免疫组化ppt课件
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免疫组化 ppt课件
荧光显微镜或电子显微镜观察。
抗体的标记
为了使抗原-抗体可见，必须将抗体标记， 利用标记物与其他物质的反应将阳性结果放大， 并转换成可见的荧光或呈现出颜色。
免疫组化常用标记物
① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（FITC）呈绿色荧光；四乙基罗达明（rho—damine RB200） -橙红色荧光。
1.取材：从动物或者患者取下组织材料。 2.固定：将所需要的材料进行固定，使得组织内蛋白质迅速凝 固液（甲醛），细胞内结构和成分不再发生改变。 3.脱水：固定后的组织内进行脱水，以便石蜡的浸入。脱水用 梯度酒精进行脱水。（自动脱水机） 4.浸蜡与包埋：组织放置刚过熔点的石蜡中，然后进行包埋， 将透明后浸了蜡的组织块放到盛有熔化石蜡的模块中，并使之 凝固成蜡块。（包埋机） 5.切片与贴片：（ 组织切片机） （1）切片 （2）展片 （3）贴片
② 酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）。 ③ 生物素：（Biotin） ④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）
染色方法
1.直接法
用标记物（荧光素，酶等）直接标记在一抗上，标记抗体与抗原 结合。在通过显色或者荧光激发后在显微镜下观察；
2.间接法
免疫组化染色（石蜡切片）
1.烤片 65℃ 1-2h 2.常规二甲苯脱蜡，和梯度酒精水化 3.灭活内源性过氧化物酶 4.抗原修复 5.封闭 6.一抗过夜 7.加入有标记的二抗 8.显色 9.苏木素复染 10.常规梯度酒精脱水，透明，干燥 ，封片。
免疫组化应用
➢在临床上的应用 ➢在科研中的应用
在临床上的应用：
荧光素，酶标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。
3.非标记Ab桥法
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未封闭内源性过氧化物酶
29
30
胃固有膜腺体
31
3．假阴性反应：
⑴ 组织固定不当或固定时间过长； ⑵ 抗体效价过低或久置失效； ⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔； ⑷ DAB或H2O2的浓度不当。
32
五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断 中的应用
（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因： １在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明确诊断。 ２形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性
在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊 和鉴别诊断。
其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学 反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
2
Immunohistochemistry
Esophageal carcinoma
E-cad + in membrane Wu Ming-Yao et al.
图8
图9
图10 免疫组化结果： 肿瘤细胞Vimentin（+）
图11免疫组化结果：
肿瘤细胞（CD117+）
58
59
60
61
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63
64
抗原修复
从应用病理技术观点来看，福尔马林组织标本固定 术就像一把双刃剑：
福尔马林（10%甲醛溶液）是一经典的常规病理 诊断用组织样本固定剂，然而缺点是其对免疫组 织化学及原位杂交信号检测是有损害作用。
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
12
（四）ABC法： 1981年美籍华人许世明发明了ABC法
Vector
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未封闭内源性过氧化物酶
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胃固有膜腺体
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3．假阴性反应：
⑴ 组织固定不当或固定时间过长； ⑵ 抗体效价过低或久置失效； ⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔； ⑷ DAB或H2O2的浓度不当。
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五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断 中的应用
（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因： １在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明确诊断。 ２形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性
在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊 和鉴别诊断。
其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学 反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
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Immunohistochemistry
Esophageal carcinoma
E-cad + in membrane Wu Ming-Yao et al.
