5.免疫组化技术-实用篇
免疫组化技术
免疫组化技术免疫组化技术是现代生物学研究领域中一项重要的实验技术，它通过利用抗体与特定抗原的高亲和力结合特异性标记，可以准确地检测和定位分子在细胞和组织中的分布，并在这一基础上进行生物学功能的研究。
本文将对免疫组化技术的原理、应用以及发展趋势进行详细介绍。
一、免疫组化技术的原理免疫组化技术基于生物体对抗原与抗体的免疫反应，利用抗体与抗原的特异性结合来标记和检测感兴趣的分子。
免疫组化技术的关键步骤包括：抗原的固定、抗原的暴露、与抗原的特异性结合和信号检测等。
在免疫组化技术中，抗原通常需要进行固定，以保持其在组织中的形态和位置不变。
一般来说，抗原可通过形成固定化复合物或被共价结合到载玻片或膜上。
随后，我们需要将抗原从组织中溶出，以使其暴露于抗体。
这一步骤通常涉及脱水、脱脂和脱钙等处理。
暴露后的抗原可以与特异抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
为了标记抗原-抗体复合物，我们需要选择适当的检测系统。
目前常用的检测方法包括荧光染色、酶学染色和放射性标记等。
其中，荧光染色技术具有高灵敏度和分辨率，能够利用荧光显微镜直接观察标记物的分布。
二、免疫组化技术的应用免疫组化技术在许多研究领域中广泛应用。
在医学领域，它常用于研究肿瘤形成机制、诊断和预后判断。
通过免疫组化技术，我们可以检测和定位许多肿瘤标志物，如癌胚抗原（CEA）和肿瘤相关抗原（CA）等，从而帮助医生进行早期诊断和治疗。
在神经科学领域，免疫组化技术被广泛用于研究神经元发育、突触形成和神经退行性疾病。
通过标记神经元特异性蛋白质，如神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经纤维酸性蛋白（NF）等，可以清晰地观察和研究神经元的结构和功能。
此外，免疫组化技术在细胞和分子生物学研究中也具有广泛的应用。
通过对细胞内蛋白质、DNA和RNA等分子的定位和检测，我们可以研究细胞的生物学功能和基因调控机制。
例如，通过检测特定蛋白质的表达和定位，可以研究调节细胞周期和细胞分化的信号通路。
免疫组化步骤范文
免疫组化步骤范文免疫组化（immunohistochemistry, IHC）是通过对组织切片进行染色，利用免疫反应性的抗原抗体反应，以检测和定位组织切片中的特定抗原或蛋白质的技术。
免疫组化在临床病理学和研究中被广泛应用，可以提供有关疾病诊断、病理机制研究、分子分型和药物靶向治疗等方面的信息。
1. 抗原修复（antigen retrieval）：抗原修复是为了使组织样本中的目标抗原或蛋白质恢复到免疫表位充分暴露的状态。
组织切片有可能存在形态学变化、组织化学改变、酸碱性改变或氧化还原状态的变化，这些变化导致了抗原稀释或失活。
抗原修复的方法通常包括热敏抗原恢复和酶消化抗原恢复。
热敏抗原恢复是将组织切片放置在高温缓冲液中，以恢复抗原的形态和免疫活性。
酶消化抗原恢复是通过酶的消化作用，破坏组织切片中的蛋白质交联结构，使抗原恢复活性。
2. 阻断（blocking）：阻断是为了防止非特异性背景信号的产生。
在进入下一步的抗体孵育之前，使用非特异性的蛋白质来覆盖未被抗体结合的区域，防止后续过程中非特异性背景信号的形成。
通常使用的非特异性蛋白质包括牛血清蛋白、羊血清蛋白、鱼胶蛋白等。
3. 一抗孵育（primary antibody incubation）：在这一步骤中，使用特异性抗体与目标抗原或蛋白质结合。
抗原抗体反应是免疫组化的核心步骤，这一步骤的可靠性和特异性对结果的准确性和解释性起着至关重要的作用。
选择合适的一抗对研究目的至关重要，一抗通常通过免疫荧光标记、酶标标记或生物素标记等方式来实现。
4. 二抗孵育（secondary antibody incubation）：在这一步骤中，使用抗一抗体结合免疫球蛋白和抗体复合物。
一抗与目标抗原结合后，二抗与一抗的Fc区结合，从而形成一个抗原-一抗-二抗复合物。
二抗通常标记有酶（如辣根过氧化物酶-HRP）、荧光物质（如荧光素酶）或生物素等。
5. 显色反应（color development）：根据标记的二抗的性质，选择合适的显色方法。
免疫组化教程范文
免疫组化教程范文免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质、抗原或其他分子的方法。
