免疫组化技术简介PPT课件
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免疫组化 ppt课件
荧光显微镜或电子显微镜观察。
抗体的标记
为了使抗原-抗体可见，必须将抗体标记， 利用标记物与其他物质的反应将阳性结果放大， 并转换成可见的荧光或呈现出颜色。
免疫组化常用标记物
① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（FITC）呈绿色荧光；四乙基罗达明（rho—damine RB200） -橙红色荧光。
1.取材：从动物或者患者取下组织材料。 2.固定：将所需要的材料进行固定，使得组织内蛋白质迅速凝 固液（甲醛），细胞内结构和成分不再发生改变。 3.脱水：固定后的组织内进行脱水，以便石蜡的浸入。脱水用 梯度酒精进行脱水。（自动脱水机） 4.浸蜡与包埋：组织放置刚过熔点的石蜡中，然后进行包埋， 将透明后浸了蜡的组织块放到盛有熔化石蜡的模块中，并使之 凝固成蜡块。（包埋机） 5.切片与贴片：（ 组织切片机） （1）切片 （2）展片 （3）贴片
② 酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）。 ③ 生物素：（Biotin） ④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）
染色方法
1.直接法
用标记物（荧光素，酶等）直接标记在一抗上，标记抗体与抗原 结合。在通过显色或者荧光激发后在显微镜下观察；
2.间接法
免疫组化染色（石蜡切片）
1.烤片 65℃ 1-2h 2.常规二甲苯脱蜡，和梯度酒精水化 3.灭活内源性过氧化物酶 4.抗原修复 5.封闭 6.一抗过夜 7.加入有标记的二抗 8.显色 9.苏木素复染 10.常规梯度酒精脱水，透明，干燥 ，封片。
免疫组化应用
➢在临床上的应用 ➢在科研中的应用
在临床上的应用：
荧光素，酶标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。
3.非标记Ab桥法
免疫组化ppt课件
来自胶体金 与胶体金结合的蛋白
蛋白-抗体结合体
抗原
标本：组织标本和细胞标本
(1).组织标本：石蜡切片、冰冻切片、振动 切片、塑料切片、超薄切片、碳蜡切片等；
(2).细胞标本：组织印片、细胞爬片和细胞 涂片等。
石蜡切片应用：其优点是组织结构保存良好， 在病理和回顾性研究中有较大的实用价值， 能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准 确。缺点在于制作时间过长，步骤繁多，易 出错。
(6).加Ⅰ抗：弃去血清，加Ⅰ抗，4℃过夜或室温下5分钟— 1小时；
(7).复温：室温复温1小时，回收Ⅰ抗，PBS液洗涤3次X5分 钟；
(5).透明化：纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒 浸液，替换出组织内的酒精，这种媒浸液称为透明剂。组织先经纯酒精 和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。目的： 石蜡易于浸入组织； (6).浸蜡与包埋：用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。 通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小 时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡 熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。通常石蜡采用熔点为 56～58℃或60～62℃两种。 (7).切片:包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，切片机切片，切片厚 度为4～7um。 (8).贴片与烤片:用粘附剂-蛋白甘油将展平的蜡片牢附于载玻片。首先 在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片） 或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺 正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使 蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥， 也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。
蛋白-抗体结合体
抗原
标本：组织标本和细胞标本
(1).组织标本：石蜡切片、冰冻切片、振动 切片、塑料切片、超薄切片、碳蜡切片等；
(2).细胞标本：组织印片、细胞爬片和细胞 涂片等。
石蜡切片应用：其优点是组织结构保存良好， 在病理和回顾性研究中有较大的实用价值， 能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准 确。缺点在于制作时间过长，步骤繁多，易 出错。
(6).加Ⅰ抗：弃去血清，加Ⅰ抗，4℃过夜或室温下5分钟— 1小时；
(7).复温：室温复温1小时，回收Ⅰ抗，PBS液洗涤3次X5分 钟；
(5).透明化：纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒 浸液，替换出组织内的酒精，这种媒浸液称为透明剂。组织先经纯酒精 和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。目的： 石蜡易于浸入组织； (6).浸蜡与包埋：用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。 通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小 时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡 熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。通常石蜡采用熔点为 56～58℃或60～62℃两种。 (7).切片:包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，切片机切片，切片厚 度为4～7um。 (8).贴片与烤片:用粘附剂-蛋白甘油将展平的蜡片牢附于载玻片。首先 在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片） 或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺 正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使 蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥， 也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。
