提高。
球固定化酶，从而达到比较好的分离效果。如王
2.3 无机载体
[8]钱军民，李旭祥.HEC/SiO2 凝胶复合物包埋固定化葡萄糖氧化酶的研究 [J]. 应用化学，2002,
斌等[3]利用反相总浮交联法制备磁性壳聚糖微
无机载体具有一些有机材料不具备的优 19(2)：153-157.
学等生命科学等领域的研究异常活跃，并得到对酶有一定的保护作用，易接枝，并对酶热处理丙烯酸羟乙酯的共聚体系中加人磁流体，制得
迅速发展和广泛的应用。在固定化酶技术中，载一段时间后，酶的活力最大可提高 40%，这为苯乙烯磁性微球，利用碳化二亚胺法固定中性
体材料的结构和性能对酶的活性保持及应用至工业应用提供了一条新途径。例如，以淀粉接枝蛋白酶，发现粒径越小，固定化酶的活性越高。

固定化酶与固定化细胞技术

固定化酶与固定化细胞技术酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，但通常指的是由氨基酸组成的酶，本章也仅探讨此类酶。

作为一种生物催化剂，参与生物体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变化。

由于酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。

但在常温常压条件下能高效地进行反应，且具有很高的专一性，副反应少，许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。

由于酶的这些特点，大大促进了酶的应用和酶技术的研究。

酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域，特别是近几年来，随着分子生物学的发展，酶的应用更加活跃。

由于酶反应随着时间的延长，反应速度会逐渐降低，反应后酶不能回收，这就限制了酶的应用范围。

如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶，仍具有催化作用，还能回收反复使用，并且生产可以连续化、自动化。

从20世纪60年代固定化酶技术发展以来，不仅在酶学理论研究中发挥独特作用，在实际应用中也显示出强大的威力。

随着技术的不断发展，广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等，固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。

对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂，要根据过程本身来决定。

一般来说，对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适；对多步转换，采用固定化细胞显然有利。

第一节固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。

酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。

固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等，颗粒状占绝大多数；颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，主要用于化学工业生产。

目前，由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越，人们对其极感兴趣，因此固定化酶的应用也与日俱增。

酶的固定化技术及其应用综述

酶的固定化技术及其应用曾鸿雁(西南科技大学,四川,绵阳)摘要:随着工业生物技术和酶工程的不断发展，酶在各个领域的广泛应用，对酶的要求也越来越严格。

本文针对目前酶工程技术之一酶的固定化，对酶的固定化技术及其展望做一综述。

关键词：酶，固定化，技术Immobilization of Enzyme And its Applications Abstract：with the continuous development of biotechnology industrial and enzyme engineering , enzyme are widely used in various fields and the requirements to enzymes also become more and more stringent . This article is to review the enzyme immobilization, which is one of the current enzyme engineering technologiesKey words: enzyme, immobilization, technology一、引言酶是一类具有生物催化性质的高分子物质，其催化性具有专一性强、催化效率高和作用脚尖温和等特点。

但是在实际工业生产中，由于实际环境因素，应用酶的过程出现了一些不足之处：①酶的催化效率不高。

人们在使用酶的过程中，往往要求酶的催化效率要足够高，以加快反应速度，提高劳动生产率，然而实际上很多酶的催化效率不够高而难于满足人们的使用要求。

②酶的稳定性较差。

大多数酶稳定性较差，在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素的影响下，都容易变形失活。

③酶的一次性使用。

酶一般是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混合在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。

生物化学第三版课后习题答案

第一章1. 举例说明化学与生物化学之间的关系。

提示:生物化学是应用化学的理论和方法来研究生命现象，在分子水平上解释和阐明生命现象化学本质的一门学科.化学和生物化学关系密切，相互渗透、相互促进和相互融合。

一方面，生物化学的发展依赖于化学理论和技术的进步，另一方面，生物化学的发展又推动着化学学科的不断进步和创新。

举例:略。

2.试解释生物大分子和小分子化合物之间的相同和不同之处。

提示:生物大分子一般由结构比较简单的小分子，即结构单元分子组合而成，通常具有特定的空间结构。

常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类和糖类。

生物大分子与小分子化合物相同之处在丁: 1) 共价键是维系它们结构的最主要的键;2)有一定的立休形象和空间大小; 3)化学和|物理性质主要决定于分子中存在的官能团。

生物大分子与小分子化合物不同之处在于: (1) 生物大分子的分子量要比小分子化合物大得多，分子的粒径大小差异很大; (2) 生物大分子的空间结构婴复杂得多，维系空间结构的力主要是各种非共价作用力; (3) 生物大分子特征的空间结构使其具有小分子化合物所不具有的专性识别和结合位点，这些位点通过与相应的配体特异性结合，能形成超分子，这种特性是许多重要生理现象的分子基础。

3. 生物大分子的手性特征有何意义?提示:生物大分子都是手性分子，这种结构特点在生物大分子的分子识别及其特殊的生理功能方面意义重大。

主要表现在: (1) 分子识别是产生生理现象的重要基础，特异性识别对于产生特定生物效应出关重要; (2) 生物大分了通过特征的三维手性空间环境能特异性识别前手性的小分子配体，产生专一性的相互作用。

