固定化酶技术PPT课件
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固定化酶技术ppt课件
固定化酶应有最小的空间位阻。 酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反
复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、
产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
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3.1 固定化酶的传统制备方法
3.1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻 璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温 和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶 失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有 活泼的表面。
酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶 活性中心的氨基酸残基不发生变化）
避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离
子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和 的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
6
固定化应该有利于生产自动化、连续化。 载体能抗一定的机械力。
(2)微囊型
把酶包埋在由高分 子聚合物制成的小 球内，制成固定化 酶。由于形成的酶 小球直径一般只有 几微米至几百微米， 所以也称为微囊化 法。
9
1.3结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定
的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫 共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的 脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂， 反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高 的固定化酶。
11
3.2固定化酶的新型制备方法
3.2.1共价固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离
复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、
产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
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3.1 固定化酶的传统制备方法
3.1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻 璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温 和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶 失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有 活泼的表面。
酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶 活性中心的氨基酸残基不发生变化）
避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离
子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和 的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
6
固定化应该有利于生产自动化、连续化。 载体能抗一定的机械力。
(2)微囊型
把酶包埋在由高分 子聚合物制成的小 球内，制成固定化 酶。由于形成的酶 小球直径一般只有 几微米至几百微米， 所以也称为微囊化 法。
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1.3结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定
的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫 共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的 脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂， 反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高 的固定化酶。
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3.2固定化酶的新型制备方法
3.2.1共价固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离
酶与细胞的固定化课件.ppt
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶的热稳定性
固定化果胶酯酶的pH稳定性
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶作用的最适温度
固定化果胶酯酶作用的最适pH值
5、酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值； 电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观Km值显著增加。
Cefaclor(R1=H,R3=Cl) Cephalexin(R1=H,R3=Me) Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)
酶促合成头孢类抗生素
CHCOOCH3 + H2N
NH2
O
S
Synthetase
N CH3
COOH
Esterase
CHCOOH +
NH2
CHCONH
NH2 O
S
N CH3
交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。
酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、 血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。
二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 （一）固定化酶的性质 1、酶的活性 多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间
位阻。
2、酶的稳定性 大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。
固定化酶-PPT精品文档
世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAESephadex A-25吸附的氨基酰化酶反应用于 DL-AA的光学分析。
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（二）、包埋法
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10
1、凝胶包埋法（胶格包埋法）：
第七章 固定化酶
（Immobilized Enzyme）