图8
图9
图10 免疫组化结果： 肿瘤细胞Vimentin（+）
图11免疫组化结果：
肿瘤细胞（CD117+）
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抗原修复
从应用病理技术观点来看，福尔马林组织标本固定 术就像一把双刃剑：
福尔马林（10%甲醛溶液）是一经典的常规病理 诊断用组织样本固定剂，然而缺点是其对免疫组 织化学及原位杂交信号检测是有损害作用。
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
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（四）ABC法： 1981年美籍华人许世明发明了ABC法
Vector
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胶体金 与胶体金结合的蛋白
蛋白-抗体结合体
抗原
标本：组织标本和细胞标本
(1).组织标本：石蜡切片、冰冻切片、振动 切片、塑料切片、超薄切片、碳蜡切片等；
(2).细胞标本：组织印片、细胞爬片和细胞 涂片等。
石蜡切片应用：其优点是组织结构保存良好， 在病理和回顾性研究中有较大的实用价值， 能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准 确。缺点在于制作时间过长，步骤繁多，易 出错。
图示：
(10).复染胞核：苏木素染色液染色10分钟；细胞核呈现蓝
色；5%酸性乙醇分化液漂洗数秒---自来水漂洗数秒---1%氨 水浸泡数十秒---放入PBS液中；
(11).脱水：梯度脱水，将水化的步骤还原：蒸馏水(10分 钟)---80%乙醇(10分钟)---95%乙醇(10分钟)---无水乙醇 (10分钟)---二甲苯Ⅰ(5分钟)---二甲苯Ⅱ(5分钟)；
2.第二阶段(切片的处理---免疫组化)：
(1).烤片：置于烤箱内60 ℃维持2小时；
(2).脱蜡及水化：二甲苯洗涤，脱去石蜡，然后经酒精梯度 水化，顺序为：二甲苯Ⅰ(30分钟)---二甲苯Ⅱ(30分钟)--无水乙醇Ⅰ(15分钟)---无水乙醇Ⅱ(15分钟)---95%乙醇(10 分钟)---
80%乙醇(10分钟)---蒸馏水(5分钟)---PBS液(5分钟)；
(6).加Ⅰ抗：弃去血清，加Ⅰ抗，4℃过夜或室温下5分钟— 1小时；
(7).复温：室温复温1小时，回收Ⅰ抗，PBS液洗涤3次X5分 钟；
(8). 加Ⅱ抗：加入 Ⅱ抗(被标记物标记，如辣根过氧化物 酶HRP)，37℃孵育1小时，后用PBS液洗涤3次X5分钟；
(9).DAB(二氨基联苯胺)显色(常用)：用1ml A液+50ul B液 混合，现配DAB显色液，避光；室温下，加DAB显色液铺满整 个切片样品表面，室温孵育数秒？数十秒？几分钟？(镜下 观察，根据显色情况适当延长时间)；满意后自来水充分冲 洗。原理：DAB显色液与Ⅱ抗上被标记的HRP发生氧化还原反 应，DAB形成棕褐色不溶性产物；
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（0.05-0.1%）；
b、胃蛋白酶消化（0.4%）。
2）热诱导的抗原修复：
方法：微波960C, 10min；
直接加温方法 1000C, 10min；
高压锅 1200C, 10min；
热处理液：0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液
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✓合适的抗体稀释度： 过高，过低均会导致阴性结果。 即用型抗体； 浓缩型。
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S-P法（LSAB）：
采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋 白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测 定细胞和组织中的抗原。
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Envision：
原理：第二抗体上标记有多聚物酶（HRP or AP） 复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可结合许多 的HRP分子，使信号有显著提高，敏感性较PAP法，ABC 法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是人体内不存在， 无非特异性干扰，尤其是多聚物酶分子结合的第二抗 体孵育时间短，该方法更省时，简便。
•四甲基异硫氰酸罗达明（Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC） 620nm
•四 乙 基 罗 达 明 （ Teraethyle rhodamine B200, RB200）590－600nm
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➢胶体金： •指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中， •免疫电镜观察
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显示物：
➢酶标反应：
①碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase,AP）
AP与不同的底物（萘酚As-Mx、快蓝、快红）作 用 ， 可 形 成 不 同 颜 色 的 终 产 物 。 用 新 品 红 （ New fuchsine）显色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉 淀，不褪色。
《免疫组化技术》课件
特点
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末
免疫组化课件PPT课件
李
三 华
特点
优点
特异性强，定位准；
结果直观；
形态学改变与功能和代谢相结合；
组织标本可用石蜡保存进性回顾性研究。
缺点
步骤多，影响实验成败的因素多；
以定位、定性和半定量研究为主，绝对定量
分析尚需标准化。
第四页，共28页。
中
心
实
验