4.指出取代物的构型：6.举例说明分子识别的概念及其意义。

提示: :分子识别是指分子间发生特异性结合的相互作用，如tRNA分子与氨酰tRNA合成醉的相互作用，抗体与抗原之间的相互作用等。

分子识别是生命体产生各种生理现象的化学本质，是保证生命活动有序地进行的分子基础。

酶的固定化技术及其应用

酶工程课程论文题目：酶的固定化技术及其应用学院：食品学院专业：食品科学与工程班级：食品101（35）2012-11-21酶的固定化技术及其应用摘要：酶的固定化技术是酶工程研究领域的一项重点和热点技术之一，酶的固定化技术可以显著提高酶的利用率，降低酶生产的成本。

本文主要研究酶的固定化技术，酶固定化的优缺点，以及在食品，医药，环境中的应用。

并对其研究的前景进行了简洁的预测。

关键字：酶固定化技术应用酶作为一种生物催化剂，因其催化作用具有高度专一性、催化条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。

但在使用过程中，人们也注意到酶的一些不足之处，如酶稳定性差、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。

因此为适应工业化生产的需要，人们模仿人体酶的作用方式，通过固定化技术对酶加以固定改造，来克服游离酶在使用过程中的一些缺陷。

固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。

与传统的酶相比，固定化酶具有游离酶所不可比拟的优点.同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；稳定性显著提高；可长期使用，并可预测衰变的速度；提供了研究酶动力学的良好模型等一系列的优点。

用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分离纯化后的酶，随着固定化技术的发展，也可采用含酶细胞或细胞碎片进行固定化，直接应用细胞或细胞碎片中的酶或酶系进行催化反应．由于微生物细胞可直接作为酶源，所以逐渐产生了固定化细胞技术．固定化细胞的优点是：(1)省去了酶分离纯化的时间和费用；(2)可进行多酶反应；(3)保持了酶的原始状态，从而增加了酶的稳定性．但固定化细胞与固定化酶相比，也存在一些不足之处：(1)因为产生副反应和所需生化产物的进一步代谢，使固定化完整细胞生产的产物纯度可能比固定化酶低；(2)细胞使用相当长的时间后，常常会发生自溶，尤其是在细胞有可能进行增殖时，细胞的漏出就特别明显：(3)单位体积反应器内固定化细胞的活性总是比相应的固定化酶活性低．酶的固定化方法主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法等。

固定化酶在食品工业中的应用

固定化酶在食品工业中的应用摘要：生物技术是当今迅速发展的高新技术领域，是21 世纪最具有发展潜力的新兴产业，涵盖了基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和生物化学工程。

固定化酶的研究源于80年前，但真正开展大量的研究是从20 世纪50年代初开始，近年来，固定化酶在食品、制药、化学分析、环境保护等方面的应用越来越广泛。

固定化酶技术是将酶用人工方法固定在特定载体上，进行催化、生产，因而固定化酶一般可以被认为是不溶性酶。

酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，进行特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术。

随着科学技术的进步、经济的发展和人民生活水平的提高，人们对食品的组成成分、营养价值和感官要求也越来越高，食品工业不再是传统农业食品的概念，工业食品将在人们日常生活中占据重要的地位。

固定化酶在理论与方法上的突飞猛进，推动、促进了生物技术从传统技术转化为高新技术，为食品工业的技术进步注入了新的活力。

固定化酶的研究不仅在化学生物学、生物工程医学及生命科学等领域异常活跃，而且因为其节省能源与资源、减少污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。

本文介绍了固定化酶的定义、优缺点和固定的方法，以及对其在食品工业中的应用进行总结，并对其将来的应用前景进行了展望。

关键词：固定化酶；食品工业；应用现状；前景展望一、固定化酶的定义和优缺点固定化酶技术是将酶用人工方法固定在特定载体上，进行催化、生产，因而固定化酶一般可以被认为是不溶性酶。

与水溶性酶相比，优点如下：( 1) 易于将固定化酶与底物、产物分开，方便后续的分离和纯化；( 2) 可以在较长时间内连续生产；( 3) 酶的稳定性和最适温度提高，最适pH值改变，对温度和pH值适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶敏感性降低；( 4) 酶反应条件容易控制；( 5) 较水溶性酶更适合于多酶反应；( 6) 可以增加产物的收率，提高产物质量；( 7) 酶的使用效率高，使用成本低；( 8) 适于产业化、连续化、自动化生产。