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1
酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使 用，而且不易与产物分离，不利于产物 的提纯和精制。 针对这些限制酶广泛应用的因素，将 水溶性酶或游离细胞经过化学或物理手 段处理，将酶束缚在一定的空间内，限 制酶分子在此区间进行活跃的催化作用， 成为不溶于水的固定化的酶或细胞。 固定化酶:固定在载体上，并在一定范 围内进行催化反应的酶。
锲而舍之，朽木不折。锲而不2.吸附法的优点、缺点
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多， 吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的 固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。 吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，易脱落， 会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度
条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的 相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚 糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如 Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
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4
吸附法 包埋法 共价结合法 交联法
固定化酶和固定化细胞ppt课件
21
❖（3）溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如 纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚 氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联， 制成固定化酶。
❖ 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。
22
❖（4）烷基化和芳基化法 以卤素为功能团的载体 可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷 基化或芳基化反应而使酶固定化。
❖ （4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪 氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲 哚基。
❖ 酶共价偶联的载体的功能基团：芳香氨基、羟基、羧 基和羧甲基等。
18
载体活化的主要反应 ❖ 重氮法 ❖ 叠氮法 ❖ 溴化氰法 ❖ 芳香烃化法
19
❖（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体 的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法， 是共价键法中使用最多的一种。
14
❖ （1）凝胶包埋法 ▪ 将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合 促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包 埋在聚合物中以达到固定化。 ▪ 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉 菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以 及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成 凝胶或树脂。
15
❖ （2）微胶囊包埋法 ▪ 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半 透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞 内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外 的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常 用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋 酸纤维素等。
❖ 常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸 的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。
20
❖（2）叠氮法 即载体活化生成叠氮化合物，再与 酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。
❖（3）溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如 纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚 氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联， 制成固定化酶。
❖ 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。
22
❖（4）烷基化和芳基化法 以卤素为功能团的载体 可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷 基化或芳基化反应而使酶固定化。
❖ （4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪 氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲 哚基。
❖ 酶共价偶联的载体的功能基团：芳香氨基、羟基、羧 基和羧甲基等。
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载体活化的主要反应 ❖ 重氮法 ❖ 叠氮法 ❖ 溴化氰法 ❖ 芳香烃化法
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❖（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体 的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法， 是共价键法中使用最多的一种。
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❖ （1）凝胶包埋法 ▪ 将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合 促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包 埋在聚合物中以达到固定化。 ▪ 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉 菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以 及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成 凝胶或树脂。
15
❖ （2）微胶囊包埋法 ▪ 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半 透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞 内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外 的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常 用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋 酸纤维素等。
