免疫组化技术
免疫组化技术
免疫组化技术免疫组化技术是现代生物学研究领域中一项重要的实验技术，它通过利用抗体与特定抗原的高亲和力结合特异性标记，可以准确地检测和定位分子在细胞和组织中的分布，并在这一基础上进行生物学功能的研究。
本文将对免疫组化技术的原理、应用以及发展趋势进行详细介绍。
一、免疫组化技术的原理免疫组化技术基于生物体对抗原与抗体的免疫反应，利用抗体与抗原的特异性结合来标记和检测感兴趣的分子。
免疫组化技术的关键步骤包括：抗原的固定、抗原的暴露、与抗原的特异性结合和信号检测等。
在免疫组化技术中，抗原通常需要进行固定，以保持其在组织中的形态和位置不变。
一般来说，抗原可通过形成固定化复合物或被共价结合到载玻片或膜上。
随后，我们需要将抗原从组织中溶出，以使其暴露于抗体。
这一步骤通常涉及脱水、脱脂和脱钙等处理。
暴露后的抗原可以与特异抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
为了标记抗原-抗体复合物，我们需要选择适当的检测系统。
目前常用的检测方法包括荧光染色、酶学染色和放射性标记等。
其中，荧光染色技术具有高灵敏度和分辨率，能够利用荧光显微镜直接观察标记物的分布。
二、免疫组化技术的应用免疫组化技术在许多研究领域中广泛应用。
在医学领域，它常用于研究肿瘤形成机制、诊断和预后判断。
通过免疫组化技术，我们可以检测和定位许多肿瘤标志物，如癌胚抗原（CEA）和肿瘤相关抗原（CA）等，从而帮助医生进行早期诊断和治疗。
在神经科学领域，免疫组化技术被广泛用于研究神经元发育、突触形成和神经退行性疾病。
通过标记神经元特异性蛋白质，如神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经纤维酸性蛋白（NF）等，可以清晰地观察和研究神经元的结构和功能。
此外，免疫组化技术在细胞和分子生物学研究中也具有广泛的应用。
通过对细胞内蛋白质、DNA和RNA等分子的定位和检测，我们可以研究细胞的生物学功能和基因调控机制。
例如，通过检测特定蛋白质的表达和定位，可以研究调节细胞周期和细胞分化的信号通路。
免疫组化
什么是免疫组化免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
（一）免疫组织化学技术的基本原理免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。
即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。
只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。
2023年免疫组化行业市场发展现状
2023年免疫组化行业市场发展现状免疫组化技术是一种现代化的生物技术，是细胞和分子生物学研究中的重要工具和技术之一，在生命科学领域中发挥着重要作用。
随着科技不断进步和人们对生命科学领域的不断深入研究，免疫组化技术的应用越来越广泛。
本文将对免疫组化行业市场发展现状进行分析。
一、免疫组化技术的概念免疫组化技术（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用特异性抗体识别物质的生物化学方法，它是一种分析组织中蛋白质或其他分子的表达水平、细胞定位和亚细胞组成的方法，广泛应用于疾病的诊断和治疗、药物研发、生物医学研究等多个领域。
二、免疫组化技术的发展历程免疫组化技术是由G. Kohler和C. Milstein等科学家在1975年发明的。
但是，免疫组化技术的发展远不止于此。
随着技术和设备的不断更新，免疫组化技术不断得到改进和完善，如荧光免疫组化技术、多重荧光免疫组化技术和电子显微镜免疫组化技术等。
三、免疫组化技术在医学领域的应用免疫组化技术在医学领域的应用非常广泛。
它可以用于疾病的诊断和治疗、癌症的早期诊断、抗体药物研发、药物筛选、药物代谢动力学研究、免疫原性研究、生物标志物筛选等多个方面。
四、免疫组化技术市场发展现状1、市场规模与增长趋势据市场研究公司Research and Markets的数据显示，2019年全球免疫组化市场规模为10.7亿美元，预计到2025年将达到18亿美元，年复合增长率为8.5%。
2、应用行业分析目前，免疫组化技术主要应用于生物医学、科学研究和生物制药等领域。
其中，生物医学领域是免疫组化技术应用最广泛的领域，包括癌症诊断、病毒感染、免疫学、细胞与分子生物学、神经学、血液学、病理学等多个方面。
3、地区分析目前，免疫组化技术市场主要由北美和欧洲两个地区主宰，其中北美市场占据了全球市场的40%，欧洲市场占据了全球市场的30%。
亚太地区市场增长最快，预计到2025年将有较大的市场份额。
免疫组化技术
免疫组化技术免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的重要技术手段。
它通过利用抗体与其特异性抗原相互作用的特性，实现对细胞、组织和分子的检测和定位。
本文将从免疫组化技术的原理、应用、优缺点等方面进行介绍。
首先，免疫组化技术的原理主要基于抗原与抗体的高度特异性反应。
抗原一般是指能够被免疫系统识别并引发抗体产生的物质，它可以是细胞膜上的蛋白质、细胞核中的核酸、胞浆中的酶等。
而抗体是机体免疫系统产生的一类蛋白质，具有高度特异性与抗原结合。
在免疫组化技术中，通常选择一种与目标物高度特异性结合的抗体，通过与目标物反应形成抗原-抗体复合物，再利用染色、荧光等方法对其进行检测和定位。