第13章 免疫组织化学技术(共42张PPT)
➢ 电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定出基 因位点
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
《免疫组织化学技术》PPT课件
PTP课件
24
双桥PAP法原理
• 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥 抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比 PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合 物中的HRP催化底物显色。
PTP课件
25
双桥PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。
PTP课件
21
PAP法的原理
PTP课件
22
PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
PTP课件
23
PAP法的方法评价
• PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性 的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组 成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲 洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋 白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏 感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色 法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过 程较复杂。
PTP课件
3
免疫组化技术要点
• 标本的制作 • 抗体的选择 • 温育 • 改善标本的透过性 • 设立对照试验 • 免疫组化的结果判断
PTP课件
4
标本的制作
• 标本的类型
1.组织切片：①冷冻切片；②石蜡切片 2.印片 3.涂片
• 标本的固定 • 标本的保存 • 酶消化处理
PTP课件
5
设立对照试验
• （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2复合物，洗涤。
《免疫组化技术》课件
特点
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末
免疫组化PPT课件
1.细胞膜阳性
E-cad + in membrane
Esophageal carcinoma
18
免疫细胞化学阳性结果定位分布
2. 细胞浆阳性：
GFAP+ in cytoplasm of neuroglia cell.
19
免疫细胞化学阳性结果定位分布
3.细胞核阳性
C-fos+ in nucleus
在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊 和鉴别诊断。
其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学 反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
2
Immunohistochemistry
Esophageal carcinoma
E-cad + in membrane Wu Ming-Yao et al.
20
免疫细胞化学阳性结果定位分布
4.复合型： 核+胞浆阳性 注意：固定不及时，前处理过度 可以造成假阳性
21
免疫细胞化学阳性结果定位分布
5.微绒毛型 甲状腺、胃肠、胆管、卵巢腺癌的微绒毛 如上皮膜抗原
22
免疫组化阳性结果定位分布
1.局灶型 2. 片块型 3. 弥漫型 4. 网状型 5. 腺管型 6. 腔缘型 7. 菊团型
既 过 氧 化 物 酶 抗 过 氧 化 物 酶 复 合 物 法 (Perixidase Antiperoxidase Complex Method,PAP) 先将过氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗 ＨＲＰ；然后再与ＨＲＰ结合，形成一个稳定的多角形结 构（PAP）。 特点：⑴ 敏感性较高；
2．荧光素 指在高能量光波的激发下能产生荧光的物质。常用 的 有 异 硫 氰 酸 荧 光 素 （ FITC ） 、 四 甲 基 异 硫 氰 酸 罗 达 明 （TRITC）。
E-cad + in membrane
Esophageal carcinoma
18
免疫细胞化学阳性结果定位分布
2. 细胞浆阳性：
GFAP+ in cytoplasm of neuroglia cell.
19
免疫细胞化学阳性结果定位分布
3.细胞核阳性
C-fos+ in nucleus
在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊 和鉴别诊断。
其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学 反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
2
Immunohistochemistry
Esophageal carcinoma
E-cad + in membrane Wu Ming-Yao et al.
