免疫组化技术课件

隔水热抗原修复法：
①切片脱蜡至水。
②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。
③自来水洗，蒸馏水洗。
④切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）中，
边同容器一起放入水锅中加热，其间应不断用温
度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温
度后（92℃↑）。即开始计时，持续40分钟。 ⑤待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后 按选定好的免疫组化染色方法进行染色。
② 间接法

间接法也称夹心法，是将酶标记在第二抗 体上（第二抗体为抗第一抗体的抗体）， 形成抗原-第一抗体-第二抗体-HRP复合物， 然后进行显色。该法要求第二抗体与第一 抗体应是不同种属的动物产物。间接法应 用广泛，只需标记一种二抗就可以检测众 多相同种属来源的一抗。
免疫组化SP法的基本步骤
（1）石蜡切片脱蜡至水。 （2）抗原修复 （3）3% H2O2室温孵育5~10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。 （4）蒸馏水冲洗，PBS洗。 （5）5%~10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min。倾去 血清，勿洗，滴加适当比例稀释的第一抗体或即用型第一抗体，37℃孵育 2h或4℃过夜。 （6）PBS冲洗，5min×3次。 （7）滴加适当比例稀释的二抗，37℃或室温孵育10~30min。 （8）PBS冲洗，5min×3次。 （9）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释）或辣根酶标记 链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30min。 （10）PBS冲洗，5min×3次。 （11）显色剂显色（DAB或AEC）。 （12）自来水充分冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，苏木精复染，中性树 胶封片。
荧 光： 在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发 出较激发光波长更长的可见光并随照射停止而消失 荧光显微镜： 荧光显微镜的光源提供各种激发光，如 紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围）， 使受检标本内的荧光物质发出发射光
海马细胞 微管蛋白 绿色(胞体、树突) 轴突终末蛋白 红色(突触)
培养的成纤维细胞 微管呈绿色 核呈蓝色
抗原暴露和修复
石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定剂 甲醛使蛋白质发生凝固, 在发生凝固的过程中可 引起自身和不同蛋白质之间通过甲基化桥使蛋白 质发生交联, 导致蛋白质三级或四级结构的折叠 方向发生改变, 并形成网络状结构而掩盖抗原决 定蔟。 染色不理想，甚至出现假阴性，因而在 进行免疫组化反应之前，需要抗原暴露和修复， 可使抗原决定簇重新裸露。 抗原暴露和修复常用方法有二种, 一是用酶消 化, 二是用热处理(微波辐射法、高压法及隔水加 热法)
组织切片中内源性酶的阻断

内源性过氧化物酶 主要存在于红细胞、 嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞 和组织内。阻断方法：最常用 0.3%~0.5%H2O2-甲醇液，作用 15~30min，阻断液必须使用时新鲜配制。 由于阻断内源性过氧化物酶常同时导致被 测抗原变性（使特异性着色减弱），而大 部分组织不含有内源性过氧化物酶，所以 阻断内源性过氧化物酶一般不必作为常规 步骤。
组织的透明、浸蜡、包埋



组织透明的目的是便于浸腊包埋 组织透明不彻底的原因主要是固定、脱水 不良以及透明剂的纯度不够。 最常用的透明剂为二甲苯 浸蜡包埋是使蜡进入到组织中使其变硬便 于切片。蜡的熔点一般为56-58 ℃。
包埋蜡的温度应与组织块温度接近。

组织石蜡包埋

大组织：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～
％乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min （肉眼观察），石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡 Ⅲ1～2h。
切

片
载玻片的清洁：
清洁液浸泡24小时后依次自来水、双蒸馏水 洗，95%酒精浸泡2小时，擦拭干净。如需开 展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。

胃蛋白酶消化法：
主要用于细胞间质抗原的检测, 如纤维蛋白及各 类胶原的现示。使用工作浓度为0.4％。 配制方法: 称取400mg胃蛋白酶加入到 100ml 0.01mol/L HCl中, 组织切片在 37℃消化30～60min。

胰蛋白酶消化法：
最常用,主要用于细胞内抗原的检测。使用 工作浓度为0.05～0.1％。 配制方法: 称取0.05g或0.1g胰蛋白酶及 0.1g无水氯化钙, 加入到100ml蒸溜水 中, 待溶解后用0.1mol/L NaOH调 PH值至7.6。 组织切片在37℃消化10～40min。
蛋白酶K消化法
主要用于原位杂交前标本的处理, 常用的工作 浓度为0.025mg/ml(25ug/ml)。 配制方法: 称取0.025mg蛋白酶K加入到 1mlPK缓冲液中。(PK缓冲液: 1mol/L PH8.0的Tris-Hcl 10ml;0.5mol/L EDTA 10ml; 双蒸水80ml, 三液充分混合即可)。
切片的制作