室 李 三 华
二 免疫组化技术的基本步骤
1.制片
组织切片(石蜡切片、冰冻切片)
IHC,WB,FC,ELISA,IP； 石蜡切片(IHC－P),冰冻切片(IHC－Fr),
甲醛固定冰冻切片（IHC-FoFr）。 (5)与抗原结合的部位
亚型， C-或N-，胞外区域或胞内区域。 （6）公司，价格。
第十七页，共28页。
中
心
实
验 室 李 三
国外主要抗体试剂公司
华
用途
公司
用途
最全 离子通道
李
三
华
常用酶
辣根过氧化物酶（ Horseradise peroaidase，HRP)
底物：DAB(四盐酸二氨基联苯胺)，产物为棕褐色。
碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase, AP）
底物：NBT（四氮唑蓝），产物为紫蓝色。
葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase,GOD）
底物：葡萄糖，产物为蓝色。
第二页，共28页。
中
心 实 验 室
李
应用
三
华
凡是组织细胞内具有抗原性的物质
（肽类、蛋白质、细胞因子、受体、激素
、神经递质、核酸、表面抗原）或抗体均
可用免疫组织化学方法显示而进行定性、
定位分析或定量研究，进而深入研究其
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（2）细胞固定 离心→涂片→固定5到10分钟→漂洗→组化
（三）组织的脱水、浸蜡、包埋和切片
前三步只用于石蜡切片，冰冻切片不需此步骤。
1、包埋
定义：脱水透明后，用石蜡、火棉胶、 环氧树脂等支持剂透入组织内部使之变 硬（利于切片）的过程。石蜡包埋适于 绝大多数组织学和组化技术。
2、常规石蜡包埋过程
(1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
(二) 内源性酶的消除方法
1、内源性过氧化物酶的消除方法 1） 0.3～3% H2O2甲醇溶液浸泡20min 2） 3％ H2O2溶液浸泡20min
2、内源性碱性磷酸酶的消除方法
左旋咪唑 （24mg/ml）加入底物液 中,并保持pH7.6-8.2。
（三）抗原修复
1、目的 暴露被交联封闭的Ag。主要适用于经长期 formalin固定的标本、石蜡包埋标本。
2、修复液 10mM，pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液
3、常用的修复方法有
1） 微波加热 2） 高压锅处理 3） 酶消化处理 ：常用0.1%的胰蛋白酶(含0.1%
CaCl2，pH7.8)，37℃ 10min(细胞内抗原)或 0.4%胃 蛋白酶，37℃ 30min以上(细胞间抗原)。
（四）封闭
采用正常二抗来源的动物血清封闭，以 减少一抗非特异性结合。
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
直接法特点：1、此法特异性高，但敏感性低； 2、每种抗体均需单独标记，使用不便。
间接法特点： 1、敏感性较直接法高3-4倍，但特异 性较低；2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动 物的二抗。
常用的免疫组化方法
（一）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术 （avidin-biotin-peroxidase complex technique， 简称ABC法）。
（三）组织的脱水、浸蜡、包埋和切片
前三步只用于石蜡切片，冰冻切片不需此步骤。
1、包埋
定义：脱水透明后，用石蜡、火棉胶、 环氧树脂等支持剂透入组织内部使之变 硬（利于切片）的过程。石蜡包埋适于 绝大多数组织学和组化技术。
2、常规石蜡包埋过程
(1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
(二) 内源性酶的消除方法
1、内源性过氧化物酶的消除方法 1） 0.3～3% H2O2甲醇溶液浸泡20min 2） 3％ H2O2溶液浸泡20min
2、内源性碱性磷酸酶的消除方法
左旋咪唑 （24mg/ml）加入底物液 中,并保持pH7.6-8.2。
（三）抗原修复
1、目的 暴露被交联封闭的Ag。主要适用于经长期 formalin固定的标本、石蜡包埋标本。
2、修复液 10mM，pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液
3、常用的修复方法有
1） 微波加热 2） 高压锅处理 3） 酶消化处理 ：常用0.1%的胰蛋白酶(含0.1%
CaCl2，pH7.8)，37℃ 10min(细胞内抗原)或 0.4%胃 蛋白酶，37℃ 30min以上(细胞间抗原)。
（四）封闭
采用正常二抗来源的动物血清封闭，以 减少一抗非特异性结合。
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
直接法特点：1、此法特异性高，但敏感性低； 2、每种抗体均需单独标记，使用不便。
间接法特点： 1、敏感性较直接法高3-4倍，但特异 性较低；2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动 物的二抗。
常用的免疫组化方法
（一）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术 （avidin-biotin-peroxidase complex technique， 简称ABC法）。
免疫组化PPT精选课件
20
2. B 细胞
● 静止B细胞 SIg(G、M、D), CD19-22、CD24、 Ia（HLA-D）
● 活化B细胞 CD23（Blast-2, BCGF) CD25(IL-2R)
● 其他标志 CD80、CD86
21
3.NK细胞
CD11b、CD11c、CD16、CD35、CD57、CDw122等
38
四. 肿瘤的病理诊断
39
㈠ 组织相ed marker)
又称组织特异性标志物 ( specific tissue marker) 用于区分肿瘤的组织来源
40
表1. 上皮细胞常用标志物
------------------------------------------------------------------------------
45
2.间叶组织类抗原
间叶细胞性: 波形蛋白（Vm）－ 间叶性肿瘤
Vm ( 结肠间质 )