固定化胰蛋白酶的制备研究

固定化胰蛋白酶的制备研究介绍固定化胰蛋白酶是一种将胰蛋白酶通过某种方法固定在特定载体上的生物催化剂。

它具有较高的催化活性、较高的稳定性和重复使用性，因此在生物制药和食品工业等领域具有广泛的应用前景。

本文将对固定化胰蛋白酶的制备进行全面、详细、完整且深入地探讨。

固定化胰蛋白酶的制备方法1. 手工固定化方法1.1 离子交换法1.准备离子交换树脂，如聚对苯二甲酸乙烯酯。

2.将胰蛋白酶溶液加入固定床，与离子交换树脂发生离子交换作用。

3.用缓冲液冲洗离子交换树脂上未固定的胰蛋白酶。

4.获得固定化胰蛋白酶。

1.2 化学交联法1.准备交联剂，如戊二醛。

2.将胰蛋白酶溶液与交联剂反应。

3.获得固定化胰蛋白酶。

2. 免疫固定化方法2.1 抗体固定化法1.准备抗体固定床，如琼脂糖凝胶。

2.将抗体溶液涂覆在固定床上。

3.将胰蛋白酶溶液加入固定床，与抗体发生免疫反应。

4.获得固定化胰蛋白酶。

2.2 酶联免疫固定化法1.准备带有胰蛋白酶结合位点的抗体。

2.将带有胰蛋白酶的底物与抗体结合。

3.获得固定化胰蛋白酶。

固定化胰蛋白酶的性质研究1. 催化能力通过将固定化胰蛋白酶与游离胰蛋白酶进行比较，研究固定化胰蛋白酶的催化能力。

2. 热稳定性通过将固定化胰蛋白酶在不同温度下进行催化反应，研究其热稳定性。

3. pH稳定性通过将固定化胰蛋白酶在不同pH值的缓冲液中进行催化反应，研究其pH稳定性。

4. 反复使用性通过多次使用固定化胰蛋白酶进行催化反应，并与游离胰蛋白酶进行比较，研究其反复使用性。

固定化胰蛋白酶的应用前景1. 生物制药固定化胰蛋白酶可以用于生产生物制药产品，如蛋白药物的制备过程中的降解杂质的去除。

2. 食品工业固定化胰蛋白酶可以用于食品工业中的蛋白质加工过程，如发酵面包的制备。

3. 污水处理固定化胰蛋白酶可以用于污水处理中蛋白质的降解过程，提高污水处理效率。

4. 医学检测固定化胰蛋白酶可以用于医学检测中的蛋白质测定，如血清蛋白质的检测。

固定化酶技术

固定化酶在食品中的运用摘要:固定化酶有许多优点，尤其是稳定性和可重复使用性使其在许多领域得到广泛应用。

固定化酶技术是一门交叉学科技术，目前已得到长足的发展。

介绍了固定化酶制备的传统方法以及一些新方法，同时对酶在一些性能优良的载体上的固定进行了综述。

关键词：固定化酶；制备；载体酶是由活细胞产生的一类特殊的蛋白质催化剂(核酶除外)，具有催化效率高、底物高度专一、反应条件温和、反应容易控制等特点。

酶的最大缺点是其不稳定性，在酸、碱、热及有机溶剂中易发生变性，活性降低或丧失；而且酶反应后，会在溶液中残留，造成酶反应难以连续化、自动化，同时也不利于终产品的分离提纯，这些都大大阻碍了酶工业的发展，所以有必要采取酶工程技术改善这些缺点。

酶工程技术措施较多，其中酶的固定化技术是重要举措之一。

酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上或使酶与酶相交联，酶被限定在一定区域内，但仍保持原有高效、专一、条件温和的催化功能。

通常酶是游离的，而经过固定化以后，酶被束缚在一定区域内，因而这样的酶被称为固定化酶。

固定化酶在生物、医药、农业、食品、化工、能源开发、环境保护等方面得到了广泛应用。

本文介绍了固定化酶的制备方法和优缺点，对其在食品行业中的应用情况进行总结，最后对其应用前景进行展望。

1固定化酶的制定方法[1-5]1.1吸附法吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法。

吸附法较简便，酶活损失小，但酶与载体作用力小，易脱落。

物理吸附法是通过非特异性物理吸附作用，将酶固定到载体表面。

载体主要有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高岭土、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、陶瓷、金属氧化物、淀粉、白蛋白、大孔树脂、丁基或己基—葡聚糖凝胶、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。

离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体通过静电作用相结合的一种固定化方法。

载体包含阴离子交换剂(如DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、纤维素-柠檬酸盐、TEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、IRA-410、IRA-900等)和阳离子交换剂(如CM-纤维素、Amberlite CG-50、IRC-50、IR-45、IR-120、IR-200、XE-97、Dowex-50等)两大类。

酶的固定化..

将与载体反应的功能基团与各种
纤维素
CMC －CH2COOH
+盐酸甲醇
CMC－甲酯＋肼制备酰肼 CMC－酰肼亚硫酸钠＋盐酸 CMC－叠氮化物＋NH2 酶
重氮化剂、烷化
剂等反应形成共价键制备固定化
酶。
叠氮化物
固定化酶－CH2CO-NH 酶
羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序
共价键结合法
4.包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。载体：琼脂、海藻酸钠、明胶聚丙烯酰胺等包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊法。凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微
孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。
2)、制备固定化酶遵循基本原则：
（1）必须注意维持酶的催化活性及专一性。（ 2 ）固定化应该有利于生产自动化、连续化。（3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。（4）酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于重复使用。（5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。（6）固定化酶成本要低，以利于工业使用。
微胶囊法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球
内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。
包埋法
凝胶包埋法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）
丙烯酰胺
氢气
固定化酶
光照切割聚合反应凝胶酶块
酶液
N， N－双丙烯酰胺

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第1页
1 内容摘要亲和层析包含了一整套复杂底物及其配体与生物大分
子之间相互作用时所形成独特生物学特征。在亲和结合过程中包括到疏水力、静电力、范德华力及空间阻力等原因影响。
亲和层析概念能够了解为配基以共价键形式与水不溶性固体载体共价结合，形成含有高度专一性亲和吸附剂。以该介质为填料填充亲和层析柱，从复杂混合物中有针对性分离某一个成份。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第4页
1. 3试验流程
鸡蛋清
Spharose 4B
猪胰脏
↓
↓
↓
提取
↓ 分离纯化
活化 ↓
提取 ↓
↓ 纯卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose 4B 胰蛋白酶原粗提液
↓ 偶联
↓ 激活
↓
↓
CHOM-Spharose 4B →← 胰蛋白酶提取液
↓ 亲和层析
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第2页
本试验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目标，
从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高
胰蛋白酶。围绕亲和层析试验所包括蛋白质和酶基础性质
及相关技术进行综合训练。其中主要包含亲和层析介质配
基制备，亲和介质合成，蛋白质和酶分离纯化，酶活性测
定等内容。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
经过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备基础原理和
操作，学习怎样进行试验设计，掌握试验过程中关键步骤，
对试验中出现问题进行科学分析。使学生在学习试验技术
同时，自觉培养分析问题和处理问题能力。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介