❖ 常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸 的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。
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❖（2）叠氮法 即载体活化生成叠氮化合物，再与 酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。
固定化酶的制备和应用 PPT课件
学习探究区
第8课时
(2)方法步骤
①乳糖酶的溶解：准确称取乳糖酶 100 mg，然后将其溶
本
解在 pH__7_.3__的磷酸缓冲液中，其中单体__A_r_c__浓度为
课 栏
质量分数 20%，交联剂__B_i_s __浓度为质量分数 5%。
目 开 关
②聚合：将含有 N，N，N′，N′－四甲基乙二胺和 _过__硫__酸__铵___的磷酸缓冲液迅速倒入乳糖酶的溶解液中，
本 4．固定化酶应用的常见方式
课 栏
(1)间歇式：每次反应完后，经_离__心__或__过__滤___法
目
收集酶后再重复利用。
开 关
(2)连续式：用固定化酶制成的_反__应__柱___进行不
间断的重复利用，如图。
图中①是反应柱，②是固定化酶，③是分布着
小孔的筛板，不允许酶颗粒通过，而反应液可
以自由流出。
加酶分解是用预先灭过菌的玻璃棒每隔一段时间轻轻搅
拌；固定化酶回收用的是缓冲液反复冲洗固定化酶。所
以 C 正确。 答案 C
学习探究区
第8课时
3．下列关于牛奶中乳糖的分解的检测的相关叙述，错误的是( B ) A．乳糖酶可以将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖
B．还原糖可与双缩脲试剂反应产生砖红色沉淀
本 C．根据化合物颜色的深浅变化，可以了解乳糖酶的作用活性
2．方法步骤 (1)鲜牛奶的处理：取新鲜牛奶 0.5 kg 放入 1 000 mL 干净 烧杯中，__8_5_～__9_0__ ℃巴氏灭菌。将灭菌后的牛奶冷却至 __4_5_～__5_0___ ℃，_过__滤___后平均分为两部分，一部分放入 A 烧杯，另一部分放到 B 烧杯内作对照。
学习探究区
第8课时
《酶的固定化》PPT课件
第一节 酶固定化
定义 酶的固定化:将酶和菌体与不溶性载体结合的过程; 固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续 进行反应，反应后的酶可回收重复使用; 概念发展
“水不溶酶”（water insoluble enzyme) “固相酶”（solid phase enzyme)
1971年第一届国际酶工程会议正式采用“固定化酶（immobi lized enzyme)”
• 1、吸附法(link) • 2、包埋法(link) • 3、结合法(link) • 4、交联法(link) • 5、热处理法(link)
酶固定化方法示意图
吸附法 用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法; 固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等; (1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用; (2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落.
(2)产物酸碱性对最适pH值的影响
酸性:固定化酶的最适pH值比游离酶的高 碱性:固定化酶的最适pH值比游离酶的低 中性:固定化酶的最适pH值一般不变 原因:载体障碍产物的扩散
(back)
底物的特异性
与底物分子量的大小有关; 作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基 酰化酶、葡聚糖氧化酶等; 既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的 酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上 的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对 酶蛋白的作用仅为游离酶的3%左右 原因:载体的空间位阻作用
Relative activity (%)
100
80
60
A
B 40
20
0 30 40 50 60 70 80 90 Temperature ( 篊 )
《酶的固定化》课件
稳定性等
稳定性评估可 以帮助选择合 适的固定化方 法，提高酶的
固定化效果
稳定性评估还 可以帮助优化 固定化酶的生 产工艺，降低
生产成本
固定化酶的使用寿命
固定化酶的稳定性：在固定化过程中，酶的活性和稳定性得到提高
固定化酶的寿命：固定化酶的寿命通常比游离酶长，可以延长酶的使用寿命
固定化酶的再生：固定化酶可以通过再生技术恢复活性，延长使用寿命
添加标题
酶的固定化可以减少污染，提高环 保性能
酶的固定化可以简化生产工艺，提 高生产效率
酶的固定化未来 发展展望
新技术的开发与应用
酶固定化技术的发展：从传统的物理吸附到新型的化学键合 新型酶固定化技术的应用：在生物催化、生物制药、环境保护等领域的应用 酶固定化技术的挑战：如何提高酶的活性和稳定性，降低成本 酶固定化技术的未来：开发新型酶固定化材料，提高酶的固定化效率和稳定性，拓展应用领域
酶的固定化应用
环境保护：酶的固定化可以用 于污水处理、废气处理等领域
生物催化：酶的固定化可以 提高反应速率和选择性
食品加工：酶的固定化可以用 于食品加工，如酿酒、制糖等
医药工业：酶的固定化可以用 于药物合成、药物分析等领域
酶的固定化技术
吸附法
原理：利用酶与载体之间的物理或化学作用力，使酶固定在载体上 优点：操作简单，成本低，固定化效果好 缺点：酶活性易受载体影响，固定化后酶活性降低 应用：广泛应用于生物催化、生物制药等领域
提高固定化酶的稳定性与活性
改进固定化技术：提高酶的固 定化效率和稳定性
优化酶分子结构：提高酶的活 性和稳定性
筛选和优化固定化载体：提高 酶的固定化效率和稳定性
研究酶的固定化机制：为提高 酶的稳定性与活性提供理论支 持
稳定性评估可 以帮助选择合 适的固定化方 法，提高酶的
固定化效果
稳定性评估还 可以帮助优化 固定化酶的生 产工艺，降低
生产成本
固定化酶的使用寿命
固定化酶的稳定性：在固定化过程中，酶的活性和稳定性得到提高
固定化酶的寿命：固定化酶的寿命通常比游离酶长，可以延长酶的使用寿命
固定化酶的再生：固定化酶可以通过再生技术恢复活性，延长使用寿命
添加标题
酶的固定化可以减少污染，提高环 保性能
酶的固定化可以简化生产工艺，提 高生产效率
酶的固定化未来 发展展望
新技术的开发与应用
酶固定化技术的发展：从传统的物理吸附到新型的化学键合 新型酶固定化技术的应用：在生物催化、生物制药、环境保护等领域的应用 酶固定化技术的挑战：如何提高酶的活性和稳定性，降低成本 酶固定化技术的未来：开发新型酶固定化材料，提高酶的固定化效率和稳定性，拓展应用领域
酶的固定化应用
环境保护：酶的固定化可以用 于污水处理、废气处理等领域
生物催化：酶的固定化可以 提高反应速率和选择性
食品加工：酶的固定化可以用 于食品加工，如酿酒、制糖等
医药工业：酶的固定化可以用 于药物合成、药物分析等领域
酶的固定化技术
吸附法
原理：利用酶与载体之间的物理或化学作用力，使酶固定在载体上 优点：操作简单，成本低，固定化效果好 缺点：酶活性易受载体影响，固定化后酶活性降低 应用：广泛应用于生物催化、生物制药等领域
提高固定化酶的稳定性与活性
改进固定化技术：提高酶的固 定化效率和稳定性
优化酶分子结构：提高酶的活 性和稳定性
筛选和优化固定化载体：提高 酶的固定化效率和稳定性
研究酶的固定化机制：为提高 酶的稳定性与活性提供理论支 持
矿产
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
第五章酶的固定化ppt课件
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