免疫组化技术广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
首先，在生物医学研究领域，免疫组化技术可以用于检测和定位特定蛋白质或细胞标志物。
例如，科研人员可以利用特异性抗体对肿瘤标志物进行检测，从而实现早期肿瘤的筛查和诊断。
此外，免疫组化技术还可以用于研究免疫反应、细胞分化和分子信号传递等生物学过程。
其次，在临床诊断中，免疫组化技术可用于肿瘤诊断、感染病的检测和诊断，以及免疫性疾病的诊断等。
临床医生可以利用免疫组化技术对病理切片进行染色，帮助判断疾病类型和严重程度。
免疫组化技术具有多种优点。
首先，它具有高度特异性和敏感性。
由于抗体与特定抗原的结合是高度特异性的，因此免疫组化技术可以实现对目标物的准确检测和定位。
其次，它可以同时对多个目标进行检测。
通过同时使用多个不同特异性的抗体，可以对多个目标分子进行检测，从而提高检测效率。
此外，免疫组化技术还可以实现对细胞或组织的形态学和功能的研究，有助于揭示生物学过程的机制。
然而，免疫组化技术也存在一些限制和不足之处。
首先，技术操作复杂。
免疫组化技术需要对抗体的选择、染色剂的选择和实验条件等进行严格控制，技术操作要求较高。
其次，需要合适的阳性和阴性对照。
在使用免疫组化技术时，需要合适的阳性和阴性对照样品，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化技术名词解释
免疫组化技术名词解释
免疫组化技术是一种通过标记分析人体或生物组织中的特定免疫细胞或分子,来诊断、监测和分析疾病的生物标记技术。
免疫组化技术可以分为几种类型,包括:
1. 单克隆抗体技术:这是一种利用人工合成的抗体,将其与目标分子(通常是细胞表面分子)结合,通过检测抗体与目标分子的结合情况来诊断疾病的方法。
2. 抗原检测技术:这是一种利用细胞表面抗原来检测疾病的方法。
通过标记抗原,可以特异性地识别和检测出特定类型的细胞或组织。
3. 细胞因子检测技术:这是一种利用细胞因子来检测和分析细胞因子与其他分子的相互作用,以诊断和监测疾病的方法。
4. 基因组学技术:这是一种利用基因组序列来检测和诊断疾病的方法。
通过分析人类基因组的序列信息,可以预测和判断疾病的风险。
免疫组化技术在医学研究中具有广泛的应用,可以帮助医生诊断疾病、监测疾病的进展、预测疾病的预后,并为治疗提供重要的依据。
病理学中的免疫组化技术
病理学中的免疫组化技术病理学是临床医学的重要分支之一，其主要研究疾病的发生、发展和变化规律，以及疾病对人体的影响和治疗方法等。
在病理学研究中，免疫组化技术被广泛应用于疾病诊断、治疗和预防。
本文将详细介绍病理学中的免疫组化技术，包括其原理、应用范围、标记物及其特点、实验步骤、优点和局限性等方面。
一、原理免疫组化技术是利用免疫学原理和化学标记方法，将抗原与抗体相互作用标记，通过显微镜观察细胞或组织内部的形态、结构、组织类型等信息。
具体来说，免疫组化技术的过程包括以下几个步骤：制备标本，抗原提取、分离和纯化，制备特异性抗体，选择合适的标记物，进行免疫反应，显色和观察等。
二、应用范围免疫组化技术在病理学研究中应用广泛，包括疾病的诊断、治疗和预防方面。
例如，免疫组化技术可用于诊断肿瘤、感染性疾病、免疫系统疾病、神经系统疾病、心血管疾病等。
此外，免疫组化技术也可用于药物研发、新药筛选和药物治疗监测。
三、标记物及其特点在免疫组化技术中常用的标记物包括荧光标记、辣根过氧化物酶标记、碱性磷酸酶标记、生物素标记等。
不同的标记物具有不同的特点。
荧光标记具有较好的定量性、灵敏度和多标记能力；辣根过氧化物酶标记具有高灵敏度和尺寸较小的优点；碱性磷酸酶标记具有高灵敏度和较小的背景信号；生物素标记具有灵敏度和多标记能力等。
四、实验步骤免疫组化技术的实验步骤包括标本制备、抗原提取、制备抗体、标记试剂制备、免疫反应、显色和观察等。
其中，标本制备是一个非常重要的步骤，直接影响实验结果。
通常标本制备需根据不同的组织类型进行不同的处理，如切片、染色、脱水、透明、封片等。
五、优点与局限性免疫组化技术具有以下优点：（1）高灵敏度和特异性，可用于检测极微量的抗原。
（2）定量性好，可用于确定抗原的浓度和分布情况。
（3）成本较低，设备简单，易于掌握。
（4）样品来源广泛，不受细胞和组织来源限制。
然而，免疫组化技术也存在着一些局限性。
如抗原存在交叉反应，标本制备不当会造成影响实验结果的问题，而且实验过程需要操作技能较高的人员。
免疫组化技术
Mart-1 抗原修复前
抗原修复后
抗原修复
加热法的注意事项 ：
✓达到规定的温度(92～95 C以上) ✓维持一定的时间； ✓避免切片干涸 (抗原可能完全丢失)； ✓加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使 未折叠的蛋白分子链恢复天然构型； ✓修复液：最常用的是pH6.0的0.01mol抗原修复液的容器 中，加热至沸腾，持续10～15分钟。
优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室， 缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。
抗原修复
微波照射法 ：将玻片放入装有抗原修复液的容器 中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟， 冷却后，按免疫组化染色步骤进行。
量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中