Vm ( 恶性纤维组织细胞瘤 ) 46
肌源性: 结蛋白( Dm ) － 肌源性肿瘤 肌动蛋白( actin ) － 肌源性肿瘤 肌凝蛋白( myosin )－ 骨骼肌 肌红蛋白( myoglobin，MGB )－ 横纹肌肿瘤
29
● 移植物排异反应 血管壁 － IgG、C3沉积 肾小球 － 复发性肾炎
● 其他自身免疫性疾病 混合性结缔组织病：血管、 肾小球内IgG、C3沉积 硬皮病：结缔组织、 血管壁IgG沉积
硬皮病 30
三. 修复、纤维化机制的研究
肉芽组织是不完全性修复的物质基础
31
常见疾病
A粥样硬化 － 冠心病 肝硬化 － 肝昏迷、上消化道大出血 肾小球硬化 － 肾功能衰竭 肺纤维化 － 肺心病、肺性脑病
2. B 细胞
● 静止B细胞 SIg(G、M、D), CD19-22、CD24、 Ia（HLA-D）
● 活化B细胞 CD23（Blast-2, BCGF) CD25(IL-2R)
● 其他标志 CD80、CD86
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3.NK细胞
CD11b、CD11c、CD16、CD35、CD57、CDw122等
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四. 肿瘤的病理诊断
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㈠ 组织相ed marker)
又称组织特异性标志物 ( specific tissue marker) 用于区分肿瘤的组织来源
40
表1. 上皮细胞常用标志物
------------------------------------------------------------------------------
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2.间叶组织类抗原
间叶细胞性: 波形蛋白（Vm）－ 间叶性肿瘤
Vm ( 结肠间质 )
Vm ( 恶性纤维组织细胞瘤 ) 46
肌源性: 结蛋白( Dm ) － 肌源性肿瘤 肌动蛋白( actin ) － 肌源性肿瘤 肌凝蛋白( myosin )－ 骨骼肌 肌红蛋白( myoglobin，MGB )－ 横纹肌肿瘤
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● 移植物排异反应 血管壁 － IgG、C3沉积 肾小球 － 复发性肾炎
● 其他自身免疫性疾病 混合性结缔组织病：血管、 肾小球内IgG、C3沉积 硬皮病：结缔组织、 血管壁IgG沉积
硬皮病 30
三. 修复、纤维化机制的研究
肉芽组织是不完全性修复的物质基础
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常见疾病
A粥样硬化 － 冠心病 肝硬化 － 肝昏迷、上消化道大出血 肾小球硬化 － 肾功能衰竭 肺纤维化 － 肺心病、肺性脑病
免疫组化实验方法ppt课件
非特异吸附，常用牛血清白蛋白 （5）防腐剂：微生物生长会干扰抗原抗体反应，稀释液和抗体液中加入
适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐 （6）温度和时间：较高的反应温度（37℃）可加速抗原抗体结合反应，
低温有利于抗原抗体结合率的提高 （7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。
选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇
免疫组化实验标本
• 组织标本（石蜡切片和冰冻切片）
• 细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂 片）。
• 石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连 续切片，有利于各种染色对照观察；还能 长期存档；
3
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
（4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4℃ 冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30％。
（5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景 非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验 摸索，找出最佳稀释度。
（6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻 融次数。
11
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚 甲醛混合使用。
（3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分 子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使 用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
3．常用的固定方法--浸入法和灌注法（适用于动物实验研究）
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火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐 （6）温度和时间：较高的反应温度（37℃）可加速抗原抗体结合反应，
低温有利于抗原抗体结合率的提高 （7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。
选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇
免疫组化实验标本
• 组织标本（石蜡切片和冰冻切片）
• 细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂 片）。
• 石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连 续切片，有利于各种染色对照观察；还能 长期存档；