固定化胰蛋白酶的制备研究

固定化胰蛋白酶的制备研究
张黎明;袁永俊;徐梦虬
【期刊名称】《食品与发酵科技》
【年(卷),期】2009(045)002
【摘要】以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂,采用交联-吸附法对胰蛋白酶的固定化条件进行了初探.实验结果表明:酶用量、戊二醛浓度、pH值、温度等对壳聚糖微球固定化的胰蛋白酶活力有显著影响,最适固定化条件为:壳聚糖0.125 g、酶用量14 mg,交联剂浓度0.2%(v/v),pH值7.5,田定化温度35℃,交联时间2 h,吸附时间5 h.在此条件下酶活力回收率为76.57%.
【总页数】4页(P18-21)
【作者】张黎明;袁永俊;徐梦虬
【作者单位】西华大学生物工程学院,四川成都,610039;西华大学生物工程学院,四川成都,610039;西华大学生物工程学院,四川成都,610039
【正文语种】中文
【中图分类】TQ925;TQ93
【相关文献】
1.可溶性固定化胰蛋白酶的制备及性质研究 [J], 张涛;刘桦;王玉明
2.固定化胰蛋白酶水解乌鸡肉制备功能肽的研究 [J], 苗敬芝;吕兆启;高明侠;曹泽虹;董玉玮
3.固定化胰蛋白酶水解花生蛋白制备多肽的研究 [J], 高明侠;苗敬芝;曹泽虹;董玉玮;吕兆启
4.壳聚糖固定化胰蛋白酶制备牡蛎肽的研究 [J], 牛红鑫;陆峻宇;李亚楠;王明玉;张横;贾美娜;佟长青;李伟
5.壳聚糖固定化胰蛋白酶制备魁蚶肽的研究 [J], 张金铃;迟海;李伟;金桥;佟长青因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

酶的固定化

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吸附法包埋法共价结合法通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法. 只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触,再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶.是最简单的固定化技术,在经济上也最具有吸引力.
常用的固体吸附剂有活性炭,氧化铝, 活性炭,氧化铝, 活性炭硅藻土,多孔陶瓷,多孔玻璃,硅胶, 硅藻土,多孔陶瓷,多孔玻璃,硅胶,羟基磷灰石等. 基磷灰石操作简便,条件温和,不会引起酶变性失活,载体廉价易得,而且可反复使用由于靠物理吸附作用,结合力较弱结合力较弱,酶结合力较弱与载体结合不牢固而容易脱落,所以使用受到一定的限制.
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂. 世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAE-Sephadex A-25吸附的氨基酰化酶反应用于 DL-AA的光学分析.
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2,包埋法(Entrapment) 包埋法(Entrapment)
包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内,格子的结构格子可以防止酶渗出到周围的培养基中, 可以防止酶渗出到周围的培养基中,而底物分子仍能渗入格子内与酶接触. 入格子内与酶接触. 包埋类型可有:网格型,微囊型及脂质体液膜型. 包埋类型可有:网格型,微囊型及脂质体液膜型.
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根据吸附剂的特点又分为两种: 根据吸附剂的特点又分为两种:
物理吸附法是通过氢键,疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载
体的方法. 常用的载体有:高岭土,皂土,硅胶,氧化铝,磷酸钙胶,微空玻璃等无机吸附剂,纤维素,胶原以及火棉胶等有机吸附剂. 离子结合法是指在适宜的pH和离子强度条件下,利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法 (离子键). 最常用的交换剂有CM-纤维素,DEAE-纤维素,DEAE葡聚糖凝胶等;其他离子交换剂还有各种合成的树脂如 Amberlite XE-97,Dowe X-50等.