生物素——抗生物素染色法最常用（ABC法）。
常用的染色方法
➢ 免疫荧光法:最早建立的免疫组织化学技术。
• 基本原理：它利用抗原抗体特异性结合的原理， 先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞 或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗 原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发 出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的 定位，进而还可进行定量分析。
抗体
✓ 抗体的结构：
每个抗体都含有两个较小的 蛋白质 （轻链）和两个较大的 蛋白质（重链）。组成 抗体 的这四个蛋白质通过二硫键 （ S-S ）结合在一起。
➢ Fab（fragment antigen binding）： 该端是抗体与抗原特异性结合的部位
➢ Fc（fragment crystalline）：
常用固定剂
丙酮： 对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组 织标本。
组织学切片制作
冰冻切片和石蜡切片是免疫组化中最常用的制片 方法。
免疫组化技术
组织石蜡切片制作 组织冰冻切片制作 细胞爬片制作 细胞涂片制作
免疫组化技术
切片的制作
组织的固定 组织石蜡包埋 切片
免疫组化技术
组织材料的固定
目的:
使细胞内蛋白质凝固，终止胞内酶活 化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形 态与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原 抗体反应的类脂，最主要的是保存组织细 胞的抗原性，在染色和反复清洗的过程中 使抗原不致释放。
切片粘合剂的使用：
多聚赖氨酸（分子量200KD）：0.05%浓度， 浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜 干燥备用。
免疫组化技术
切片：
石蜡切片：
(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)60℃烤片3-8h。 (3)切片厚2～4μm。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4℃保存数年
免疫组化技术
影响固定的因素
1. 温度 一般固定液固定效果随温度升高而 加强，以室温22 ℃ 为常用。
2．浓度 10％中性甲醛，4％多聚甲醛固定液 3. 固定时间 要视组织块的厚薄，固定液的
种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大 小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓 度与固定时间成反比。 组织固定后，必须彻底冲洗以去除固定液
免疫组化技术
组织的脱水
脱水就是用某些溶剂将组织中的水分置换 出来的过程。
免疫组化技术简介及相关临床应用
＋－－ ＋
淋巴结边缘区Ｂ细胞淋巴瘤 － － － －
结外边缘区Ｂ细胞淋巴瘤
－－－
－
（黏膜相关淋巴组织淋巴瘤）
垂体腺瘤的免疫组化鉴别诊断
泌乳素细胞腺瘤
LTH GH ACTH PSH/LH FSH CgA
＋－ －
－
－－
NSE KER
＋
＋
生长激素细胞腺瘤
－＋ －
－
促皮质激素细胞腺瘤 － － ＋
－
－－
－
＋
－－
20世纪80年代该项技术在国外开始应用 于诊断疾病，国内比国外约晚10年，即90 年代开始运用于疾病的病理诊断。
最近20多年来，该项技术得到飞速发展，特别 是绝大多数抗体能够应用在福尔马林固定的石蜡 切片上，因而大大促进了它在临床病理学上的应 用。
从开始发展至今，该项技术一直在基础医学和 临床研究中发挥重要作用,为疾病尤其是肿瘤性疾 病的诊断、鉴别诊断及发病机制的研究提供了强 有力的手段。
原暴露有一定的影响，但可进行抗原修 复，是免疫组化中首选的组织标本制作 方法。
常用染色方法
免疫组织化学技术按照标记物的种类不 同可分为： 1，免疫荧光法，标记物为荧光素，通 过荧光显微镜观察； 2，免疫酶法，以酶标记抗体，抗原抗 体反应后显色，通过光镜或电镜观察，目前 最常用； 3，其它如亲和组织化学法、免疫铁蛋 白法、免疫胶体金法及放射免疫自显影法等。
有如下基本特点：
1、特异性强 2、敏感性高 3、定位准确 4、形态与功能相结合
所用抗体及标本类型
所用抗体类型
常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗 体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分 泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免 疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的 抗原直接免疫动物后，从动物血中所获 得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所 产生的抗体混合物。
免疫组化技术简介
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失 败
