酶的固定化 优秀课件

1）凝胶包埋法（网格型） ➢ 将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制
成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称 为凝胶包埋法。
➢ 首先被采用的网格包埋法是： 固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 －淀粉酶
✓ Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺 ✓ 引发剂－－inactiation
D．溴化氰法
➢ 本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类（含有 羟基）物质（如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中 以琼脂糖为载体的占多数<大孔网状结构>），生 成亚氨基碳酸衍生物。
D ．溴化氰法 ➢ 亚氨基碳酸基团在微碱性条件下，可与酶分子上的
氨基反应，制成固定化酶。
D ．溴化氰法 ➢ 用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使
实验 木瓜蛋白酶的固定化
➢ 酶的固定化步骤： （1）每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6% CaCl2溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室温下 保温10s左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。取出 后用水冲去污物，用吸水纸吸干。 （2）将尼龙布用3.65mol/L HCl溶液在室温下水解 45min，用水洗至pH值中性。 （3）将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联 20min。
2736.9
纯化倍数 Purification
(fold)
收率 Yield (%)
1 100
10.9 13080.2 4.8 30
2.0
23314.5 8.5 10
0.3 140726.7 51.4
9
实验 木瓜蛋白酶的固定化
➢ 实验原理： ✓ 载体：尼龙 ✓ 固定化方法：共价结合法
➢ 尼龙长链中的酰胺键经HCl水解后，产生游离的NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一 个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与 酶中的游离氨基缩合，形成尼龙(载体)-戊二醛(交 联剂)-酶，即尼龙固定化酶。
酶的固定化 优秀课件
游离酶的缺点
➢ 酶的稳定性差，易受外界因素影响而失活 ➢ 酶不易回收利用（酶的一次性使用） ➢ 产物不易分纯，且难连续化生产 ➢ 酶的催化效率不够高
Contents of chapter 5
➢ 概述 ➢ 第一节 酶固定化 ➢ 第二节 细胞固定化 ➢ 第三节 原生质体固定化
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2 . 什么是固定化酶？
用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。
共价结合法中载体的活化方法
➢ 重氮法 ——含有苯氨基（亚硝酸） ➢ 叠氮法 ——含有酰肼基/羧基（亚硝酸） ➢ 烷基化法 ——含有羟基（三氯三嗪等多卤代物） ➢ 溴化氰法 ——含有羟基（溴化氰活化）
2）交联法 ➢ 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成
活 水不溶性 化
载体
基
团
固定化酶
酶 的 水溶固性酶 定
化
固定化酶概念 ➢ 指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催
化反应的酶。 ➢ 通过吸附、偶联、交联、包埋等物理或化学的方法
制备成的具有催化活性的水不溶性酶。
2. 固定化酶的制备方法
非共价 结合法
固定化 方法
化学 结合法
包埋法
吸附法
离子键结合法 共价键结合法 交联法 凝胶包埋法 半透膜包埋法
② 与载体共价结合的酶的功能基团 ε-氨基，α-氨基，α,β或γ位的羧基、巯基、羟基、咪 唑基、酚基等。
③载体
天然有机载体（多糖、蛋白质、细胞等） 无机物（玻璃、陶瓷等） 合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等） ④优缺点 ⅰ.优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高 或存在盐类等原因而轻易脱落。 ⅱ.缺点：反应条件苛刻，操作条件复杂；
2）半透膜包埋法（微囊型） ➢ 将酶或含酶细胞包埋在高分子半透膜中的固定化方
法。
界面聚合法
➢ 是用化学手段制备微囊的方法。利用亲水性单体和 疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体 而将酶包裹起来。
（3）结合法 1）共价结合法 ☆
通过共价键将酶与载体结合的方法。 ① 结合方法
ⅰ.将载体有关基团活化，然后将酶有关基因发生偶 联反应；
（4）热处理法 ➢ 将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶
稳定在菌体内，而制备得到固定化菌体。 ➢ 热处理法只适用于热稳定性较好的酶的固定化，在
热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引 起酶的变性失活。
下表是某酶的纯化总结表，试计算比活力，回收率及纯化倍数。
步骤 step
粗酶 乙醇沉淀
氮盐衍生物，使载体引进活泼的重氮基团。 ➢ 载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基
或咪唑基发生偶联反应而制得固定化酶。
B. 叠氮法 ➢ 反应示意式
CH3OH/HCl OCH2COOH
OCH2COOCH2
NH2NH2（肼）
NaNO2/HCl OCH2CONHNH2
OCH2CON3 酶-NH2
OCH2CONH-酶
B. 叠氮法 ➢ 对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团
的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后 与酶偶联。
C．烷基化反应法
➢ 含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形 成含有卤素基团的活化载体。
酶
OH
O
O
➢ 卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷 基化反应，制备成固定化酶。
酶蛋白高级结构变化，破坏活性中心，活力 降低。
⑤载体活化方法
➢ A．重氮法 ➢ B．叠氮法 ➢ C．烷基化反应法 ➢ D．溴化氰法
A．重氮法
➢ 反应示意式 NaNO2/HCl
NH2
N2+Cl-
载体
重氮盐衍生物
酶-Tyr
OH N=N
CH2 酶 固定化酶
A．重氮法 ➢ 将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应，生成重
热处理法
吸附法
➢ 1. 吸附作用力 ➢ 2. 固体吸附剂包括活性炭、氧化铝、硅藻土、
多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石 ➢ 3. 优缺点
（3）包埋法 ➢ 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定
化的方法称为包埋法。
包埋法
凝胶包埋法（网格型） 半透膜包埋法（微囊型）
➢ 只适合作用于小分子底物和产物的酶。
总体积 Volume
(ml)
1040 90
总活力 Total activity (u) 460070 142574
DEAE-
11
Sepharos
e柱层析
HiTrap- 19 Q柱层析
46629 42218
总蛋白 Total protein (mg)
168.1
比活力 Specific activity (u/mg)
网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于 含酶菌体或菌体碎片的固定化。
➢ 常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来亚 胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它 两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫 碱（shiff）。
➢ 第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间 交联的固定化酶。