通过IHC技术，可以在组织切片中观察到染色物质的分布和定位，从而研究蛋白质表达、分布和定位在正常生理和病理状态下的变化。
IHC的基本原理是将待检测的抗原与特异性抗体结合，然后通过染色剂标记该抗体，使得抗原可以在显微镜下被直接或间接观察到。
以下是IHC的基本步骤：1. 制备组织切片：从病理标本或实验动物中取得需要研究的组织，并用形alin固定和包埋成蜡块。
然后，用切片机切出厚度约为4-6微米的组织切片，然后将切片贴附到载玻片上。
2.抗原修复：组织切片在生理条件下（如溶液中）固定后，可能会导致抗原的结构和形态发生改变。
因此，需要进行抗原修复来恢复抗原的结构。
常用的抗原修复方法包括热敏抗原修复（如蒸汽加压或热水浴）和酶解抗原修复（如消化蛋白酶）。
3.阻断非特异性结合位点：组织切片中存在一些非特异性的结合位点，容易和标记抗体结合，导致假阳性结果。
因此，需要使用一种非特异性抗体（例如牛血清白蛋白）在切片上进行预处理，阻断非特异性结合位点。
4. 标记抗体：选择适当的抗体来结合待检测的抗原。
这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，且必须能够特异性地结合到待检测的抗原上。
此外，还需要选择一种染色剂将抗体标记，常用的染色剂有酶标记和荧光标记。
酶标记常用的包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），而荧光标记则常用的有荧光素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）等。
5.洗涤：在标记抗体过程中需要进行多次洗涤步骤，以去除未结合的抗体和其他非特异性结合物质。
洗涤的目的是提高特异性和灵敏度。
6.反应-可视化：将标记抗体溶液加到组织切片上，使其与待检测的抗原结合。
如果使用酶标记抗体，则需要加入底物使其转化为可见的染色产物；如果使用荧光标记抗体，则直接在显微镜下观察荧光信号。
7.染色和显微镜观察：使用显微镜观察切片染色后的结果。
免疫组化技术
组织学切片制作
石蜡切片：观察组织细胞结构的理想方法
较好的保持组织细胞的形态结构 切片有连续性 长期存档，供回顾性研究 由于石蜡切片可以切到4微米左右，所以原位杂交
探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到 的颜色/形态都较冰冻切片好。 抗原的保存量不如冰冻切片。
抗原修复
化学方法 ：胰蛋白酶、胃蛋白酶
优点：此方法由于微波场内极性分子、离子高速 运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复 正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对 抗原再现效果好。
抗原修复
高压加热法暴露抗原 ：将玻片浸入抗原修复液 内，置高压锅中高压 2～3min，可取得极好的效 果。
优点：由于高压下受热均匀，特别适用于大批量 标本的染色。 应用于一些较难修复的抗原。
量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中
生物素——抗生物素染色法最常用（ABC法）。
常用的染色方法
免疫荧光法:最早建立的免疫组织化学技术。
• 基本原理：它利用抗原抗体特异性结合的原理， 先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞 或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗 原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发 出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的 定位，进而还可进行定量分析。
加热方法 水浴加热法 微波照射法 高压加热法
抗原修复
化学方法 :主要是通过一些酶的作用，使抗原决 定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