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技 术
03
基 本
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原
要
原
质
因
结
点
操
理
基
量
果
作
本
控
判
流
概
制
读
程
念
CONTENTS
目 录
质量控制
试剂的质量控制
➢ 抗体特异性、敏感性测试 ，抗体最佳稀释度的选择 ，稀释剂 ，抗体孵育温度、
时间。
仪器的质量控制
➢ 相关技术设备、仪器和器具定期校对、消毒。
操作过程质量控制
形态和结构；②保持组织细胞的抗原性；③防止细胞层脱落；④去除 细胞内的脂类（妨碍抗体结合）；⑤防腐。
➢ 注意事项：①组织块不宜过大；②固定液的量一般以组织块大小的30
倍为宜；③必须选择对组织渗透力强，同时又不致使组织过度收缩或 膨胀的试剂；④固定时间一般以24小时为宜。
➢ 固定液的选择：所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学
基本概念
抗原（Antigen, Ag）
➢ 一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细
胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物 质。
抗体（Antibody, Ab）
➢ 机体受抗原刺激后由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与
相应抗原发生反应的球蛋白，称为免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。
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免疫组化方法和步骤
免疫组化方法和步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测细胞或组织中特定蛋白质的表达水平，以及研究细胞或组织中的蛋白质定位和相互作用。
免疫组化方法涉及一系列步骤，包括样本固定、抗原检测与标记、抗体与抗原结合、可视化和结果分析。
以下是免疫组化方法及步骤的详细介绍。
一、样本固定免疫组化实验的第一步是固定样本，通常使用福尔马林或乙醛等化学物质进行固定。
固定的目的是保持细胞和组织的形态结构，并防止蛋白质的降解。
固定过程中，需要将样本固定在载玻片或膜上，以便之后的实验操作。
可使用刷子或杆状工具将样本涂布在载玻片上，或者使用离心管和离心机将细胞沉淀在载膜上。
二、抗原检测与标记样本固定后，下一步是检测和标记目标抗原。
有两种常用的方法供选择：直接法和间接法。
1.直接法：直接法在一个步骤中同时检测和标记抗原。
直接法可以快速获得结果，但受到抗体的特异性和标记物的可用性的限制。
2.间接法：间接法需要两个步骤，先使用特异性初级抗体与抗原结合，再使用标记有染料或标记物的二级抗体与初级抗体结合。
间接法具有较高的灵敏度和特异性，可以用于多重标记和检测多个蛋白质。
三、抗体与抗原结合蛋白质和抗体结合是免疫组化的关键步骤。
待检样本上固定的抗原与抗体结合可以直接检测或通过信号增强来检测。
抗体与抗原结合的时间和温度取决于抗体的亲和力和特异性，通常需要在较低的温度下进行孵育，并在孵育过程中提供充分的抗体与抗原接触时间。
四、可视化可视化是将抗原抗体结合信号转化为可见光信号的过程。
最常见的可视化方法之一是使用酶标测定法。
酶标测定法将酶（如辣根过氧化物酶）结合到标记物（如荧光素黄标记的二级抗体）上，然后通过加入底物（如DAB）产生可见的色素反应。
除了酶标测定法外，还有其他可视化方法，如免疫荧光技术和原位杂交。
免疫荧光技术使用标记的荧光染料标记一级或二级抗体，然后通过荧光显微镜观察样本。
原位杂交使用与DNA序列互补的标记探针识别特定的DNA序列，并通过可视化标记（如荧光）来检测靶标。
免疫组化是什么意思
免疫组化是什么意思免疫组化是一种常用于分析生物组织或细胞的实验技术，通过使用特定的抗体和染色试剂，可以检测和定位特定的蛋白质或分子在组织或细胞中的表达情况。
在医学、生物学和生物医学研究领域，免疫组化技术被广泛应用于诊断疾病、研究细胞生物学过程以及评估药物的疗效。
免疫组化的原理基于免疫学的核心概念，即抗原与抗体的特异性互相结合。
抗原是指能够诱导免疫系统产生抗体的分子，而抗体则是由免疫系统产生的特异性蛋白质，可以与抗原结合形成稳定的复合物。
免疫组化利用这一原理，使用特异性抗体与待检测的蛋白质结合，然后通过染色试剂的辅助作用，使该蛋白质在组织或细胞中形成可见的沉积物。
在实际操作中，免疫组化通常需要以下步骤：取得待检测的生物组织或细胞样品，首先进行固定和切片处理，以保持样品的形态结构。
然后将切片进行抗原修复处理，以恢复组织中蛋白质的三维结构，增强抗体与抗原的结合效果。
接下来，样品与特定的抗体进行孵育，抗体与待检测的蛋白质结合。
为了可视化抗原抗体复合物，通过染色试剂的作用，使抗原抗体复合物形成可见的染色沉积物。
染色沉积物的颜色和位置可以反映出目标蛋白质在组织或细胞中的表达情况。
通过免疫组化技术，研究人员可以获得目标蛋白质在组织或细胞中的空间分布信息。
例如，在肿瘤研究中，免疫组化技术可以检测癌细胞中增殖标记物的表达情况，帮助判断肿瘤的恶性程度以及预测患者的预后。
此外，免疫组化还可以用于研究细胞信号传导通路、免疫反应以及发育过程中关键分子的定位和表达。
然而，免疫组化技术也存在一些限制和挑战。