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火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
（4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4℃ 冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30％。
（5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景 非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验 摸索，找出最佳稀释度。
（6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻 融次数。
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火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚 甲醛混合使用。
（3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分 子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使 用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
3．常用的固定方法--浸入法和灌注法（适用于动物实验研究）
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火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
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来自胶体金 与胶体金结合的蛋白
蛋白-抗体结合体
抗原
标本：组织标本和细胞标本
(1).组织标本：石蜡切片、冰冻切片、振动 切片、塑料切片、超薄切片、碳蜡切片等；
(2).细胞标本：组织印片、细胞爬片和细胞 涂片等。
石蜡切片应用：其优点是组织结构保存良好， 在病理和回顾性研究中有较大的实用价值， 能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准 确。缺点在于制作时间过长，步骤繁多，易 出错。
(6).加Ⅰ抗：弃去血清，加Ⅰ抗，4℃过夜或室温下5分钟— 1小时；
(7).复温：室温复温1小时，回收Ⅰ抗，PBS液洗涤3次X5分 钟；
(5).透明化：纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒 浸液，替换出组织内的酒精，这种媒浸液称为透明剂。组织先经纯酒精 和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。目的： 石蜡易于浸入组织； (6).浸蜡与包埋：用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。 通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小 时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡 熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。通常石蜡采用熔点为 56～58℃或60～62℃两种。 (7).切片:包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，切片机切片，切片厚 度为4～7um。 (8).贴片与烤片:用粘附剂-蛋白甘油将展平的蜡片牢附于载玻片。首先 在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片） 或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺 正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使 蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥， 也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。
SUCCESS
THANK YOU
2019/6/13
特异性抗体的获取：先将组织或细胞中的某 种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗 原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再 以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原 物质。
第二部分
重点说明石蜡切片在免疫酶法中的实验步骤
石蜡切片：
1.第一阶段(制片)：
(4).室温孵育： 0.3%H2O2 孵育 10-15 分钟，目的是降低 内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色；后用PBS液洗 涤
3次X5分钟；
(5).血清封闭：用稀释20倍的正常血清（如5%山羊血清）室
温封闭30分钟；目的：中和非特异性抗原，减少非特异性着
色；
特异性抗原
血清中的抗体
非特异性抗原
(1).取材：获取实验所需的组织块；
(2).固定：常用4%多聚甲醛（ HO-(CH2O)n-H ）；目的：迅速凝 固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、 防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构；
(3).洗涤：流水冲洗，含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多 次浸洗；
(4).脱水：常用酒精脱水，由低浓度到高浓度递增的顺序进行， 从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至无水乙醇，每次时间 为1～数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70%酒精 中保存；