•胰蛋白酶：主要用于细胞内抗原的显示；-：一 般使用浓度为0.05％～0.1％，消化时间为37 度 10～40min， •胃蛋白酶：主要用于细胞间质抗原的显示。一般 使用浓度为0.1%～0.4％，消化时间为37 度30～ 180min， 例如：Laminin、CollagenIV
免疫组化技术
免疫组化技术免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的重要技术手段。
它通过利用抗体与其特异性抗原相互作用的特性，实现对细胞、组织和分子的检测和定位。
本文将从免疫组化技术的原理、应用、优缺点等方面进行介绍。
首先，免疫组化技术的原理主要基于抗原与抗体的高度特异性反应。
抗原一般是指能够被免疫系统识别并引发抗体产生的物质，它可以是细胞膜上的蛋白质、细胞核中的核酸、胞浆中的酶等。
而抗体是机体免疫系统产生的一类蛋白质，具有高度特异性与抗原结合。
在免疫组化技术中，通常选择一种与目标物高度特异性结合的抗体，通过与目标物反应形成抗原-抗体复合物，再利用染色、荧光等方法对其进行检测和定位。
免疫组化技术广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
首先，在生物医学研究领域，免疫组化技术可以用于检测和定位特定蛋白质或细胞标志物。
例如，科研人员可以利用特异性抗体对肿瘤标志物进行检测，从而实现早期肿瘤的筛查和诊断。
此外，免疫组化技术还可以用于研究免疫反应、细胞分化和分子信号传递等生物学过程。
其次，在临床诊断中，免疫组化技术可用于肿瘤诊断、感染病的检测和诊断，以及免疫性疾病的诊断等。
临床医生可以利用免疫组化技术对病理切片进行染色，帮助判断疾病类型和严重程度。
免疫组化技术具有多种优点。
首先，它具有高度特异性和敏感性。
由于抗体与特定抗原的结合是高度特异性的，因此免疫组化技术可以实现对目标物的准确检测和定位。
其次，它可以同时对多个目标进行检测。
通过同时使用多个不同特异性的抗体，可以对多个目标分子进行检测，从而提高检测效率。
此外，免疫组化技术还可以实现对细胞或组织的形态学和功能的研究，有助于揭示生物学过程的机制。
然而，免疫组化技术也存在一些限制和不足之处。
首先，技术操作复杂。
免疫组化技术需要对抗体的选择、染色剂的选择和实验条件等进行严格控制，技术操作要求较高。
其次，需要合适的阳性和阴性对照。
在使用免疫组化技术时，需要合适的阳性和阴性对照样品，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组织化学技术
3、目前几种常用免疫组化方法简单介绍
1）免疫荧光方法
利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上 荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在 荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发 光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中 某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光 技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊 断、检验中应用较广。
化物酶的活性 PBS冲洗、浸泡5分钟，3次 正常山羊血清室温封闭10分钟
DAB是-二H苏R氨木P基结素联合是苯物从最洋常苏木
胺 生是色用组过底的化中剂氧物底,提，化原物取 它物 在位甩常的在酶过杂在去一被的氧交免种氧,血疫染化清色后，加入适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或 化氢W的e生存st成在er苏下n4木失℃bl精去o过t，夜同媒 电 变子化等胞而和膜或染价呈积显组剂的现累色织（ 铁出 ，P或内常或颜形B检源S用铝色成冲测性的的细的洗是盐三），浸泡5分钟，3次 浅棕过色氧一不化起溶物使性滴酶用产中加，物应能。多用够聚使螯合物，37℃孵育30分钟
4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、 酶修复方法。自然冷却，再用3分钟×3次.