概念
固定化酶是指固定在载体上并在一定的 空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既 保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不 足之处，具有增强稳定性，可反复或连续使 用以及易于和反应产物分开等显著特点。直 接固定菌体或菌体碎片的，称为固定化菌体 或固定化死细胞。
（2）半透膜包埋法 将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小
球内，制成固定化酶. 制备方法： 酶， 水， 乙二胺
癸二酰氯+氯仿
包埋法 优点：结合力牢、活力回收高、底物专一性不变。
缺点：制备较难，载体无法回收、扩散限制。
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
三 固定化酶的性质
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
《固定化酶》课件
《固定化酶》课件
目
CONTENCT
录
• 酶的介绍 • 固定化酶的原理与技术 • 固定化酶的制备与表征 • 固定化酶的实际应用 • 固定化酶的发展前景与挑战
01
酶的介绍
酶的定义与特性
酶的定义
酶是由生物体产生的一种具有催化作 用的有机物，能够加速化学反应的速 率而自身不发生化学变化。
酶的特性
高效性、专一性和作用条件温和的特 性。
在化学工业中的应用
固定化酶在化学工业中广泛应用于有机合成和手性合成。通过固定化酶技术，可 以将酶固定在载体上，实现高效、环保的有机合成，降低生产成本和环境污染。
固定化酶还可以用于药物的生产和研发，通过酶促反应实现药物的合成和修饰， 提高药物的疗效和降低副作用。
在环境保护中的应用
固定化酶在环境保护中广泛应用于废水处理和污染物降解。通过固定化酶技术，可以将酶固定在载体上，实现高效、稳定的 废水处理和污染物降解，降低环境污染和生态风险。
固定化酶的技术方法
总结词
固定化酶的技术方法
详细描述
固定化酶的技术方法主要包括吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等。这些方法各有特点，可根据不同的应用 需求选择适合的方法。
固定化酶的应用领域
总结词
固定化酶的应用领域
详细描述
固定化酶的应用领域广泛，包括生物传感器、生物反应器、药物制造、环境保护等领域。通过固定化 酶技术，可以实现酶的重复利用，提高反应效率，降低生产成本，为相关领域的发展提供有力支持。
智能化
通过与人工智能技术的结合，实现固定化酶的智能 化调控和优化，提高酶的利用效率和生产效益。
固定化酶面临的挑战
80%
稳定性问题
固定化酶在使用过程中可能会受 到环境因素的影响，如温度、pH 值等，导致酶的活性降低或失活 。
目
CONTENCT
录
• 酶的介绍 • 固定化酶的原理与技术 • 固定化酶的制备与表征 • 固定化酶的实际应用 • 固定化酶的发展前景与挑战
01
酶的介绍
酶的定义与特性
酶的定义
酶是由生物体产生的一种具有催化作 用的有机物，能够加速化学反应的速 率而自身不发生化学变化。
酶的特性
高效性、专一性和作用条件温和的特 性。
在化学工业中的应用
固定化酶在化学工业中广泛应用于有机合成和手性合成。通过固定化酶技术，可 以将酶固定在载体上，实现高效、环保的有机合成，降低生产成本和环境污染。
固定化酶还可以用于药物的生产和研发，通过酶促反应实现药物的合成和修饰， 提高药物的疗效和降低副作用。
在环境保护中的应用
固定化酶在环境保护中广泛应用于废水处理和污染物降解。通过固定化酶技术，可以将酶固定在载体上，实现高效、稳定的 废水处理和污染物降解，降低环境污染和生态风险。
固定化酶的技术方法
总结词
固定化酶的技术方法
详细描述
固定化酶的技术方法主要包括吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等。这些方法各有特点，可根据不同的应用 需求选择适合的方法。
固定化酶的应用领域
总结词
固定化酶的应用领域
详细描述
固定化酶的应用领域广泛，包括生物传感器、生物反应器、药物制造、环境保护等领域。通过固定化 酶技术，可以实现酶的重复利用，提高反应效率，降低生产成本，为相关领域的发展提供有力支持。
智能化
通过与人工智能技术的结合，实现固定化酶的智能 化调控和优化，提高酶的利用效率和生产效益。
固定化酶面临的挑战
80%
稳定性问题
固定化酶在使用过程中可能会受 到环境因素的影响，如温度、pH 值等，导致酶的活性降低或失活 。
《酶的固定化》课件
01
02
03
酶的固定化步骤：
实验 木瓜蛋白酶的固定化
取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH值7.8）反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液（0.5～1mg/mL）在4℃下固定3.5h（酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL）。
从酶液中取出尼龙布（保留残余酶液作测定用），用0.5mol/L NaCl溶液（用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。
热处理法只适用于热稳定性较好的酶的固定化，在热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。
（4）热处理法
步骤step
总体积Volume(ml)
总活力Total activity(u)
总蛋白Total protein(mg)
比活力Specific activity(u/mg)
纯化倍数Purification(fold)
缺点
（2）固定化（增殖）细胞的优点和缺点
（3）固定化细胞的制备（P169-178）
一般说，对于一步和两步反应的转化过程，用固定化酶较合适；对多步转化，采用整体细胞有利。
合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）
ⅰ.优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。 ⅱ.缺点：反应条件苛刻，操作条件复杂； 酶蛋白高级结构变化，破坏活性中心，活力降低。
1
2
3
4
5
6
1
重氮法
2
叠氮法
3
烷基化反应法
4
溴化氰法
⑤载体活化方法
A．重氮法
反应示意式
NH2
NaNO2/HCl
.缩短发酵周期，提高生产能力（产率）；
02
03
酶的固定化步骤：
实验 木瓜蛋白酶的固定化
取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH值7.8）反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液（0.5～1mg/mL）在4℃下固定3.5h（酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL）。
从酶液中取出尼龙布（保留残余酶液作测定用），用0.5mol/L NaCl溶液（用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。
热处理法只适用于热稳定性较好的酶的固定化，在热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。
（4）热处理法
步骤step
总体积Volume(ml)
总活力Total activity(u)
总蛋白Total protein(mg)
比活力Specific activity(u/mg)
纯化倍数Purification(fold)
缺点
（2）固定化（增殖）细胞的优点和缺点
（3）固定化细胞的制备（P169-178）
一般说，对于一步和两步反应的转化过程，用固定化酶较合适；对多步转化，采用整体细胞有利。
合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）
ⅰ.优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。 ⅱ.缺点：反应条件苛刻，操作条件复杂； 酶蛋白高级结构变化，破坏活性中心，活力降低。