动物胰蛋白酶的纯化、性质及其固定化研究进展

动物胰蛋白酶的纯化、性质及其固定化研究进展王卿惠;徐兴军;邵淑丽;田金波;张伟伟;王有祥;薛明强【摘要】根据近年国内外胰蛋白酶最新研究报道,综述了动物胰蛋白酶的研究进展,包括酶的纯化、特性以及酶的固定化,以期为胰腺蛋白酶的研究、开发和利用提供一定的参考.【期刊名称】《高师理科学刊》【年(卷),期】2016(036)012【总页数】6页(P39-44)【关键词】动物;胰蛋白酶;纯化;固定化【作者】王卿惠;徐兴军;邵淑丽;田金波;张伟伟;王有祥;薛明强【作者单位】齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006【正文语种】中文【中图分类】Q955胰蛋白酶（trypsin，EC3.4.21.4）广泛应用于轻工业、医药工业、食品加工业、畜牧业和现代生物技术等领域，日益成为研究热点.作为丝氨酸蛋白酶家族的成员之一，胰蛋白酶激活前常以酶原前体形式存在.胰蛋白酶原前体[1]含有一段由15个氨基酸组成的信号肽序列和一个由6～8个氨基酸组成的激活肽（TAP）序列.若信号肽序列被结合于内质网膜上的信号肽酶切除，则胰蛋白酶原前体转变成胰蛋白酶原；若其中的激活肽序列再被肠肽酶水解掉，最后转变为具有活性的胰蛋白酶.胰蛋白酶属于内肽酶，主要水解Arg或Lys赖氨酸羧基端的具有高度专一性的肽键.胰蛋白酶具有“双重”作用，它不仅可以消化普通蛋白质，还可以激活胰腺分泌的其它酶原[2]，在蛋白质水解方面发挥重要的作用.大多数脊椎动物体内的胰蛋白酶以上述形式被活化，而对于在无脊椎动物（如昆虫及甲壳动物），其激活机制可能是“自我活化”[3].但Buettner K[4]研究发现，人类胰蛋白酶原的激活也存在“自我活化”现象.1.1 胰蛋白酶催化特点胰蛋白酶一般存在于高等动物胰液和低等动物胃液中，也广泛存在于鸟类的肝脏、胰腺和肠道内.其催化特点为：（1）无需提供能量；（2）有高度的专一性；（3）底物与酶的活性中心结合是可逆的，这种结合使得蛋白质特定肽键因弯曲变形更易于受到水分子攻击.1.2 胰蛋白酶活性测定由于胰蛋白酶不仅能催化由碱性氨基酸（Arg，Lys）的羧基与其它氨基酸的氨基形成的肽键，还能催化由碱性氨基酸的羧基形成的酰胺键或酯键.因此，若以含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物，便可通过测定产物的变化来测定胰蛋白酶的活力.目前常用的底物包括苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（BAPA，NAPNA）、苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（BANA）、苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）以及对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME）.以BAEE为底物，在253 nm下测定反应产物的吸光值变化，一般吸光值每升高0.001即为一个胰蛋白酶酶活单位（1 μmol/min）.张东裔[5]等选用TAME作为底物，由于该底物受胰蛋白酶作用后转变成对甲苯磺酞基精氨酸，使反应混合物的pH值下降；以酚红为指示剂，通过测定555 nm 处光吸收值降低来监测pH值变化，在0.001～0.3 μg范围内，胰蛋白酶含量与光吸收值降低呈线性关系，从而可以用光吸收值降低值表示胰蛋白酶的相对酶活力.朱忠胜[6]等对菲牛蛭（Poecilobdella）不同生长阶段幼体组、亚成体和成体组及摄食前后的消化酶活性进行了测定，发现亚成体组胰蛋白酶活力最强.甘丽萍[7]等调查家蚕幼虫（Bombyx mori）胰蛋白酶活性，探讨了其与丝氨酸蛋白酶基因表达之间的关系.张建萍[8]等采用紫外线吸收法测定了塔里木兔（Lepus yarcandensis）和家兔（Oryctolagus curiculus）胰蛋白酶活力.结果表明，家兔胰腺和肠道胰蛋白酶活性高于塔里木兔.可见，胰蛋白酶活性的有效测定为研究动物生理和酶基因表达提供了前提条件.福林酚试剂[9]在碱性条件下可以被酚类化合物还原为蓝色物质（钼蓝和钨蓝混合物），由于蛋白质含酚基氨基酸，因此可以利用此原理测定蛋白酶活力.Dong M[10]最新采用7肽（CRRRRRR）底物建立一个简单敏感的胰蛋白酶测定的电化学方法.在方波内金属钌电极的伏安电流增加与胰蛋白酶活性在0.004 7～0.052 0 μmol/min/mL范围内成线性关系.可见，测定胰蛋白酶的关键是选择合适的底物，然后用胰蛋白酶催化，找出产物的变化规律与胰蛋白酶活性的相关性，用产物或产物引起的直接能测定的参数变化来表示胰蛋白酶的活性.2.1 胰蛋白酶提取从动物胰脏中分离、提取胰蛋白酶时，一般需几个连续的步骤：（1）用稀酸将酶原从胰腺细胞中抽提出来；（2）调节pH值至等电点，去除酸性杂蛋白；（3）硫酸铵分级沉淀胰蛋白酶原；（4）酶原用极少量活性胰蛋白酶激活；（5）再次盐析除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶；（6）收集胰蛋白酶组分获得粗品.2.2 胰蛋白酶纯化动物胰蛋白酶纯化方法改进的几个实例见表1.由表1可见，为了获得更纯的酶，一般需要过色谱柱.在纯化胰蛋白酶时，可以先活化后层析；也可以先层析后活化[11]41-42.为避免糜蛋白酶等非特异性酶切，常需要对胰蛋白酶进行修饰[12].表1在纯化猪胰蛋白酶时使用了反相层析.所谓正相和反相主要是由固定相和流动相极性大小决定的.正相柱的固定相极性大于流动相，反相柱则相反.因此，正相柱是极性小的先出峰，反相柱是极性大的先出峰[13]79-80.DEAE-纤维素柱层析属于阴离子交换层析，一般分离时碱性蛋白先出峰，酸性蛋白后出峰.苯甲脒类物质是胰蛋白酶的广谱抑制剂，苯甲脒类可以先偶联到琼脂糖凝胶6B上，然后对胰蛋白酶样品进行纯化.该方法流速高，非特异吸附少，填料粒度均匀，分离效果好，是纯化胰蛋白酶最适合的填料[14]3-8.另外采用先凝胶过滤后离子交换方法的顺序效果也很好[15]126-132.2.3 胰蛋白酶的酶学性质胰蛋白酶纯化方法的改进有重要意义，高纯度胰蛋白酶的获得是研究其酶学性质的关键.几种鱼类胰蛋白酶的纯化、性质及催化动力学研究见表2.比较Khangembam[14]8-12和Liu Chun-Hung[16]839-841研究的胰蛋白酶纯化结果可以发现，纯化的倍数越高，得率越小.因此，高纯度酶的获得是以“牺牲”胰蛋白酶为代价的.水产鱼类中胰蛋白酶分子量范围一般在20～30 kDa之间.根据文献[18]报道，2种不同鳕鱼（Gadus macrocephalus和Eleginus gracilis）的胰蛋白酶分子量均为24 kDa，与鲑点石斑鱼的胰蛋白酶分子量一致.陈荣昌[19]等纯化的2种青鱼分子量分别为44 kD和43.5 kD.研究发现，EDTA对青鱼胰蛋白酶的抑制作用很大，推测该酶可能为金属蛋白酶.对于哺乳动物而言，胰蛋白酶分子量大小也在20～30 kDa范围内，如牛胰蛋白酶分子量为23.3 kDa，猪胰蛋白酶为24.0 kDa[20].相比之下，鸟类胰蛋白酶的分子量可能要大一些，如岑亮[21]等从鸭肝中获得的胰蛋白酶相对分子量为35 kDa.一般哺乳动物胰蛋白酶的最适温度接近体温，如丁凌霄[11]等研究的猪胰脏酶最适温度为37 ℃.然而鱼类的最适温度比较高，在40～55 ℃之间.吴志强[22]研究表明，日本新糠虾蛋胰蛋白酶最适反应温度为37 ℃，接近哺乳动物胰蛋白酶的最适温度.鱼类的最适pH值为7～10之间.但哺乳动物胰蛋白酶pI一般为8.0～9.0，属于碱性蛋白酶；鱼类胰蛋白酶的pI为4.5～6，属于酸性蛋白酶.虾类胰蛋白酶的pH值为2～6，酸性更加明显.在使用SDS-PAGE电泳对获得的胰蛋白酶纯品进行初步验证的基础上，一般需要进一步采用埃德曼反应（Adman reaction）对蛋白质的N-端进行测序，从而更准确地通过比对（blast）来鉴定所得胰蛋白酶与其它胰蛋白酶的亲源关系.也可以对蛋白质样品作质谱（MS）分析，通过获得“小肽片段”对纯化的胰蛋白酶加以鉴定.从表2中可知，大多数胰蛋白酶的蛋白质N-段都存在IVGG 4个氨基酸高度保守的序列，这可以作为鉴定胰蛋白酶的特异标记序列.根据文献[14]报道，填加2mM CaCl2保温8 h能提高胰蛋白酶活力，可见Ca2+对胰蛋白酶有稳定作用.Liu Chun-Hung[16]842-846等使用BAEE为底物，发现胰蛋白酶活性随NaCl浓度（0～0.6 M）的增加而减小.Khaled[15]125-127使用BAPNA为底物，研究了金色小沙丁鱼胰蛋白酶的动力学.