5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。 6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜（最好复温
）。PBS冲洗，3分钟×5次。 7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30min-1h。8）PBS冲洗
5）二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸 索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反 应。
6）封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的 抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一 滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角 ，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液 体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产 生气泡。
免疫组化技术在疾病诊断中的应用
免疫组化技术在疾病诊断中的应用随着生物医学领域的飞速发展，疾病的检测和治疗手段也在不断更新换代。
免疫组化技术就是其中之一，它应用了分子生物学、免疫学等学科的核心理论和技术，为疾病诊断提供了强有力的技术支撑。
但是，相对于其他技术来说，免疫组化技术的应用范围和定位可谓是口耳相传，今天，我们就来了解下它的应用。
一、免疫组化技术的原理免疫组化技术是利用抗体与抗原的特异性结合性质，针对被检测物在细胞或组织中的位置和数量进行定位与计量的方法。
免疫组化技术在诊断发育异常，鉴别组织类型，评估分子分型等方面起着重要作用。
通常包括以下三个步骤：1.抗原修复：对组织标本进行脱水、透明化、石蜡包埋、切片处理后，需要将变性的蛋白质抗原复原，使其在免疫反应中保持原有的构象和活性。
2.抗体标记：采用特定的抗体，针对需要检测的抗原进行特异性识别。
通常会利用荧光素、酶等物质与抗体进行标记。
3.染色反应：通过化学反应使标记后的抗体与抗原发生特异性反应，然后利用化学染色方法将反应产物显示出来。
由于该方法产生直接的显色反应，可以直接在显微镜下观测到抗原的位置、数目和类型。
二、1.肿瘤标志物检测肿瘤标志物是特定癌细胞产生的分子，可以通过类似免疫组化的方法进行检测。
凭借其高度特异性的优势，与肿瘤相关的标志物已被广泛运用于临床诊断中。
例如，抗体检测可以用于检测肺癌、鼻咽癌和乳腺癌等常见癌症，可作为确诊和治疗指南的依据。
2.医学遗传学检测用于检测胚胎性基因突变的技术已经应用于不孕不育和男性生殖系统疾病的研究中。
广泛利用的检测技术包括比色法、荧光抗体法和原位杂交法等。
该技术可在多种组织类型中用于检测精子数、精子质量和卵子质量等遗传学特征。
3.炎症诊断炎症标志物可以识别并跟踪炎性疾病的病理过程，如红斑性狼疮和类风湿关节炎。
适当的抗体检测可为长期的追踪和监测提供经济而可靠的方法。
4.神经学和心理学研究镜片染色和FISH技术的应用可以为神经学和心理学研究提供直接的可视化反馈，使分子分型分析更加容易。
免疫组化技术实用篇教学课件
2023免疫组化技术实用篇教学课件pptcontents •免疫组化技术简介•免疫组化技术实验流程•免疫组化技术实验数据分析和解读•免疫组化技术实验优化和提升•免疫组化技术前沿进展和发展趋势目录01免疫组化技术简介免疫组化技术是一种用于研究生物组织中蛋白质表达和分布的生物学技术。
定义免疫组化技术分为直接法和间接法两大类，其中间接法应用最为广泛。
分类定义与分类直接法利用特异性抗体直接与组织切片中的目标抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，再用标记物进行显色，以检测抗原的存在。
间接法利用特异性抗体与组织切片中的目标抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，再用标记物进行显色，以检测抗原的存在。
免疫组化技术的原理1免疫组化技术的应用23免疫组化技术可用于疾病诊断，如癌症、自身免疫性疾病等。
疾病诊断免疫组化技术可用于科学研究，如在细胞和分子水平上研究生物大分子的相互作用和功能。
科学研究免疫组化技术可用于药物研发，如检测药物在组织中的分布和作用。
药物研发02免疫组化技术实验流程包括组织样本、抗体、抗原等；实验准备实验材料准备如显微镜、染色机等；实验仪器准备熟悉实验操作流程和注意事项。