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重氮法
2
叠氮法
3
烷基化反应法
4
溴化氰法
⑤载体活化方法
A．重氮法
反应示意式
NH2
NaNO2/HCl
.缩短发酵周期，提高生产能力（产率）；
固定化酶简述 PPT课件 通用
固定化酶的应用固定能源开发化学分析生物工程临床诊断医学环境保护酶的固定化及应用研究已得到长足进展开发新型固定化技术进传统固定化方法和注重天然高分子载体改性是酶固定化研究的主要趋生物学及生物工程医学及生命科学仍是固定化酶应用的重要场合适于化学化工及环境科学领域应用的固定化酶具有生态环境材料的鲜明特应给予足够重视
不足：由于包埋 优点：酶不参加化
学反应，整体结 构保持不变，酶 的催化活性得到 很好保留。
物或半透膜具 有一定的空间 或立体阻碍作 用，因此对一 些反应不适用
• 形式较物理法少 • 过程较物理法复杂 • 与物理法比较可形成相对 分子质量更大、不溶性的 固定化酶
传统固定化技术的改进
• 基于传统载体材料的各自优点与不足，通 过改性充分发挥其优势并弥补不足，将会 显著提高所得固定化酶的性能，已成为固 定化酶载体材料研究的主要内容之一。 • 经过近几十年的不断发展，已经产生了很 多制备载体固定化酶的新方法。
水不溶性大分子载体结合或把酶包 埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊 体中制成的。
┌─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┐ │景┆等┆生┆的┆酶┆于┆便┆制┆系┆稳│ │。┆方┆产┆酶┆是┆自┆于┆，┆统┆定│ │ ┆面┆、┆应┆近┆动┆运┆能┆中┆性│ │ ┆有┆化┆用┆十┆化┆输┆反┆分┆增│ │ ┆诱┆学┆技┆余┆生┆和┆复┆离┆加│ │ ┆人┆分┆术┆年┆产┆贮┆多┆，┆，│ │ ┆的┆析┆，┆发┆。┆存┆次┆且┆易│ │ ┆应┆和┆在┆展┆固┆，┆使┆易┆从│ │ ┆用┆医┆工┆起┆定┆有┆用┆于┆反│ │ ┆前┆药┆业┆来┆化┆利┆。┆控┆应│ └─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┘
简讯
我国自主开发成功固定化酶技术
“ 十五” 国家科技攻关计划’ 纳米材料 技术及应用开发 ’ 延续项目——纳米结构固 定化酶组装技术的开发，上 周在北京通过了 中国石油和化学工业协会、 中国钢协粉末冶 金协会共同组织的专家验收。这一成果可望 使我国 摆脱依赖进口载体生产固定化青霉素 酰化酶催化剂的被动局面，促进我国固定化 酶技术提升和抗生素产业可持续发 展。
不足：由于包埋 优点：酶不参加化
学反应，整体结 构保持不变，酶 的催化活性得到 很好保留。
物或半透膜具 有一定的空间 或立体阻碍作 用，因此对一 些反应不适用
• 形式较物理法少 • 过程较物理法复杂 • 与物理法比较可形成相对 分子质量更大、不溶性的 固定化酶
传统固定化技术的改进
• 基于传统载体材料的各自优点与不足，通 过改性充分发挥其优势并弥补不足，将会 显著提高所得固定化酶的性能，已成为固 定化酶载体材料研究的主要内容之一。 • 经过近几十年的不断发展，已经产生了很 多制备载体固定化酶的新方法。
水不溶性大分子载体结合或把酶包 埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊 体中制成的。
┌─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┐ │景┆等┆生┆的┆酶┆于┆便┆制┆系┆稳│ │。┆方┆产┆酶┆是┆自┆于┆，┆统┆定│ │ ┆面┆、┆应┆近┆动┆运┆能┆中┆性│ │ ┆有┆化┆用┆十┆化┆输┆反┆分┆增│ │ ┆诱┆学┆技┆余┆生┆和┆复┆离┆加│ │ ┆人┆分┆术┆年┆产┆贮┆多┆，┆，│ │ ┆的┆析┆，┆发┆。┆存┆次┆且┆易│ │ ┆应┆和┆在┆展┆固┆，┆使┆易┆从│ │ ┆用┆医┆工┆起┆定┆有┆用┆于┆反│ │ ┆前┆药┆业┆来┆化┆利┆。┆控┆应│ └─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┘
简讯
我国自主开发成功固定化酶技术
“ 十五” 国家科技攻关计划’ 纳米材料 技术及应用开发 ’ 延续项目——纳米结构固 定化酶组装技术的开发，上 周在北京通过了 中国石油和化学工业协会、 中国钢协粉末冶 金协会共同组织的专家验收。这一成果可望 使我国 摆脱依赖进口载体生产固定化青霉素 酰化酶催化剂的被动局面，促进我国固定化 酶技术提升和抗生素产业可持续发 展。
固定化酶ppt课件
酶
60
酶固定化方法选择依据：
（1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择
61
四、辅酶固定化
原因
有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化 反应
有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵
——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生
•可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游 离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键
•常用载体：天然高分子、人工合成的高聚 物、无机载体
29
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
1. 载体上引进活泼基团 2. 活化该活泼基团 3. 此活泼基团再与酶分子上某一基团形
成共价键
30
25
优点： 固定化时酶分子的构象很少
或基本不发生变化。
缺点： 结合力弱，易解吸附。
载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
26
II 离子结合法
酶分子与含有离子交换基团的固相载 体相结合
第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶
第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
=6*106IU
2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的 酶活力单位
17
固定化酶的指标：
1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的
酶活力单位。 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、
酶板）。
2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需 要的时间（t1/2）
60
酶固定化方法选择依据：
（1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择
61
四、辅酶固定化
原因
有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化 反应
有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵
——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生
•可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游 离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键
•常用载体：天然高分子、人工合成的高聚 物、无机载体
29
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
1. 载体上引进活泼基团 2. 活化该活泼基团 3. 此活泼基团再与酶分子上某一基团形
成共价键
30
25
优点： 固定化时酶分子的构象很少
或基本不发生变化。
缺点： 结合力弱，易解吸附。
载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
26
II 离子结合法