不同酶的Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同.因此，在计算Km值时，要考虑到所选择的底物.Km值可近似反映出酶与底物亲和力的大小：Km值越大，表明酶与底物的亲和力越小.结合表2可知，卡特拉鱼（Catla Catla）胰蛋白酶对底物的亲合最大（Km=0.062）.对于金色小沙丁鱼（Sardinella aurita）的胰蛋白酶而言，尽管有3种同工酶亚型A，B，C，而且分子量、最适pH值和温度都相同，但N-端氨基酸序列和动力学参数皆不相同，说明3种酶的催化效率不同.这可能是3种酶细微的氨基酸序列或种类不同所至.总之，在研究胰蛋白酶的酶学性质时，不仅要研究酶的分子量、最适温度、最适pH值以及酶的动力学参数变化，也要对酶的一级结构进行分析，从而研究酶的构效关系.2.4 影响胰蛋白酶活性的因素不同金属离子以及不同的理化处理可以改变胰蛋白酶的结构和催化性质.2.4.1 重金属离子对胰蛋白酶的影响金属离子（如Cd2+，Al3+，Zn2+，Cu2+，Pb2+，Hg2+）可能是胰蛋白酶的抑制剂.研究金属离子对酶的影响可使用多种技术和方法：（1）同步扫描荧光光谱技术（SFS）；（2）紫外可见吸收；（3）圆二色（CD）光谱法；（4）等温滴定量热法（ITC）；（5）酶活试验等.Zhang Tong[9]1805-1807等调查了Cu2+，Pb2+，Zn2+等离子对胰蛋白酶毒性产生的原因.研究发现，重金属的毒性效应应归于本身的特性而非所带有的电荷.Zn2+对胰蛋白酶没有明显影响；Cu2+和Pb2+直接损伤酶的结构和功能；Cu2+能够和胰蛋白酶结合，从而导致胰蛋白酶的荧光淬灭并使其疏水性增加；高浓度的Pb2+也能改变胰蛋白酶的结构，减少胰蛋白酶的活性.同时发现，对胰蛋白酶活性的影响按Cu2+>Pb2+>Zn2+的顺序逐渐减弱.等温滴定量热学分析表明，这些重金属离子与胰蛋白酶之间的相互作用是自发的和放热的，说明它们对胰蛋白酶具有抑制作用.2.4.2 物理因素对胰蛋白酶的影响及原因采用超高压技术处理胰蛋白酶可以改变其空间结构，从而可以研究酶空间结构变化与酶活力之间的关系.对胰蛋白酶二级结构变化的观察可以采用傅立叶红外光谱；对其三级结构的变化研究可以采用荧光光谱；测定酶活性的变化可以使用福林酚法.刘平[23]等对超高压（100～600 MPa）处理后的胰蛋白酶进行了研究.结果发现，与未处理的相比，超高压对胰蛋白酶活力影响显著.通过300 MPa处理，胰蛋白酶活力提高了0.386倍.此时胰蛋白酶的α-螺旋与β-转角的峰面积比值达到最大，荧光强度达到最高.超声波对胰蛋白酶也有影响.黄卓烈[24]等研究发现，超声波处理使胰蛋白酶活力普遍升高，Km值变小，Vmax值也降低，酶对底物的亲和力增大.2.4.3 化学因素对胰蛋白酶的影响张国文[25]等研究发现，邻苯二甲酸二丁酯（DBP）通过氢键和范德华力与胰蛋白酶形成基态复合物而淬灭胰蛋白酶的内源荧光.DBP与胰蛋白酶的结合使酶的α-螺旋、β-折叠和β-转角含量减少，使无规卷曲的含量增加，从而使蛋白质聚集.分子模拟结果表明，DBP结合于胰蛋白酶S1疏水空腔附近，与氨基酸His57，Ser195和Gly193形成氢键，从而抑制了胰蛋白酶活性.吐温（或聚山梨酯）为非离子型表面活性剂，是一系列聚氧乙烯去水山梨醇的部分脂肪酸酯.宋九华[26]等通过紫外和荧光光谱法研究了吐温与牛胰蛋白酶之间的相互作用.研究发现，吐温与牛胰蛋白酶主要表现为疏水作用力，对牛胰蛋白酶活性影响较少.但它们之间的相互作用能改变牛胰蛋白酶分子中的芳香族氨基酸残基在酶空间结构中所处的微环境，使微环境的疏水性增强.吐温对牛胰蛋白酶荧光淬灭效应起因于牛胰蛋白酶与吐温形成了复合物，能量转移作用较小，属于静态淬灭.由于液相胰蛋白酶存在严重自溶、解折叠作用，限制了胰蛋白酶在生产上的直接应用.而酶固定化技术能使胰蛋白酶稳定性增加并可重复利用，从而为胰蛋白酶在生产上更广泛地应用开辟了道路.固定化酶就是采用理化方法，使酶与载体结合或把酶包埋在其中，形成凝胶或半透膜微囊体.固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类，前者包括物理吸附法和包埋法等.安红[27]等采用吸附法对胰蛋白酶在磁性核壳介孔分子筛（Fe3O4·MCM-41）上的固定化进行了研究，发现与游离酶相比，固定化酶的耐温区间和pH值适应范围明显变宽，载体能保持良好介孔结构.孙俊[28]等通过静电相互作用，将胰蛋白酶固定于羧甲基壳聚糖磁性纳米颗粒（Fe3O4（PEG+CM-CTS））表面.结果表明，纳米颗粒对胰蛋白酶的吸附符合Langmuir等温吸附模型，载体对胰蛋白酶的最大固载量达117.6 mg/g，剩余的相对酶活性高达87.9％.固定化酶具有良好的操作稳定性和较高的储藏稳定性.Maciel[29]经Fe3+共沉淀以及采用聚苯胺将胰蛋白酶包裹合成磁性纳米颗粒，平均直径大约15 nm，以相对高自发磁化方式表现出磁化行为，主要以磁赤铁矿（γFe2O3）形式存在.固定化胰蛋白酶活性进一步提高，达到为原始活性的89％.化学法包括结合法和交联法，结合法又分为离子结合法和共价结合法.阮贵华[30]等以多孔介质材料Fe3O4·mSiO2·nSiO2为载体，采用γ-氨丙基三乙氧基硅烷接枝和戊二醛交联方法对胰蛋白酶进行了固定化.研究表明，φ（戊二醛）=1.875％，给酶量为0.3 mg/mL，反应时间为4 h时酶的固定化效率可达50.5％，酶保留了77.3％的活性.Song X[31]使用静电纺丝技术，将胰蛋白酶嵌入聚L-乳酸（PLLA）中，获得活性纳米纤维，可用于水解明胶.为改进被聚L-乳酸纳米纤维包合胰蛋白酶（NF-TR）稳定性和酶催化效率，在纤维表面使用戊二醛将胰蛋白酶分子交联起来形成（CL-TR）.在严峻的条件（50 ℃）下，CL-TR比NF-TR显示了更好明胶水解能力，从而改善了CL-TR催化能力和稳定性.胰蛋白酶被PLLA纳米纤维表面交联而固定，胰蛋白酶的变性、自溶和沥滤受到抑制，从而使酶的性质得到改善.LI Valuev[32]最新研究发现，丙烯酰胺水凝胶固定化胰蛋白酶活性依赖于水溶胶膨胀率、孔径分布和酶结合方式.影响胰蛋白酶固定化制备的因素很多，包括载体材料结构和性能、固定化方法、位点和条件等，其中载体选择和方法是固定酶制备的关键.酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用，便于运输和贮存，有利于自动化生产.固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有较好的应用前景.但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间.总之，采取各种有效的层析方法对胰蛋白酶进行提取和纯化，是研究胰蛋白酶酶学性质的基础.在此基础上，研究各种理化因素对胰蛋白酶的影响为深刻认识胰蛋白酶结构和功能的“构效关系”提供了重要的科学数据.胰蛋白酶的固定化是提高胰蛋白酶稳定性的重要手段，将在工业上胰蛋白酶的开发和利用方面发挥重要作用，具有潜在的应用价值.随着固定化方法的改进，必将获得酶活性更高、稳定性更好的固定化胰蛋白酶，并应用于生产中以创造更高的经济价值.【相关文献】[1]Psochiou E，Sarropoulou E，mamuris Z，et，al.Sequence analysis and tissue expression pattern of sparus aurata chymotrysinogens and trypsinogen[J].Comp Biochem Physiol，2007，147（3）：367-377[2]Darias M J，Murray H M，Gallant J W，et al.The spatiotemporal expression pattern of trypsinogen and bile salt-activated lipase during the larval development of red porgy （Pagrus pagrus，pisces，Sparidae）[J].Mar biol，2007，152（1）：109-118[3]王镜岩.生物化学[M].北京：高等教育出版社，2002[4]Buettner K，Kreisig T，Sträte N，et al.Protein surface charge of trypsinogen changesits activation 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固定化酶的比较