实验操作准备切片制作将组织样本制作成切片，并进行脱蜡、水化等处理；加一抗将抗体稀释后加入切片中，孵育适宜时间；抗原修复使用抗原修复液对切片进行修复，以暴露出抗原；加二抗将标记有荧光素的二抗加入切片中，孵育适宜时间；阻断加入阻断液，以抑制内源性过氧化物酶活性；观察与拍照用荧光显微镜观察染色结果，并进行拍照记录。
实验步骤及操作流程实验注意事项实验前务必熟悉操作流程和注意事项；对于不同的组织类型和抗体，应根据具体情况调整实验条件和操作步骤；实验过程中要注意安全，避免受伤和感染；在实验过程中要保持实验室的清洁和整洁，遵守实验室规范。
03免疫组化技术实验数据分析和解读03定量PCR使用荧光定量PCR技术，检测样本中特定基因的表达水平，分析免疫组化染色的结果。
《免疫组化技术》课件
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末
免疫组化技术
3 未标记抗体酶法：所用抗体均未标记，利用第二抗体作为桥 将第一抗体和终抗体连接起来，而终抗体作为抗酶抗体，产生于 第一抗体来源相同的动物种属。由于所用抗体未标记，避免了共 价结合，较好的保护了抗体和酶的活性，敏感性增加。 目前常用的未标记抗体酶法 是用桥抗体将第一抗体和标记的检 测试剂复合物连接起来。包括：过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP） 复合物； 硷性磷酸酶-抗硷性磷酸酶（APAAP）复合物；抗生物素 蛋白-生物素-过氧化物酶（ABC）复合物等
优点 敏感性高，应用广泛 可用于双标染色
方法：1）石蜡切片脱蜡到水或者冰冻切片PBS洗10分钟。 2）0.2-1%TritonX-100 30min 3) 3-10%二抗动物的正常血清 30 min, 37oC ，不 洗入下一步 4)滴加适当稀释的一抗，4oC过夜或37oC 12h。 5) TBS洗 3 次，每次5-10 min 6)荧光标记的二抗。 1-2 h, 37oC
四
染色方法
免疫组织化学染色方法的类型
1、直接法：用抗原免疫动物制备的抗血清，
称特异性抗体即第一抗体。将标记物与一抗结合。 反应：组织的抗原 + 带标记物的一抗
抗原抗体复合物
+ 检测标记物
在组织原位 形成可视的 沉淀物
2 间接法：第一抗体未标记，而第二抗体以荧光素、酶或胶体
金等标记
（1）二抗制备：用产生第一抗体动物的血清免疫另一种属动物，获
IgM分子结构
抗体的种类：有多克隆抗体和单克隆抗体。
多克隆抗体Polyclonal antibody ：用含多种 抗原决定基的抗原免疫动物，刺激多个B细胞克隆产 生针对多种抗原决定基的不同抗体，为多克隆抗体， 其免疫血清是含有多种抗体的混合物。特异性不高，
免疫组化步骤范文
免疫组化步骤范文免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用抗体来检测和定位特定抗原在组织样本中的表达的技术。
它是病理学和分子生物学中非常常用的技术之一，广泛应用于疾病的诊断、治疗和研究。
1.取样和制片：首先从活体组织中取得样品，这可以通过标本切片、穿刺活检或手术切取的方式来获取。
然后，将样本固定在福尔马林等适当稳定固定剂中，以保持组织的形态结构和抗原的完整性。
接下来，将固定的组织块进行脱水和包埋，制作成薄片，以便于后续的染色和分析。
2.抗原恢复：对于一些抗原，固定和包埋过程可能会导致其空间和/或结构性改变，并使其与抗体的结合受到抑制。
因此，在进行染色之前，需要通过抗原恢复步骤来恢复抗原的原始状态。
这通常包括对组织样本进行煮沸处理或酶解等热或化学诱导方法，以打开抗体与抗原结合的位点。
3.抗体染色：在免疫组化中，抗体是关键的组分。
通常，会使用特异性的初级抗体与目标抗原结合。
该初级抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
这些抗体通常是经过酵素、荧光或放射性标记的，以便于可视化抗原的位置和定位。
4.第二抗体标记：在免疫染色中，为了提高信号的强度，需要使用能够与初级抗体结合的第二抗体。
这个第二抗体通常是与荧光物质、酵素或金颗粒等标记物结合的。
这样，在光学或电子显微镜下可以更容易地观察到抗原的位置。
5.可视化：通过对样本进行可视化，可以观察到抗体与抗原的结合情况。
染色的结果可以是可见的颜色、荧光等。
在可见染色中，通常使用染色剂，如二氧化硅染剂、二氮化钼染剂等。
对于荧光标记的样本，可以使用相应的激光或滤光片来观察荧光信号。
最后，在显微镜下观察和记录染色结果。
6.结果分析：在免疫组化结果分析中，需要对染色的结果进行定性和定量的评估。
这可以包括测定抗原的表达强度、局部化和分布等。
可以使用计算机软件和图像分析算法来辅助结果的定量和分析。
总的来说，免疫组化是一种可以检测和定位特定抗原在组织中表达水平的重要技术。
免疫组化技术