酶分子与含有离子交换基团的固相载 体相结合
第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶
第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
=6*106IU
2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的 酶活力单位
17
固定化酶的指标：
1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的
酶活力单位。 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、
酶板）。
2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需 要的时间（t1/2）
固定化酶PPT参考幻灯片
8
LOGO
新型酶固定化方法
原则：实现在较为温和的条件下进行酶的固定化，
尽量减少或避免酶活力的损失。
辐射
Mohy等以137Cs为辐 射源 ，通过γ-射线引 发将甲基丙烯酸甲酯接 枝共聚于尼龙 膜袭面 ， 经进一步活化， 用 于青霉素酰化酶的固定
光偶联
以光敏性单体聚合物包 埋固定化酶或带光敏 性基团的载体共价固定 化酶， 由于条件温和 ， 可获得酶 活力较高 的固定化酶。
▪ 其主要反应为：
▪ 即在H R P的作用下，氧化剂 (H202)将酚氧化，产生了活性高的苯 氧自由基等中间物，它们从酶的活性中心扩散到溶液各处，与酚 分子或苯氧自由基本身发生反应，生成了一系列的聚合物。这些 聚合物具有高相对分子质量和低水溶性的特性，因而易从溶液中 分离。
16
LOGO
例：磁性固定化酶处理含酚废水的研究
LOGO
固定化酶及其应用研究
1
LOGO
目录
1
固定化酶简介
2
固定化酶的制备
3
固定化酶的应用
4
展望
2
LOGO
固定化酶的意义
天然酶的优缺点
酶的化学本质是 蛋白质。 其催化 作用具有高选择 性 、 高催化活 性、 反应 条件 温和、 环保无污 染等特点。
游离状态的酶对 热 、强酸、强碱 、高离子强度 、 有机溶剂等稳定 性较差， 易失活 ， 并且反应后混 入催化产物等 物 质， 纯化困难， 不能重复使用。
3
生物传感器和环境保 护中： 固定化葡萄糖氧化酶 传感器、青霉素电极 等。 将辣根过氧化酶大量 吸附在磁石上，可以 对水中的氯酚选择性 吸附。
15
LOGO
例：磁性固定化酶处理含酚废水的研究
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新型酶固定化方法
原则：实现在较为温和的条件下进行酶的固定化，
尽量减少或避免酶活力的损失。
辐射
Mohy等以137Cs为辐 射源 ，通过γ-射线引 发将甲基丙烯酸甲酯接 枝共聚于尼龙 膜袭面 ， 经进一步活化， 用 于青霉素酰化酶的固定
光偶联
以光敏性单体聚合物包 埋固定化酶或带光敏 性基团的载体共价固定 化酶， 由于条件温和 ， 可获得酶 活力较高 的固定化酶。
▪ 其主要反应为：
▪ 即在H R P的作用下，氧化剂 (H202)将酚氧化，产生了活性高的苯 氧自由基等中间物，它们从酶的活性中心扩散到溶液各处，与酚 分子或苯氧自由基本身发生反应，生成了一系列的聚合物。这些 聚合物具有高相对分子质量和低水溶性的特性，因而易从溶液中 分离。
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LOGO
例：磁性固定化酶处理含酚废水的研究
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固定化酶及其应用研究
1
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目录
1
固定化酶简介
2
固定化酶的制备
3
固定化酶的应用
4
展望
2
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固定化酶的意义
天然酶的优缺点
酶的化学本质是 蛋白质。 其催化 作用具有高选择 性 、 高催化活 性、 反应 条件 温和、 环保无污 染等特点。
游离状态的酶对 热 、强酸、强碱 、高离子强度 、 有机溶剂等稳定 性较差， 易失活 ， 并且反应后混 入催化产物等 物 质， 纯化困难， 不能重复使用。
3
生物传感器和环境保 护中： 固定化葡萄糖氧化酶 传感器、青霉素电极 等。 将辣根过氧化酶大量 吸附在磁石上，可以 对水中的氯酚选择性 吸附。
15
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例：磁性固定化酶处理含酚废水的研究
第七章固定化酶-课件
固定化技术
什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
固定化酶的定义
在一定空间内呈闭锁状态的酶，能连续地 进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。
Enzyme(amount of immobilized biocatalyst used , Glucose isomerase(xylose isomerase)(1500t/a)
载体再生
费用 底物专一性 适用性
可能
低 不变 酶源多
不可能
高 可变 较广
可能
低 不变 广泛
不可能
中等 可变 较广
不可能
低 不变 小分子底 物、药用 酶
酶固定化时遵循的原则：
维持酶的催化活性和专一性； 固定化应有利于自动化、连续化反应； 固定化酶应具有最小的空间位阻； 酶与载体必须牢固结合； 固定化酶应具有最大的稳定性； 固定化酶易与产物分离； 固定化酶成本要低； 充分考虑固定化酶在制备工程和应用中的安全因素。
固定化酶的优点： 酶与产物、底物易分开； 可多批次使用和装柱连续反应； 提高酶的稳定性； 产物中无酶残留，简化产品纯化工艺； 提高酶的使用效率，成本降低； 增加产物收率，提高产物质量。
缺点：
酶活力损失； 增加了酶的成本； 只适用于可溶性底物，尤其可溶性小分子底
Product (amount) Glucose-fructose syrup ca. 10 million/a
Companies (Enzyme sippliers; application) Novozymes, Degussa,DSM,Danisco/Genen cor, Nagase; ADM, A.E. Staley, Cargill, CPC International and others Cerestar, Mitsui seito Co., Sudzucker Celntral del Latte, Snow Brand milk Prod., Sumimoto Chemical Industries, Valeo/Alko DSM, Asahi Chemical Ind Co., Beecham, Biochemie, bristol myers, To烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉
理学食品酶学本固定化酶课件
（1）酶的底物为小分子化合物
一般来说，当酶的底物为小分子化合物时，固定化酶的底物特异性大多数情况下不发生变化。例如，氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等，酶的底物为大分子化合物
当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、α-淀粉酶、磷酸二酯酶等，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。这是由于载体引起的空间位阻作用，使大分子底物难以与酶分子接近而无法进行催化反应，酶的催化活力难以发挥出来，催化活性大大下降；而分子量较小的底物受到空间位阻作用的影响较小，与游离酶没有显著区别。 酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底物特异性的影响也不同，一般随着底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。例如，糖化酶用CMC叠氮衍生物固定化时，对分子量8000的直链淀粉的活性为游离酶的77％，而对分子量为50万的直链淀粉的活性只有15%～17％。