首先，由于不同抗体的特异性和亲和力可能存在差异，需要进行严格的抗体验证，确保其特异性和可靠性。
其次，免疫组化的结果通常是主观的，需要经验丰富的操作人员进行解读和分析。
此外，由于样品处理和染色过程中多个步骤的影响，免疫组化结果的重现性可能受到影响。
随着技术的发展和进步，免疫组化技术也不断更新和改进。
例如，引入了自动化设备和图像分析软件，可以提高实验的效率和结果的准确性。
《免疫组化技术》课件
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末
免疫组化技术
7、SP反应 SP反应 • 加入SP后放入37度烤箱中30 min。 • 用PBS洗5次×5 min； 8、显色 • 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染 液），显色时间控制在约5 min（3～10 min） ，由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避 光）（1:20储备液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制 。 :50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，20 ℃保存。
免疫组化的作用
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原 如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、 ，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷 受体、 激素、 脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等 都可用相应的特异性抗体进行检测。 都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组化的特点
特异性强 敏感性高 定位准确、 定位准确、形态与功能相结合
结果分析： 结果分析：每张切片选择5个高倍镜视野 （400X），应用图像分析系统进行定量 灰度扫描后进行分析
设备
恒温箱（水浴锅）、冰箱、切片 机、载玻片和盖玻片、高压锅或 微波炉、染色缸、显微镜、计算 机图像分析系统
所用试剂
· 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加双蒸水至1000 ml；1000 ml 0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH2PO4·2H2O＋58.02 g Na2HPO4·12H2O in 1000 ml双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH2PO4·2H2O：15.6 g in 500 ml ddH2O（重蒸水 ）；B. 0.2 M Na2HPO4·12H2O：71.632 g in 1000 ml dH2O（蒸 馏水 ））。 • Citrate Buffered Saline（0.01 M柠檬酸缓冲液， PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH2O（ A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至 1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g加双蒸水至1000 ml）。
免疫组化及特殊染色
根据组织中蛋白质的降解程度 ，通过免疫组化染色可以推断 死亡时间，有助于法医学中的 死亡时间推断。
05
技术发展与展望
免疫组化技术的发展趋势
自动化与智能化
01
随着科技的进步，免疫组化技术正朝着自动化和智能化的方向
发展，以提高检测的准确性和效率。
多指标并行检测
02
通过多指标并行检测，能够更全面地揭示疾病的发生、发展机
80%
疾病预测
对特定蛋白的免疫组化染色可以 预测疾病的发病风险和进展趋势 ，有助于疾病的早期预防和治疗 。
法医学鉴定中的应用
死亡原因鉴定
通过免疫组化染色，可以检测 死者体内相关蛋白的表达水平 ，有助于推断死亡原因和死因 调查。
致伤工具推断
通过检测创口组织中特定蛋白 的表达，可以推断致伤工具的 类型和作用方式，为法医学鉴 定提供依据。
03
免疫组化与特殊染色的比较
技术特点比较
免疫组化
利用抗原-抗体反应原理，通过标记抗 体对组织或细胞内的抗原进行定位和 定性分析。具有高特异性和高敏感性。
特殊染色
利用不同化学染料对组织或细胞的不 同成分进行染色，以便观察组织或细 胞的形态和结构。具有简单易行、成 本低廉等优点。
应用范围比较
免疫组化
主要用于肿瘤诊断、鉴别诊断、预后评估等方面，也可用于某些感染性疾病、自身免疫性疾病等的诊 断。
特殊染色
广泛应用于病理学、组织学等领域，如观察细胞形态、鉴别细胞类型、检测组织内化学成分等。
优缺点比较
免疫组化
优点在于高特异性和敏感性，能够准确定位和定性分析组织或细胞内的抗原。缺点是操作复杂、成本较高，需要 专业技术人员操作。
药物研发与疗效评估
免疫组化技术的原理及方法
免疫组化技术的原理及方法免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的高灵敏度和高特异性的实验技术。