7、SP反应 SP反应 • 加入SP后放入37度烤箱中30 min。 • 用PBS洗5次×5 min； 8、显色 • 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染 液），显色时间控制在约5 min（3～10 min） ，由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避 光）（1:20储备液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制 。 :50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，20 ℃保存。
免疫组化的作用
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原 如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、 ，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷 受体、 激素、 脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等 都可用相应的特异性抗体进行检测。 都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组化的特点
特异性强 敏感性高 定位准确、 定位准确、形态与功能相结合
结果分析： 结果分析：每张切片选择5个高倍镜视野 （400X），应用图像分析系统进行定量 灰度扫描后进行分析
设备
恒温箱（水浴锅）、冰箱、切片 机、载玻片和盖玻片、高压锅或 微波炉、染色缸、显微镜、计算 机图像分析系统
所用试剂
· 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加双蒸水至1000 ml；1000 ml 0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH2PO4·2H2O＋58.02 g Na2HPO4·12H2O in 1000 ml双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH2PO4·2H2O：15.6 g in 500 ml ddH2O（重蒸水 ）；B. 0.2 M Na2HPO4·12H2O：71.632 g in 1000 ml dH2O（蒸 馏水 ））。 • Citrate Buffered Saline（0.01 M柠檬酸缓冲液， PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH2O（ A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至 1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g加双蒸水至1000 ml）。
免疫组织化学技术
免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体的保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。
如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L）,就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。
免疫组化技术及注意事项
4、免疫组化阳性结果的统计
Image-Pro Plus的主要用途是分析测量图象
照片中的黄色部 分是免疫组化染 色的阳性表达成 分。处理目标是 通过测量图片中 黄色部分的"黄" 度来反映相应蛋 白表达的的"量"
4.1 校正光密度
图片的光强单位与测量中的光密度单位的不一致
计算机图片格式中，纯黑的点的“亮度”为零，其 灰度gray=0；纯白点的“亮度”为255，其灰度 gray=255
单克隆抗体技术
1.3 抗体的保存
抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳定， 易保存；浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白 蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15％NaN3防 腐剂以延长保存时间。
酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3， 否则会抑制酶的活性。
抗体浓缩液-20℃保存两年，融解后抗体于2-8℃ 可以保存一个月，稀释抗体在4℃下可存放1-3天， 超过7天效价显著降低。
替代对照
PVN中Fos表达