以上四种固定化酶方法各有其优缺点（见表4-1）。往往一种酶可以用不同方法固定化，但没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶。在实际应用时，常将两种或数种固定化方法并用，以取长补短。
各固定方法的特点与比较
四、 固定化酶的特性
（一）固定化酶的形状 （二）固定化酶的性质 （三）酶活力 （四）固定化酶的稳定性 （五）固定化酶的反应特性
酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这可能是因为蛋白酶是大分子，由于受到空间位阻的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离酶几乎全部失活。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。
固定化可延长酶的贮藏有效期。但长期贮藏，活力也不免下降，最好能立即使用。如果贮藏条件比较好，亦可较长时间保持活力。例如，固定化胰蛋白酶，在0.0025mol/L磷酸缓冲液中，于20℃保存数月，活力尚不损失。
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包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等 多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法 比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低， 但此法对大分子底物不适用。
(1)网格型 将酶包埋在凝胶细微网 格中，制成一定形状的 固定化酶，称为网格型 包埋法。也称为凝胶包 埋法。
3.2固定化酶的新型制备方法
3.2.1共价固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表 面远离活性位点的特定稀有基团(如巯基)进行反应，使该基团与载 体上另一基团共价交联来同定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向， 以达到控制其空间取向的目的。 3.2.2氨基酸置换法 利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面合适位置置换一个氨基酸 分子，通过该氨基酸残基特殊的侧链基团控制固定方向。通过定点 突变在枯草蛋白酶(subtil2isin)分子表面远离活性中心的位置引入半 胱氨酸(Cys)残基。经蛋白质空间折叠后暴露出Cys，然后利用Cys 残基上的巯基固定枯草蛋白酶分子，取得了较好的固定效果，固定 效率和固定后催化活性均有很大提高。
1.4交联法 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白 之间的交联，使酶分子和多功能试 剂之间形成共价键，得到三向的交 联网架结构，除了酶分子之间发生 交联外，还存在着一定的分子内交 联。多功能试剂制备固定化酶方法 可分为：(1) 单独与酶作用；( 2) 酶 吸附在载体表面上再经受交联；( 3) 多功能团试剂与载体反应得到有功 能团的载体，再连接酶。交联剂的 种类很多，最常用的是戊二醛，其 他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二 联苯胺、N，N-乙烯马来酰亚胺等。 交联法的优点是酶与载体结合牢固， 稳定性较高；缺点是有的方法固定 化操作较复杂，进行化学修饰时易 造成酶失活。
酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶
活性中心的氨基酸残基不发生变化）
避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离
子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和 的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
固定化应该有利于生产自动化、连续化。
载体能抗一定的机械力。
(2)微囊型 把酶包埋在由高分子聚 合物制成的小球内，制 成固定化酶。由于形成 的酶小球直径一般只有 几微米至几百微米，所 以也称为微囊化法。
1.3结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定 的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫 共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的 脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂， 反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高 的固定化酶。
的氨基通过缩合反应可实现定向固定。醛基若与载体上的酰肼通过腙键结合实
现抗体分子的定向固定，与随机固定相比，固定后抗体稳定性提高的同时免疫 吸附活性也提高了3倍。 3.2.4生物素--亲和素亲合法 生物素是存在于所有活细胞内但含量甚微(<0．0001％)的中性小分子辅酶。亲 和素是一个含有四个相同亚基的四聚体，每个亚基均含一个生物素结合位点(解 离常数10~5mol／L) 。生物素与亲和素或相应细菌中的链霉亲和素有高专一性
缺点：
固定化所需载体和试剂较贵，成本高，投资大 固定化时，酶活力有损失 长期生产，易污染，载体易降解，酶易失活 只能用于可溶性底物，较适用于小分子底物，对大
分子底物不适宜
与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅
助因子的反应
3 制备方法
基本原则：
必须注意维持酶的催化活性及专一性。
4 应用
4.1 在食品中的应用 4.2 在环境工程中的应用 4.3 医学.1.1 固定化木瓜蛋白酶应用于啤酒澄清 长期放置的啤酒会由于多肽和多酚物质发生聚合反应而 变得混浊。为防止出现混浊，目前主要是采取向啤酒中 添加蛋白酶来水解啤酒中的蛋白质和多肽，但水解过度 会影响啤酒保持泡沫的性能。Witt等1970年用戊二醛交 联将木瓜蛋白酶固定化制成反应柱，生产所得啤酒在长 期贮存中可保持稳定。Finely 等人报道，用几丁质固定 的木瓜蛋白酶可用于啤酒的大罐冷藏或过滤后装瓶进行 处理，通过调节流速(酶柱法)和反应时间(分批法)，可以 精确控制蛋白质的分解程度。处理后的啤酒和固定化酶 易分开，固定化酶可以多次反复使用，极为经济。经处 理后的啤酒在风味上与传统的啤酒无明显差异。
固定化酶技术
1 原理 2 特点 3 制备方法 4 应用 5 发展趋势及建议
1 原理
水溶性酶
水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶 （固定化酶）
2 特点
固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：
稳定性高； 酶可反复使用； 产物纯度高，极易将固定化酶与底物、产物
分开；
固定化酶的反应条件易于控制 生产可连续化和自动化，节约劳动力； 设备小型化、可节约能源。
的、极强的亲和力。这种特性使其成为免疫分析、受体研究、免疫组织化学、 基因工程和蛋白质分离等领域中独特有力的工具。Min等将生物素羧化载体蛋 白、片段分别融合在荧光素酶和氧化还原酶的N末端，然后将这两个融合蛋白 定向固定在亲和素包被的琼脂颗粒上。荧光活性提高了8倍，固定化酶的稳定 性和固定效率均大大提高。
3.2.3抗体耦联法
大多数抗体具有足够的稳定性承受各种活化与偶联方法。抗体分子中很多可供 偶联用的官能团可以通过赖氨酸的ε-氨基或末端氨基、天冬氨酸的β-氨基、谷 氨酸的γ-氨基或末端羧基进行一般性的偶联。Spitznagel等用碘乙酸活化多孔 玻璃珠来定向固定抗体酶(abzyme)48G7-4A1的Fab片段，抗体酶Fab片段保持 了很好的催化活性。抗体分子Fc区的糖链部分氧化可产生醛基，醛基与载体上