2.第二阶段(切片的处理---免疫组化)：
(1).烤片：置于烤箱内60 ℃维持2小时；
(2).脱蜡及水化：二甲苯洗涤，脱去石蜡，然后经酒精梯度 水化，顺序为：二甲苯Ⅰ(30分钟)---二甲苯Ⅱ(30分钟)--无水乙醇Ⅰ(15分钟)---无水乙醇Ⅱ(15分钟)---95%乙醇(10 分钟)---
80%乙醇(10分钟)---蒸馏水(5分钟)---PBS液(5分钟)；
特异性抗体
抗原
2.方法及其分类（按抗体标记物不同）: (1).免疫荧光法； (2).免疫酶法； (3).免疫胶体金法。
(1).免疫荧光法：
将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组 织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体 复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波 长的荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量.
(3).抗原修复：配置500ml抗原修复液（包括通用型强力抗 原修复液50ml、TritonX-100(非离子型表面活性剂，溶解脂 质，以增加抗体对细胞膜的通透性)500ul、蒸馏水450ml）； 电炉加热浸没于抗原修复液中的切片，维持温度92-98 ℃约 20-30分钟；室温冷却1小时，后PBS液洗涤3次X5分钟；
冰冻切片的应用：
①确定病变是否为肿瘤； ②判断肿瘤的良恶性； ③了解肿瘤有无播散到邻近淋巴结或脏器； ④确定手术切缘有无肿瘤浸润，以了解手术范围是否足够 大； ⑤帮助识别手术中某些意外和确定可疑微小组织（如甲状 旁腺、输卵管或输精管等）； ⑥取新鲜组织供激素受体测定、肿瘤药敏试验、电镜检查 和分子生物学检查等特殊需要。
免疫组化 （immunohistochemistry）
第一部分：准备工作
了解免疫组化技术的概念、原理、技术方法 及取材。
免疫组化
1.概念及原理：应用免疫学基本原理——抗 原抗体反应。即抗原与抗体特异性结合的原 理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧 光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定 组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进 行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫 组织化学技术(immunohistochemistry)或免 疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 显色剂
(2).免疫酶法:
先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然 后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一 定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组 织内的相应抗原进行定位或定性研究．
酶标抗体
抗原
酶的底物
(3).免疫胶体金法：
以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶， 它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。 因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子 （如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、 定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子 密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定 位研究。
蛋白-抗体结合体
抗原
标本：组织标本和细胞标本
(1).组织标本：石蜡切片、冰冻切片、振动 切片、塑料切片、超薄切片、碳蜡切片等；
(2).细胞标本：组织印片、细胞爬片和细胞 涂片等。
石蜡切片应用：其优点是组织结构保存良好， 在病理和回顾性研究中有较大的实用价值， 能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准 确。缺点在于制作时间过长，步骤繁多，易 出错。
(6).加Ⅰ抗：弃去血清，加Ⅰ抗，4℃过夜或室温下5分钟— 1小时；
(7).复温：室温复温1小时，回收Ⅰ抗，PBS液洗涤3次X5分 钟；
(5).透明化：纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒 浸液，替换出组织内的酒精，这种媒浸液称为透明剂。组织先经纯酒精 和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。目的： 石蜡易于浸入组织； (6).浸蜡与包埋：用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。 通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小 时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡 熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。通常石蜡采用熔点为 56～58℃或60～62℃两种。 (7).切片:包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，切片机切片，切片厚 度为4～7um。 (8).贴片与烤片:用粘附剂-蛋白甘油将展平的蜡片牢附于载玻片。首先 在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片） 或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺 正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使 蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥， 也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。