3、免疫组化正式实验
3.1 步骤
组织 固定
脱水 透明 封片
冰冻 切片
阻断内 源性酶
显色 复染
二抗 处理
封闭 处理
一抗 处理
3.2 注意事项
组织固定 保持细胞固有形态和结构，保存组织细胞的抗原性
固定液的选择 ：免疫组化技术成功与否的基础。 不同抗原稳定性各不相同，对固定液的耐受性差 异较大。可作多种固定液对比，从而选出理想的 固定液。常用中性缓冲多聚甲醛液。另有Bouin’s 液、Zanboni’s液、Karnovsky’s液
AEC显色系统的鄙端是易溶于有机溶剂，封片 以水性封片剂为主，染色切片不能久存。
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神经组织标记物
• 胶质纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein GFAP)
• S-lOO蛋白(S—100 Protein)
• 神经元特异性烯醇酶 (Neuron Specific Enolase， NSE)
• 髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)
免疫组织化学（实用篇）
(immunohistochemistry)
临床病理诊断中常用的抗体简介
人体组织细胞分类
• 上皮细胞：包括鳞状上皮，腺上皮，尿路上皮。
• 间叶组织：包括脂肪，肌肉，血管，纤维结缔组织，骨 和软骨组织，间皮。
• 神经组织：神经元，胶质细胞，神经纤维。 • 淋巴造血：淋巴细胞，粒细胞，浆细胞，单核细胞。 • 内分泌和神经内分泌组织：甲状腺，肾上腺，垂体，胰 腺的内分泌腺，各器官的神经内分泌细胞等 • 其他：黑色素细胞，性腺
儿童小圆细胞肿瘤的性质
• • • • • 淋巴瘤/白血病: LCA+, CD99+/– 横纹肌肉瘤: Desmin+, MyoD1+, myogenin+ Ewing’肉瘤/PNET: CD99+, Syn –/+ 神经母细胞瘤: CD99–, Syn+, NB84a+ 促结缔组织生成性小细胞肿瘤: CK +, Desmin+, WT1+
常用上皮性标记物
细胞角蛋白（cytokeratin,CK）
上皮膜抗原（epithelial membrane antigen, EMA） 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA） 其他：villin，Moc-31，MUC（粘蛋白）系列等
Cபைடு நூலகம்tokeratin（keratin或CK）
-- 胃肠腺癌
CK7 – CK20 –
-- 前列腺癌 -- 肾细胞癌 -- 肝细胞癌
• 举例：CK7和CK20联合应用： 35岁女性，左颈淋巴结肿大，活检提示为转移性腺癌 ，CT扫描未发现原发灶，免疫组化标记显示肿瘤细胞 表达CK7（-），CK20(+)，CDX2（+），提示结直肠 来源，肠镜检查在横结肠发现12mm的病灶，活检证 实为腺癌。
• 上皮细胞的骨架形成蛋白（中间丝）， 维持上皮细胞的结构和功能 • 分为I型和II型(酸性和碱性或中性）， 编码基因分别位于17q21.2和 12q13.13，共54个基因 • 表达方式与组织类型和细胞分化程度有 关，具有高度的特异性
• 蛋白具有不同的分子量和等电点
• 细胞中keratin常成对出现（酸性和碱 性配对出现）
nm23：胞浆阳性，抗转移基因，其表达降低与肿瘤的高
转移能力，复发相关。
与肿瘤多药耐药相关的标记物
Her-2 作用机制 ERCC1 PRM1 BRCA1 抗凋亡，参与调 过表达使停滞在 DNA修复的限速 高表达使细胞修 节P13K/AK途径和 G2/M期的损伤 酶，吉西他滨的 复能力增强 MAPK激活途径 DNA迅速恢复 结合位点 胞膜 胞核 胞浆 胞浆/核
阳性部位
判断标准
≥ ++
≥++
≥++
≥++
耐药药物
环磷酰胺 三苯氧胺 氨甲喋呤
顺氯氨铂
吉西他滨/顺铂
顺铂
与肿瘤多药耐药相关的标记物
MDR1 作用机制 药泵作用 GSTπ 解毒作用 TS 解毒作用 MDM2 转化作用
阳性部位
胞膜和浆
胞浆
胞浆
胞浆
判断标准
≥ ++
≥++
≥++
≥10%
耐药药物
恩环类 顺铂 紫衫类 恩环类 长春花碱（新碱） 氮芥 环磷酰胺
不明起源癌的免疫组织化学应用
器官特异性标记物 • 肺： –TTF-1（80% 腺癌阳性） • 乳腺：BRST-2/GCDFP-15（50% 病例阳性；但涎腺 和汗腺也会阳性） • 肝：HEP-1（~90%阳性） • 肠：CDX-2 （~100%一致性强阳性） • 膀胱：Uroplakin（~50%阳性）
肺腺癌：原发还是结直肠起源?
肺起源 CK7 CK20 + – 结直肠起源 – +
TTF-1
CDX-2
+
–
–
+
肿瘤良恶性鉴别