固定化酶应有最小的空间位阻。 酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反 复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、 产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
3.1 固定化酶的传统制备方法 3.1.1吸附法 吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或 多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺 简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达 到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载 体的比表面积要求较大，有活泼的表面。 3.1.2包埋法
(1)网格型 将酶包埋在凝胶细微网 格中，制成一定形状的 固定化酶，称为网格型 包埋法。也称为凝胶包 埋法。
3.2固定化酶的新型制备方法
3.2.1共价固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表 面远离活性位点的特定稀有基团(如巯基)进行反应，使该基团与载 体上另一基团共价交联来同定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向， 以达到控制其空间取向的目的。 3.2.2氨基酸置换法 利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面合适位置置换一个氨基酸 分子，通过该氨基酸残基特殊的侧链基团控制固定方向。通过定点 突变在枯草蛋白酶(subtil2isin)分子表面远离活性中心的位置引入半 胱氨酸(Cys)残基。经蛋白质空间折叠后暴露出Cys，然后利用Cys 残基上的巯基固定枯草蛋白酶分子，取得了较好的固定效果，固定 效率和固定后催化活性均有很大提高。
1.4交联法 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白 之间的交联，使酶分子和多功能试 剂之间形成共价键，得到三向的交 联网架结构，除了酶分子之间发生 交联外，还存在着一定的分子内交 联。多功能试剂制备固定化酶方法 可分为：(1) 单独与酶作用；( 2) 酶 吸附在载体表面上再经受交联；( 3) 多功能团试剂与载体反应得到有功 能团的载体，再连接酶。交联剂的 种类很多，最常用的是戊二醛，其 他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二 联苯胺、N，N-乙烯马来酰亚胺等。 交联法的优点是酶与载体结合牢固， 稳定性较高；缺点是有的方法固定 化操作较复杂，进行化学修饰时易 造成酶失活。
酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶
活性中心的氨基酸残基不发生变化）
避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离
子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和 的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
固定化应该有利于生产自动化、连续化。
载体能抗一定的机械力。
(2)微囊型 把酶包埋在由高分子聚 合物制成的小球内，制 成固定化酶。由于形成 的酶小球直径一般只有 几微米至几百微米，所 以也称为微囊化法。
1.3结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定 的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫 共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的 脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂， 反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高 的固定化酶。
的氨基通过缩合反应可实现定向固定。醛基若与载体上的酰肼通过腙键结合实
现抗体分子的定向固定，与随机固定相比，固定后抗体稳定性提高的同时免疫 吸附活性也提高了3倍。 3.2.4生物素--亲和素亲合法 生物素是存在于所有活细胞内但含量甚微(<0．0001％)的中性小分子辅酶。亲 和素是一个含有四个相同亚基的四聚体，每个亚基均含一个生物素结合位点(解 离常数10~5mol／L) 。生物素与亲和素或相应细菌中的链霉亲和素有高专一性
缺点：
固定化所需载体和试剂较贵，成本高，投资大 固定化时，酶活力有损失 长期生产，易污染，载体易降解，酶易失活 只能用于可溶性底物，较适用于小分子底物，对大
分子底物不适宜
与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅
助因子的反应
3 制备方法
基本原则：
必须注意维持酶的催化活性及专一性。
4 应用
4.1 在食品中的应用 4.2 在环境工程中的应用 4.3 医学.1.1 固定化木瓜蛋白酶应用于啤酒澄清 长期放置的啤酒会由于多肽和多酚物质发生聚合反应而 变得混浊。为防止出现混浊，目前主要是采取向啤酒中 添加蛋白酶来水解啤酒中的蛋白质和多肽，但水解过度 会影响啤酒保持泡沫的性能。Witt等1970年用戊二醛交 联将木瓜蛋白酶固定化制成反应柱，生产所得啤酒在长 期贮存中可保持稳定。Finely 等人报道，用几丁质固定 的木瓜蛋白酶可用于啤酒的大罐冷藏或过滤后装瓶进行 处理，通过调节流速(酶柱法)和反应时间(分批法)，可以 精确控制蛋白质的分解程度。处理后的啤酒和固定化酶 易分开，固定化酶可以多次反复使用，极为经济。经处 理后的啤酒在风味上与传统的啤酒无明显差异。
固定化酶技术
1 原理 2 特点 3 制备方法 4 应用 5 发展趋势及建议
1 原理
水溶性酶
水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶 （固定化酶）
2 特点
固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：
稳定性高； 酶可反复使用； 产物纯度高，极易将固定化酶与底物、产物
分开；
固定化酶的反应条件易于控制 生产可连续化和自动化，节约劳动力； 设备小型化、可节约能源。
的、极强的亲和力。这种特性使其成为免疫分析、受体研究、免疫组织化学、 基因工程和蛋白质分离等领域中独特有力的工具。Min等将生物素羧化载体蛋 白、片段分别融合在荧光素酶和氧化还原酶的N末端，然后将这两个融合蛋白 定向固定在亲和素包被的琼脂颗粒上。荧光活性提高了8倍，固定化酶的稳定 性和固定效率均大大提高。
3.2.3抗体耦联法
大多数抗体具有足够的稳定性承受各种活化与偶联方法。抗体分子中很多可供 偶联用的官能团可以通过赖氨酸的ε-氨基或末端氨基、天冬氨酸的β-氨基、谷 氨酸的γ-氨基或末端羧基进行一般性的偶联。Spitznagel等用碘乙酸活化多孔 玻璃珠来定向固定抗体酶(abzyme)48G7-4A1的Fab片段，抗体酶Fab片段保持 了很好的催化活性。抗体分子Fc区的糖链部分氧化可产生醛基，醛基与载体上
固定化酶应有最小的空间位阻。 酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反 复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、 产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
3.1 固定化酶的传统制备方法 3.1.1吸附法 吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或 多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺 简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达 到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载 体的比表面积要求较大，有活泼的表面。 3.1.2包埋法