它通过特异性抗体与目标分子间的特异性结合来检测目标分子的存在和表达水平。
在该技术中，抗体作为探针，能够识别和结合目标分子的特定表位，从而可定量或定性地检测分子的存在或表达水平。
免疫组化技术的原理基于生物体自然产生的免疫应答机制。
当有外来物质（抗原）进入机体时，机体的免疫系统会产生抗体来与其特异性结合。
抗体与抗原结合后会激活一系列免疫反应，包括免疫效应细胞的激活和分泌抗体的B细胞的增殖和分化。
在免疫组化技术中，我们可以利用这一特性，使用高亲和力的特异性抗体来实现对目标分子的检测。
直接法是利用已标记的特异性抗体直接与目标分子结合。
这种方法在实验操作上比较简单，但需要对每种目标分子都有特异性标记的抗体。
直接法适用于目标分子丰度较高（>100 ng/mL）的情况。
间接法是通过两步反应实现对目标分子的检测。
第一步，使用未标记的特异性抗体与目标分子结合；第二步，使用标记抗体与先前结合的抗体结合。
标记抗体可以是酶、荧光染料、放射性同位素等。
这种方法的优势是只需要使用少量的少数几个标记抗体即可覆盖多种目标分子的检测，同时具有更高的灵敏度。
免疫组化技术的方法还包括免疫组化染色、免疫印迹和流式细胞术等。
其中，免疫组化染色是一种常见的方法，它通过对标本中特定目标分子的特异性染色来实现对其定位和定量的研究。
该方法适用于形态学研究和病理诊断。
免疫印迹是一种能够定性和定量地检测蛋白质表达的方法，通过将不同大小的蛋白质分子分离，并使用特异性抗体来检测目标蛋白质。
流式细胞术则是一种通过细胞表面的特异性抗体标记来分析和分离细胞的技术，它可以实现对细胞表型、蛋白质表达水平和细胞数量的检测。
总之，免疫组化技术是一种依赖于特异性抗体与目标分子结合的实验技术。
通过选择合适的检测方法和抗体，免疫组化技术可以应用于各种生物医学领域，如基础研究、临床诊断和药物研发。
免疫组化技术
特异性染色
非特异性染色
显色部位
特定细胞或间质
细胞和间质均匀染色或更强
显色定位 显色程度
特定，具有结构性
同一部位呈不同程度显 色
无特定部位，无结构性
无分布规律，某一片均匀着 色
阳性细胞的染色特征： ①阳性细胞的染色分布有三种：
胞浆；细胞核；细胞膜表面 ②阳性细胞分布：灶性；弥漫性 ③染色强度不一 ④切片边缘，刀痕or组织折叠，坏死，挤压区， 胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。
➢胶体金： •指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中， •免疫电镜观察
主要方法： •直接法： •间接法：经过了第二抗体放大效应
PAP法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合
物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以 酶底物反应检出。
•ABC法：
生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）为具有高 度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4个生 物素。当生物素标上特定的标记物质后or与抗体 结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上 生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物 素的结合反应，而以适当方式显示。
子的能力高，因此可被用来提高对比度。
名词解释：分辨率 免疫组织化学技术 HE染色 问织器官细微结构的染色方法，并
说明其优缺点
滑膜肿瘤 间皮肿瘤 上皮样肉瘤
癌肉瘤
Keratin－ Vimentin＋
Keratin－ Vimentin－
Des＋or Actin＋ 肌源性肿瘤
CD34＋or FⅧ＋ 血管性肿瘤
S-100＋or MBP ＋ 神经鞘膜瘤
LCA＋
淋巴细胞
AACT＋ 骨肿瘤、纤维组织细胞肿瘤
GFAP＋
胶质细胞肿瘤
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六、荧光显微镜检查方法 1.荧光显微镜 荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具。它是由超高压光源，滤
片系统(包括激发和压制滤板)，光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的 光激发标本发射荧光。
(1)光源 光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染料的要求。 对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，引起球内水银蒸发， 经过5～15min，球内气压升至50～70标准大气压，此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。
罗丹明 四甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察 碘化丙啶：DNA
德克萨斯红：荧光抗体观察
Hale Waihona Puke 2.标本制作要求 (1)载玻片厚度应在0.6～1.2mm之间 (2)盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右 (3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充 分激分。