• 在以下一些情况形态学诊断困难： –在活检组织中挤压变形的细胞是癌细胞还是正常 的淋巴细胞? –黏膜活检中藏有癌细胞吗? –增殖的细胞是良性增生还是恶性肿瘤?
人为挤压的活检标本
常用的CK抗体
CK7和CK20：
分子量为54KD,正常乳腺，肺，尿路上皮阳性表达，胃
肠道，肝细胞，前列腺阴性表达
主要用于乳腺癌，肺腺癌与胃肠道癌的诊断与鉴别诊断 胰腺癌，胆管癌，卵巢和子宫内膜腺癌，尿路上皮癌阳
性表达。卵巢粘液性癌，前列腺癌，肝癌阴性表达
与CK20和其他抗体合用对判断腺癌的来源具有重要价
神经内分泌系统标记物
NSE(Neuron Specific Enolase,神经元特异性烯醇酶) CgA(chromogranin A 嗜铬颗粒蛋白A) Syn(synaptophysin 突触囊泡蛋白) CD56
器官或组织特异性抗原标记物
前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s
不明起源的鳞癌或鳞样癌中的 免疫组织化学应用 • 因为不同部位的鳞状细胞或鳞状细胞癌并不显示其独特 的免疫表型，鉴别较困难 • CD5：阳性支持胸腺起源 • CK20：阳性提示为膀胱的移行细胞癌
不明起源的小细胞癌中 免疫组织化学的应用
• CK20：Merkel’s 细胞癌阳性表达 • TTF-1：~90% 肺小细胞癌阳性表达，但在肺外的小 细胞癌也会阳性（~40%）
5-FU
多药耐药
与肿瘤靶向药物有关的免疫标记物
作用靶点 肿瘤类型
Tratugumab(赫赛汀）
Cetuximab（艾比妥）
HER2
EGFR
乳腺癌和胃癌
结肠癌，非腺癌 转移性大肠癌，肾癌
Bevacizumab（阿瓦斯汀） VEGF
Lmatinib（格列卫）
Rituximab（美罗华）
C-Kit
CD20
值。
常用的CK抗体
CK7和CK20：
分子量46KD，正常胃肠道，尿路上皮，Merkel细胞阳性表
达，肝细胞，乳腺，肺阴性表达
主要用于胃肠道腺癌，卵巢粘液性癌，Merkel细胞癌的诊断 鳞癌，甲状腺肿瘤，胸腺瘤阴性表达 胆道和胰管的腺癌，小肠类癌，前列腺和间皮阳性表达
与CK7和其他抗体合用对判断腺癌的来源具有重要价值。
CK19: 40KD的角蛋白，在单层上皮和间皮中表达，在
肝细胞不表达，用于鉴别肝细胞癌和胆管细胞癌；甲 状腺肿瘤中，甲状腺乳头状癌常阳性表达，良性和其 他癌很少表达。
CK14：50KD的角蛋白，在复层上皮表达，是鳞状上皮
的主要标记物。
间叶组织的标记物
– 波形蛋白（vimentin， VIM） – 肌组织标记物：Desmin（结蛋白）, actin（肌动蛋 白）, myogenin（肌浆蛋白），MyoD1（肌调节蛋白 ）等 – 脉管标记：血管内内皮细胞的标记物：CD34,CD31, 淋巴管D2-40 – 组织细胞的标记物：CD68, CD163,等 – 间皮细胞的标记物：calretinin，mesothelial等 – 用于鉴别软组织肿瘤的来源
–CK-pan（如MNF-116），或鸡尾酒调制的CK 抗体
（上皮性肿瘤） –LCA（淋巴瘤） –S100蛋白（恶性黑色素瘤，虽然一些癌会阳性 表达）
恶性肿瘤的性质
LCA 淋巴瘤 癌 恶性黑色素瘤 +* Cytokeratin + S100 -/+ +
肉瘤
-
-（有时 +）
-/+
一些淋巴瘤 LCA 阴性表达, 尤其是间变性大细胞性淋巴瘤 和淋巴母细胞性淋巴瘤
胃肠道间质瘤，慢粒
淋巴瘤
免疫组织化学在外科病理诊断中的应用
免疫组织化学在外科病理诊断中的应用
• • • • • • • • 恶性肿瘤性质? 癌组织的起源? 良性还是恶性? 肿瘤是原位还是侵袭性? 肿瘤分类? 癌的预后（包括分期） 决定治疗的靶向 其它方面 ……..
未分化恶性肿瘤的性质?
• 最佳首选的抗体组合方案：
淋巴造血系统的标记
淋巴造血组织，尤其淋巴细胞在其发育和分化过
程中能形成许多分化性抗原，应用这些分化性抗原的 特异性单克隆抗体能区分出免疫表型不同的细胞系， 而且还能区分出同一细胞系的不同亚型和不同分化阶 段的细胞群，因此可以利用此特性来诊断和分类恶性
淋巴瘤和白血病。
淋巴造血系统的标记
• 白细胞共同抗原（leucocyte common antigen,LCA,CD45） • 免疫球蛋白(immunoglobulin Ig) • 全B细胞标记物:CD20, CD79a, PAX5, Bob1等 • 全T细胞标记物：CD3, CD43, CD5, CD7,CD2等 • T淋巴细胞亚群标记物：CD4,CD8 • 粒细胞和单核—巨噬细胞相关标记物:MPO, CD34,CD68 等 • 浆细胞标记：CD38，CD138 • 其他：CD30,TDT,CD15，CD56，ALK，MUM1
应用特殊的CK抗体： 不明起源的腺癌
CK 7
CK20
CK7 和 CK20 都是非器官特异性标记物， 但对腺癌的起源判断十分有用
CK7+ CK20+
- 女性生殖道黏液腺癌 -- 一些胃癌 --胰腺癌 --胆管癌