A Com par ison of Phenyla lan ine Amm on ia - lya ses I mm ob il ized by D ifferen t M ethods
W AN G X iao 2hua, SU H a i2x iang
Guang z h 510182, C h ina
・122・丙烯酸所需的酶量为一个活性单位。
2. 2 苯丙氨酸测定用荧光法。 2. 3 蛋白质含量测定: 用改良 L ow ry 氏法。 2. 4 固定化偶联率测定分别测定固定化加样中
肿瘤防治研究 2001 年第 28 卷第 2 期
胆固醇、磷脂酰丝氨酸 CHOL = 7 ∶ 2 ) ; C: 卵磷脂、 ( PC ∶CHOL ∶PS= 7∶2∶1) A 、 B、 C 配方分别溶于氯仿溶液 ( 100m g m l) 。采用三种方法制备脂质体, 超声法得单片层小囊泡脂质体。复乳法又称双乳化法。脱水再加水法[ 8 ] 得单片层大囊泡脂质体。 2. 6. 4 固定化细胞将经 L 2Phe 诱导培养的深红酵母细胞收集后, 立即悬浮于 pH 7. 4、 0. 05 m o l L T ris2HC l 缓冲液中 ( 3g 湿细胞 10m l) , 缓慢加入 20 倍体积210℃预冷的丙酮, 剧烈搅拌 15m in, 5000 ×g 离心 20m in, 收集细胞, 以上述缓冲液洗涤三次, 除去剩余丙酮, 冷冻干燥贮存。对照采用同期培养的细胞, 离心收集以缓冲液洗涤三次后冻干贮存。处理后细胞在人工肠液 ( 按 85 年版中国药典配制) 中对 L 2苯丙氨酸的降解作用: 取处理后细胞0. 2 g, 置含 0. 2mm o l L L 2Phe 的人工肠液 20m l 中, 于恒温振荡器 37℃模拟肠蠕动, 共 4h r. , 每小时取 1m l, 8000×g 离心 20m in, 测上清液中 L 2Phe 含量, 对照用未经处理细胞, 方法同上。处理后细胞在人工肠液中的抗胰蛋白酶试验: 取处理后细胞 0. 2g, 加人工肠液 20m l, 37℃模拟肠蠕动, 共 4h r. , 每小时取 1m l, 8000 ×g 离心 20m in, 收集细胞, 超声破膜, 再离心, 取上清测 PAL 活性及蛋白含量。对照用未经处理的酵母细胞 0. 2g, 加 0. 05 m o l L PB S 1m l, 先超声破膜后再加入 pH 6. 8、人工肠液 20m l, 同上孵育, 定时取样, 测定。 3 结果 3. 1 包埋法偶联率及活性保留百分数见表 1, 结果表明: 采用 T ∶C 比为 8 ∶30 时固定化酶不仅偶联率高且活性明显高于 T ∶C 比为 8∶19。