(4)封片剂 常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮， 不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液等量混合作封片剂。
荧光信号增强封片剂
mowiol 40-88
4.8g
甘油
12ml
蒸馏水
12ml
0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml
上述混合（加热溶解），5000g离心，15min，最后加入1.4-diazobicydo-[2,2,2]octane(DABcos)，终浓度2.5%(约1.25g)，溶解后，分装存于-20℃中。 (5)镜油
操作流程 (1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS洗 3×3min。 (2)适当稀释特异性一抗，37℃孵育1h，或室温4h，或4℃过夜，PBS洗3×3min。
(3)荧光标记二抗适当稀释37℃ 30min，PBS洗3×3min。 (4)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗3×3min。 (5)封片，镜检。
一部分荧光经过物镜，长通分色反射镜，聚焦透镜，会聚在聚焦透镜的焦点外，经 过焦点处的针孔，由检测器接收并转变成电信号。
3.光信号接收和成像方式 (1)光信号接收 生物样品发出的荧光通常有二种接收方式：①由光电倍增管（PMT）把光信 号转变成电信号；②利用电荷耦合器（CCD）把光信号转变成电信号。
(3)四乙基罗达明(RB200) 呈褐红色粉末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保 存。最大吸收光谱570nm，最大发射光谱596～600nm，呈明亮橙红色荧光，分子量580， RB200不能直接和蛋白质结合，要先经五氯化磷反应，转化成硫酰氯，再与蛋白质的 氨基结合。
(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯 (5)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS） (6)得克萨斯红（Texas red） (7)藻红蛋白（PE） (8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）
3.使用荧光显微镜注意事项 (1)严格按说明书操作，不要随意改变程序。 (2)应在暗室中进行检查。 (3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。 (4)检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。
(5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。光源关闭后必 须在30min后才能再启动光源，一天中应避免数次点燃光源。
(2)滤片系统 是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像和发挥 显微镜最佳性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件。
滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其他一些中性滤片。
荧光显微镜的滤片系统
激励法 U V BV
B
IB G
IG
分光镜 DM400 DM455 DM455
(6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜 色对比鲜明，能清晰判断结果。
2.荧光素的种类 (1)异硫氰酸荧光黄（FITC）：分子量390D，最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光 谱为520～530nm。呈现明亮的黄绿色荧光，分子量389.4。
(2)四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）是罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收光谱 为550nm，最大发射光谱为620nm，呈橙红色荧光。
DM500
DM505 DM570
DM565 DM600
激发滤光片 BP330-385 BP360-370 BP400-410 BP400-440 BP420-440
BP450-480 BP470-490 BP420-480 PB460-490 BP470-490 BP510-550 BP530-550 BP480-550 BP520-550 BP545-580
三、荧光素标记抗体的方法 (一)FITC标记抗体的方法 1.Marsshall法 (1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸ε -氨基与FITC上 硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。
荧光素FITC-N＝C ＋ N-蛋白质→ ‖ S HH