20
免疫细胞化学阳性结果定位分布
4.复合型： 核+胞浆阳性 注意：固定不及时，前处理过度 可以造成假阳性
21
免疫细胞化学阳性结果定位分布
5.微绒毛型 甲状腺、胃肠、胆管、卵巢腺癌的微绒毛 如上皮膜抗原
22
免疫组化阳性结果定位分布
1.局灶型 2. 片块型 3. 弥漫型 4. 网状型 5. 腺管型 6. 腔缘型 7. 菊团型
既 过 氧 化 物 酶 抗 过 氧 化 物 酶 复 合 物 法 (Perixidase Antiperoxidase Complex Method,PAP) 先将过氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗 ＨＲＰ；然后再与ＨＲＰ结合，形成一个稳定的多角形结 构（PAP）。 特点：⑴ 敏感性较高；
2．荧光素 指在高能量光波的激发下能产生荧光的物质。常用 的 有 异 硫 氰 酸 荧 光 素 （ FITC ） 、 四 甲 基 异 硫 氰 酸 罗 达 明 （TRITC）。
免疫组化课件PPT课件
李
三 华
特点
优点
特异性强，定位准；
结果直观；
形态学改变与功能和代谢相结合；
组织标本可用石蜡保存进性回顾性研究。
缺点
步骤多，影响实验成败的因素多；
以定位、定性和半定量研究为主，绝对定量
分析尚需标准化。
第四页，共28页。
中
心
实
验
室 李 三 华
二 免疫组化技术的基本步骤
1.制片
组织切片(石蜡切片、冰冻切片)
IHC,WB,FC,ELISA,IP； 石蜡切片(IHC－P),冰冻切片(IHC－Fr),
甲醛固定冰冻切片（IHC-FoFr）。 (5)与抗原结合的部位
亚型， C-或N-，胞外区域或胞内区域。 （6）公司，价格。
第十七页，共28页。
中
心
实
验 室 李 三
国外主要抗体试剂公司
华
用途
公司
用途
最全 离子通道
李
三
华
常用酶
辣根过氧化物酶（ Horseradise peroaidase，HRP)
底物：DAB(四盐酸二氨基联苯胺)，产物为棕褐色。
碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase, AP）
底物：NBT（四氮唑蓝），产物为紫蓝色。
葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase,GOD）
底物：葡萄糖，产物为蓝色。
第二页，共28页。
中
心 实 验 室
李
应用
三
华
凡是组织细胞内具有抗原性的物质
（肽类、蛋白质、细胞因子、受体、激素
、神经递质、核酸、表面抗原）或抗体均
可用免疫组织化学方法显示而进行定性、
定位分析或定量研究，进而深入研究其
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辣根过氧化物酶/HRP：DAB、AEC
碱性磷酸酶/AP ：AP-Red、NBT/BCIP
酶的选择
HRP染色结果比AP染色结果保存时间长
含有内源性HRP的组织切片：首选标记酶为AP
AP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记，对比清晰
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-
10
06
04
02
07
失 败
-
19
06
04
02
07
失 败
05
技 术
03
基 本
01
原
要
原
质
因
结
点
操
理
基
量
果
作
本
控
判
流
概
制
读
程
念
CONTENTS
目 录
2019/11/9
-
20
结果判读
玻片轻轻压与组织切面，细胞粘附于玻片上，然后固定）（缺点是细胞分布不均匀，细 胞有重叠）
各种体液、穿刺液：可直接涂片（血液、组织液等）或离心后涂片（细胞少脑脊液、腹
水等）。
培养细胞：悬浮细胞离心后涂片；贴壁细胞可爬片。
取材时间要早（24小时以内），避免组织自溶，使抗原变性消失或严重弥散。
缺点：不易保存（-80℃）；细胞内易形成冰晶而破坏抗原结构，造成
抗原的弥散使定位不准确。
能做石蜡切片的就能做冰冻切片，能做冰冻切片的不一定能做石蜡切片！
2019/11/9
-
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技术要点
抗原修复
免疫组化在制片的过程中由于广泛的蛋白交联而使其组织的某些抗原
决定簇发生遮蔽、致使免疫细胞化学的信号减弱或消失等不良效应。 使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法，即抗原修复。
免疫组化技术简介
2019/11/9
06
04
02
07
失 败
05
技 术
03
基 本
01
原
要
原
质
因
结
点
操
理
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果
作
本
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判
流
概
制
读
程
念
CONTENTS
目 录
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06
04
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失 败
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技 术
03
基 本
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原
要
原
质
因
结
点
操
理
基
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果
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控
判
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概
制
读
程
念
CONTENTS
目 录
2019/11/9
抗原修复常用方法：①酶修复法（胰蛋白酶、胃蛋白酶和无花果酶）；
②热修复（高压修复、微波炉修复、煮沸法）
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技术要点
抗体的保存
分装密封保存，避免对抗体的污染 并注明标记（批号、名称、效价、量） 根据厂家提供的保存条件保存 避免反复冻融而使抗体效价降低
2019/11/9
2019/11/9
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4
基本概念
抗原（Antigen, Ag）