组织的固定 组织石பைடு நூலகம்包埋 切片
组织材料的固定

目的:
使细胞内蛋白质凝固，终止胞内酶活 化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形 态与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原 抗体反应的类脂，最主要的是保存组织细 胞的抗原性，在染色和反复清洗的过程中 使抗原不致释放。

影响固定的因素
1. 温度 一般固定液固定效果随温度升高而 加强，以室温22 ℃ 为常用。
没有一个抗体受到共价键标记，保留了免疫活性，因此
敏感性大大提高。非标记抗体免疫酶常用的有酶桥法， 辣根过氧化物酶抗辣根过氧化物酶复合物 （peroxidase antiperoxidase complex method, PAP）法、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物（APAAP）
3．多聚螯合物酶法

该法是以高分子葡聚糖多聚化合物或氨基 酸为骨架与抗体结合，将抗体（一抗或二 抗）与HRP结合在一起，形成葡聚糖 +HRP+抗体的巨大复合物，然后通过酶的 底物进行显色。该法简便、敏感性高。其 方法包括EPOS法（enhanced polymer one-step staining）、EnVision法（又 称为ELPS法 enhance labelled polymer system）、UIP法、Power Vision法。
免疫酶组织化学

酶标记抗体法
非标记抗体免疫酶法 多聚螯合物酶法


酶标记抗体法
是用结合物将酶标记（共价键或非共价键方法结合）在 抗体分子上，通过抗原-抗体反应使抗原-抗体复合物 上带有酶分子，再借助酶对底物的特异性催化作用， 在抗原-抗体反应部位形成不溶性有色产物，在显微镜 下观察组织中抗原的性质和分布。可用作标记抗体的 酶有多种，但最常用的为辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase, AKP）其方法可分直接法 和间接法两种。 直接法 直接法是将酶（如HRP）直接标记在特异性抗体上， 然后与组织中的相应抗原相结合，形成抗原-抗体HRP复合物，最后进行显色。
120min，95％乙醇Ⅰ 2h，95％乙醇Ⅱ 2h，95％乙 醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30 ～60min，无水乙醇 Ⅱ30～60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯 Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min（可视观察结果而定），石蜡 Ⅰ30min,石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。

小组织：75％乙醇30min，85％乙醇30min，95
直接加热法 最常用, 操作方法是将介质溶液用烧 杯在电炉上加热至100℃, 放入切片 并保持95～100℃20min, 在室温 中自然冷却20min即可。 热修复热介质 0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液, 最常用。

微波辐射抗原修复法：
①切片脱蜡至水。 ②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。 ③自来水洗，蒸馏水洗。 ④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内 微波辐射10分钟。 ⑤待修复液自然降至室温后，PBS洗3次，随后按 选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。
直接法
间接法
免疫荧光技术 免疫荧光技术将 荧光素作为标记物 使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显 微镜下可见，从而显示抗原物质的定位
荧光素
作为染料在激发光照射下能产生荧光的一类化合物
１.异硫氰酸荧光素 FITC ２.四乙基罗达明 ３.四甲基异硫氰酸罗达明 ４.藻红蛋白 ▲ 呈现不同的荧光： 绿色荧光 (FITC) 橙色荧光 橙红色荧光 红色荧光等

切片粘合剂的使用：
多聚赖氨酸（分子量200KD）：0.05%浓度， 浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜 干燥备用。

切片：
石蜡切片：
(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)60℃烤片3-8h。 (3)切片厚2～4μ m。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4℃保存数年
冰冻切片：
2、非标记抗体免疫酶法
在酶标记抗体过程中可降低部分抗体和酶的活性，使得抗
体的效价降低。另外，血清中的非特异性抗体也可被酶
标记，引起非特异性背景。非标记抗体免疫酶法是先用 酶（HRP或AKP）去免疫动物，使其产生抗酶抗体，再 将该抗酶抗体与酶结合，形成五环的复合物，例如PAP （HRP）、APAAP（AKP）等复合物。该复合物由于
组织抗原
抗体
标记物
1 2 3 4 荧光 酶 亲和技术 金标
标记抗体
免疫细胞化学反应原理：
组织抗原
＋
标记的抗原抗体复合物
标记抗体
两种免疫细胞化学反应方法
直接法
间接法

组织与细胞材料的制备 免疫组织化学方法 应用


组织与细胞材料的制备



组织石蜡切片制作 组织冰冻切片制作 细胞爬片制作 细胞涂片制作