(2)成像方式 ①载物台运动成像：以直径很小的激光束照射样品，照射点发出的荧光信号经 PMT变成电信号，然后载物台移动到下一点，记录该点的荧光强度。该方法无轴向像差，成 像时间长；
②反射扫描成像方式，通过转动反射镜使激光连续照射样品，由CCD摄像机记录下照射点 所发射的荧光，成像速度快。
4.参数的选择 基本参数：Confocal,pinhole,detector,
射荧光。
1、具备用于标记抗体的荧光素条件 (1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未结合的色素及其 降解产物易排除。
(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光 素质量下降不多。
(3)标记后对抗体的免疫学性质和生化 性质无影响。
(4)结合方法简便而快速，并且较稳定。
(5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其 他物质发生化学反应。
截止滤光片 BA420 BA455 BA475
BA515
BA515IF BA590
BA580IF BA610IF
用途 自动荧光观察法，DAPI(联脒基吲哚)：DNA Hoechest 33358,33342染色体 儿茶酚胺观察 芥子喹吖因；染色体 硫磺素S：淋巴细胞 吖淀黄素：核酸 异硫氰酸荧光素：荧光抗体观察 吖啶橙：DNA，RNA 金胺结核杆菌
(6)标本染色后应立即观察。 (7)荧光高度的判断标准，分四级“ －”为阴性，“ ＋”为仅能见明确可见的荧光； “ ＋＋”为可见有明亮的荧光；“ ＋＋＋”为可见耀眼的荧光。
七、非特异性染色的消除方法 根据产生的原因采取适当的方法，常用方法：
1.动物脏器粉末吸收法 2.透析法 3.Sephadex G-50柱层析法 4.DEAE纤维素柱层析法 5.荧光抗体稀释法 6.纯化抗原方法 7.纯化抗体方法 8.伊文氏蓝衬染方法：0.01%伊文氏蓝
发射 以辐身方式跃迁时，能量转化成相 应波长的光，这个过程叫发射。
荧光 跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐身方 式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发 射光，叫荧光。
二、荧光素 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的光能并发
1.仪器构成 (1)计算机系统：控制着机械，光学、声学系统及各种外围设备。 (2)激光照射系统：氩离子激光器和声光调节器。
(3)显微镜系统，它主要由倒置显微镜和共聚焦系统组成。 (4)检测系统，由检测器，检测放大器等元件组成。 (5)X－Y平台 (6)Z-轴步进马达
2.共聚焦成像原理
激光器发出的激光束经过光的扩束和整形，变成一束直径较大的平行光束，长 通分色光镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在 激光的激发下发出沿各个方向的荧光，
免疫组化技术
主要内容 一、荧光的特征 二、荧光素 三、荧光素标记抗体的方法 四、荧光抗体的质量鉴定 五、免疫荧光组化染色方法 六、荧光显微镜 七、非特异性荧光的消除方法
八、激光扫描共聚焦显微镜
思考题： 1.什么叫荧光？ 2.常用荧光素有哪些特征？ 3.标记荧光抗体有哪二种主要的制备方法？
4.免疫荧光组化直接法、间接法的 原理和主要操作流程？
5.观察荧光组化片时应注意哪些问题？ 6.非特异性荧光的消除方法有哪几种？
一、荧光的特征 分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一
系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则，要以从一个能级向另一能级跃迁，并 伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放。
激发 当电子吸收能量跃迁到较高能级， 这个过程叫激发。
FITC- N – C – N - 蛋白质 ‖
H SH
(2)操作流程 抗体与荧光素比例为50-100:1
抗体的准备：20mg/ml，碳酸盐缓冲液为总 量的1/10。
荧光素的准备：用分析天平准确称取 0.01mgFITC/1mg抗体。
结合：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体 溶液中。
透析 过柱 Sephade×G50或 G25 保存 4℃ -40℃等量甘油分装保存。 2.Chadwick法 3.改良法 4.透析标记法 （二）四乙基罗达明标记抗体方法 （三）藻红蛋白标记抗体方法
实习1 免疫荧光组化----间接法 1.4 µ m石蜡切，58℃烤，18h。 2.常规脱蜡至水（二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10min，无水乙醇，95％乙醇，85％乙醇，75％乙醇 各2min）。 3.PBS洗（磷酸盐缓冲液0.01mol/L pH7.4）3×3min。
4.0.1%胰蛋白酶（100ml蒸馏水中加入100mg胰蛋白酶，100mg氯化钙，用0.1N NaoH调pH至 7.6），37℃，消化30min。 5.0.01mol/L pH7.4 PBS洗3×3min。 6.兔抗人AFP1:50（用专用抗体稀释液稀释）37℃，1h或室温4h，或4℃过夜。