SUCCESS
THANK YOU
2019/6/13
特异性抗体的获取：先将组织或细胞中的某 种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗 原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再 以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原 物质。
第二部分
重点说明石蜡切片在免疫酶法中的实验步骤
石蜡切片：
1.第一阶段(制片)：
(4).室温孵育： 0.3%H2O2 孵育 10-15 分钟，目的是降低 内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色；后用PBS液洗 涤
3次X5分钟；
(5).血清封闭：用稀释20倍的正常血清（如5%山羊血清）室
温封闭30分钟；目的：中和非特异性抗原，减少非特异性着
色；
特异性抗原
血清中的抗体
非特异性抗原
(1).取材：获取实验所需的组织块；
(2).固定：常用4%多聚甲醛（ HO-(CH2O)n-H ）；目的：迅速凝 固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、 防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构；
(3).洗涤：流水冲洗，含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多 次浸洗；
(4).脱水：常用酒精脱水，由低浓度到高浓度递增的顺序进行， 从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至无水乙醇，每次时间 为1～数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70%酒精 中保存；
2.第二阶段(切片的处理---免疫组化)：
(1).烤片：置于烤箱内60 ℃维持2小时；
(2).脱蜡及水化：二甲苯洗涤，脱去石蜡，然后经酒精梯度 水化，顺序为：二甲苯Ⅰ(30分钟)---二甲苯Ⅱ(30分钟)--无水乙醇Ⅰ(15分钟)---无水乙醇Ⅱ(15分钟)---95%乙醇(10 分钟)---
80%乙醇(10分钟)---蒸馏水(5分钟)---PBS液(5分钟)；
特异性抗体
抗原
2.方法及其分类（按抗体标记物不同）: (1).免疫荧光法； (2).免疫酶法； (3).免疫胶体金法。
(1).免疫荧光法：
将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组 织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体 复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波 长的荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量.
(3).抗原修复：配置500ml抗原修复液（包括通用型强力抗 原修复液50ml、TritonX-100(非离子型表面活性剂，溶解脂 质，以增加抗体对细胞膜的通透性)500ul、蒸馏水450ml）； 电炉加热浸没于抗原修复液中的切片，维持温度92-98 ℃约 20-30分钟；室温冷却1小时，后PBS液洗涤3次X5分钟；
冰冻切片的应用：
①确定病变是否为肿瘤； ②判断肿瘤的良恶性； ③了解肿瘤有无播散到邻近淋巴结或脏器； ④确定手术切缘有无肿瘤浸润，以了解手术范围是否足够 大； ⑤帮助识别手术中某些意外和确定可疑微小组织（如甲状 旁腺、输卵管或输精管等）； ⑥取新鲜组织供激素受体测定、肿瘤药敏试验、电镜检查 和分子生物学检查等特殊需要。
免疫组化 （immunohistochemistry）
第一部分：准备工作
了解免疫组化技术的概念、原理、技术方法 及取材。
免疫组化
1.概念及原理：应用免疫学基本原理——抗 原抗体反应。即抗原与抗体特异性结合的原 理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧 光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定 组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进 行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫 组织化学技术(immunohistochemistry)或免 疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 显色剂
(2).免疫酶法:
先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然 后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一 定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组 织内的相应抗原进行定位或定性研究．
酶标抗体
抗原
酶的底物
(3).免疫胶体金法：
以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶， 它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。 因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子 （如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、 定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子 密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定 位研究。