化学生物学小论文-胰蛋白酶的研究及应用

化学生物学论文班级：2009级化学生物学班姓名：学号：胰蛋白酶的研究及应用摘要:以胰蛋白酶为例研究酶的结构与功能。

酶学知识来源于生产与生活实践。

我们祖先很早就会制酱和酿酒。

西方国家于1810年发现酵母可将糖转化为酒精；1833年，Payen及Persoz 从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到一种热不稳定物，可使淀粉水解成可溶性糖；1878年德国科学家屈内（Kuhne）首先把这类物质称为酶（enzyme，其意“在酵母中”）。

1860年法国科学家巴斯德（Pasteur）认为发酵是酵母细胞生命活动的结果，细胞破裂则失去发酵作用。

1897年，Buchner兄弟首次用不含细胞的酵母提取液实现了发酵，证明发酵是酶作用的化学本质，获得1911年诺贝尔化学奖。

1926年，美国生化学家Sumner第一次从刀豆得到脲酶结晶，并证明是蛋白质。

1930年，Northrop得到胃蛋白酶的结晶（1946年二人共获诺贝尔化学奖）。

1963年测定第一个牛胰RNaseA序列（124aa）；1965年揭示卵清溶菌酶的三维结构（129aa）。

酶是由活细胞合成的，对其特异底物起高效催化作用的生物催化剂（biocatalyst）。

已发现的有两类：主要的一类是蛋白质酶（enzyme），生物体内已发现4000多种，数百种酶得到结晶。

美国科学家Cech于1981年在研究原生动物四膜虫的RNA前体加工成熟时发现核酶“ribozyme”，为数不多，主要做用于核酸（1989年的诺贝尔化学奖）。

酶所催化的反应称为酶促反应。

在酶促反应中被催化的物质称为底物，反应的生成物称为产物。

酶所具有的催化能力称为酶活性。

酶作为生物催化剂，具有一般催化剂的共性，如在反应前后酶的质和量不变；只催化热力学允许的化学反应，即自由能由高向低转变的化学反应；不改变反应的平衡点。

但是，酶是生物大分子，又具有与一般催化剂不同的特点。

一、单纯酶和结合酶单纯酶是仅由肽链构成的酶。

如脲酶、一些消化蛋白酶、淀粉酶、脂酶、核糖核酸酶等。