一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细
胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物 质。
抗体（Antibody, Ab）
机体受抗原刺激后由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与
相应抗原发生反应的球蛋白，称为免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。
2019/11/9
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基本概念
抗体的结构
2019/11/9
二抗：羊抗鼠
一抗：鼠抗人
V区氨基酸的种类和排列顺 序千变万化，故可形成许多 种具有不同结合抗原特异性 的抗体。（抗原特异性，第 一抗体）
C区氨基酸的组成和排列在 同一种属动物Ig同型L链和同 一类H链中都比较恒定。
制备第二抗体的重要基础。
-
组201织9/1切1/9块厚度不易超过0.5cm，以便固-定液的及时渗透及脱水。
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技术要点
固定
目的：①凝固蛋白，终止细胞内酶的作用，防止细胞自溶；固定细胞
形态和结构；②保持组织细胞的抗原性；③防止细胞层脱落；④去除 细胞内的脂类（妨碍抗体结合）；⑤防腐。
注意事项：①组织块不宜过大；②固定液的量一般以组织块大小的30
6
基本概念
单克隆抗体
由同一克隆细胞产生，针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性
抗体。
多克隆抗体
由不同细胞产生，其免疫化学特性不同，能够识别抗原表面多种抗原
决定簇的多种抗体的混合物。
基因工程抗体
在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，甚至是在人工全合成
后导入受体细胞表达产生的新型抗体。
2019/11/9
-
7
06
04
02
பைடு நூலகம்
07
失 败
05
技 术
03
基 本
01
质
原 因
结
要 点
操
原 理
基
量
果
作
本
控
判
流
概
制
读
程
念
CONTENTS
目 录
2019/11/9
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基本原理
间接法 PAP法 直接法 LSAB法
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显色 抗体 抗原
9
基本原理
显色系统
酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物
一抗（属种、单/多抗、浓缩/即用型） 二抗（属种、标记方法） 显色方式
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技术要点
取材
组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）；大小（1×1×0.5cm）；取病变组织与正
常组织交界处；避免对组织标本的损伤和挤压。
印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 (经新鲜标本最大面积剖开，充分暴露病灶，将载
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技术要点
石蜡切片
优点：对组织结构形态保存好，对组织的定位很准确，是观察组织和
细胞结构的理想方法，可以用于回顾性研究。
缺点：抗原常被封闭和破坏。对抗原的保存不如冰冻切片。
冰冻切片
优点：能避免石蜡切片因固定，脱水，浸蜡等对抗原的损失，较好的
保存组织抗原的免疫活性，适用于不稳定的抗原。
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技 术
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基 本
01
原
要
原
质
因
结
点
操
理
基
量
果
作
本
控
判
流
概
制
读
程
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CONTENTS
目 录
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操作流程
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失 败
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技
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基 本
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原
要
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CONTENTS
目 录
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技术要点
免疫原理的选择
倍为宜；③必须选择对组织渗透力强，同时又不致使组织过度收缩或 膨胀的试剂；④固定时间一般以24小时为宜。
固定液的选择：所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学
反应选择适当的固定剂。如甲醇、丙酮、甲醛、乙醇等。
甲醛固定后，抗原容易被掩盖，形成醛键或羧甲基，使蛋白交联封闭部分抗原表位。
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基本概念
免疫组化 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗
体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、 酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白 质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术 (immunohistochemistry, IHC) 或 免 疫 细 胞 化 学 技 术 (immunocytochemistry, ICC)。