免疫组化常用方法
检验科免疫组化常见检测与分析方法
检验科免疫组化常见检测与分析方法免疫组化技术是一种利用免疫学原理，通过检测和定位特定蛋白质在组织或细胞中的表达水平和位置的方法。
在医学检验科中，免疫组化技术被广泛应用于疾病的诊断、治疗及预后评估。
本文将介绍一些常见的免疫组化检测与分析方法。
一、免疫组化染色法免疫组化染色法是免疫组化技术中最常用的方法之一。
它通过采用免疫荧光、酶标记、金标记或放射性标记等技术，将特定抗原与特异性抗体结合，并通过染色或荧光的方式来显示其位置和表达水平。
免疫组化染色法广泛应用于各种疾病的诊断，如肿瘤标记物的检测、感染性疾病的诊断等。
二、免疫组织化学法免疫组织化学法是一种在组织切片上进行免疫组化染色的方法。
它通过对切片进行蛋白质抗原的恢复处理和抗体的特异性结合，来检测和显示抗原在组织中的位置和表达水平。
免疫组织化学法主要应用于病理学领域，帮助医生确定疾病的类型和分级。
三、免疫荧光法免疫荧光法是利用特异性抗体与抗原结合后，在显微镜下观察抗原在组织或细胞中的分布情况和表达水平的技术。
免疫荧光法具有高灵敏度和高特异性的优点，被广泛应用于自身免疫性疾病、感染性疾病等的诊断。
四、免疫电镜法免疫电镜法是一种在电镜下观察和检测抗体与抗原结合的方法。
它通过在样品上标记抗体或抗原，然后利用电镜来观察并获得高分辨率的图像。
免疫电镜法主要用于对超微结构进行研究和观察，是研究细胞和组织的重要手段。
五、免疫组化信号放大技术免疫组化信号放大技术是一种能够放大免疫染色信号并提高染色效果的方法。
常见的免疫组化信号放大技术包括多聚酶法、银增强法、酶蛋白复合物法等。
这些技术在免疫组化检测中可以提高检测的灵敏度和准确性。
免疫组化技术因其高度敏感、高特异性和定量分析的优势，成为了疾病诊断与治疗中不可或缺的重要方法。
随着技术的发展和创新，免疫组化技术将在临床医学中发挥越来越重要的作用。
综上所述，本文介绍了免疫组化检测与分析的常见方法，包括免疫组化染色法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫电镜法以及免疫组化信号放大技术。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4 度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
免疫组化常用的对照方法
免疫组化常用的对照方法
免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白质表达的技术。
在进行免疫组化实验时，对照组是非常重要的，它可以帮助确定实验结果的准确性和可靠性。
以下是免疫组化常用的对照方法：
1. 阴性对照，阴性对照是使用不含目标蛋白的组织样本或细胞作为对照。
这可以帮助排除假阳性结果，即实验结果中出现的信号并非由于目标蛋白的存在所致。
2. 正性对照，正性对照是使用已知含有目标蛋白的组织样本或细胞作为对照。
这可以确保实验条件下目标蛋白的免疫反应性，并验证实验方法的可靠性。
3. 内部对照，内部对照是在同一组织样本或细胞中使用与目标蛋白不同但稳定表达的蛋白作为对照。
这有助于纠正实验中可能存在的变异性，如组织处理、染色效果等。
4. 同型对照，同型对照是使用与目标蛋白相同种属来源的免疫球蛋白（IgG）作为对照。
这可以帮助排除实验中可能存在的非特异
性结合或交叉反应。
以上是免疫组化常用的对照方法，正确选择和使用对照可以有效地确保免疫组化实验结果的准确性和可靠性，为科研工作提供有力的支持。
免疫组化操作方法
免疫组化操作方法免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测和定位细胞或组织中特定蛋白质的表达。
它结合了免疫学和生化学的原则和技术，可以提供对细胞或组织中不同蛋白质的分子特征、活动状态和相互作用的信息。
本文将详细介绍免疫组化的操作方法，包括材料和试剂的准备、标本的制备和固定、抗原检测和可视化等步骤。
材料和试剂的准备1.活体或固定的细胞或组织标本。
2.组织培养基和适当的培养器具。
3.PBS(磷酸缓冲盐溶液)或其他细胞/组织冲洗缓冲溶液。
4.组织切片刀、显微刀片、显微镊子、镊子等操作工具。
5.细胞/组织固定剂，如乙醛、甲醛、乙酸乙酯等。
6.可溶性和固相抗原检测试剂，如抗体、蛋白质等。
7.染色试剂，如荧光染料、酶底物等。
8.实验室耗材和设备。
标本的制备和固定1.如果使用活体标本，如细胞培养物，应先将其转移到无菌培养器皿中，并在适当的培养条件下培养至合适的生长期。
2.对于组织标本，可以通过切片或切块的方式进行制备。
切片时要求切片薄而均匀，一般为5-10μm。
切块时要求尽量保持组织完整性。
3.制备好的细胞或组织标本需要尽快进行固定，以保持其形态和蛋白质的天然状态。
常用的细胞/组织固定剂有乙醛、甲醛和乙酸乙酯。
不同的固定剂选用方法有一定差异，具体应根据实验要求和文献建议进行选择。
抗原检测和可视化1.固定后的标本需要进行脱水和透明化处理，以便于抗原检测的进行。
可以使用乙醇或队列进行脱水处理，然后用透明化溶剂进行透明化处理。
2.抗原检测需要使用抗体识别目标蛋白质。
对于免疫组织化学，常用的抗体类型包括一抗和二抗。
一抗为直接与目标抗原反应的抗体，二抗为与一抗结合并由可视化标记物进行信号产生的抗体。
一抗和二抗的选择应根据目标抗原和实验要求进行合理选择。
3.免疫染色前，可进行一些前处理步骤以增强染色效果，如抗体预处理、抗原修复、背景消除等。
4.免疫染色操作中，需要逐层进行抗体处理、洗涤和可视化标记物处理。
一般步骤包括：一抗与标本结合、一次洗涤、二抗与一抗结合、二次洗涤、可视化标记物与二抗结合、最终洗涤。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。
下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。
1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。
2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。
对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。
3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。
对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。
4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。
5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。
6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。
7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。
8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。
9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。
10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。
11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。
12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。
需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。
免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。
免疫组化方法
免疫组化方法
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测组织或细胞中特定蛋白质
的表达和定位。
其基本原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，再通过
染色或荧光标记等方法来检测抗体与蛋白质的结合情况。
免疫组化方法主
要包括以下几个步骤：1.样品制备：将组织或细胞样品固定、切片或涂片
等处理，以便于后续的抗体结合和检测。
2.抗原修复：对于某些抗原易于
失活或难以检测的样品，需要进行抗原修复处理，如加热、酶解等，以恢
复抗原的结构和活性。
3.抗体结合：将特异性抗体加入样品中，与目标蛋
白质结合形成免疫复合物。
抗体可以是单克隆或多克隆，也可以是直接标
记或间接标记的。
4.洗涤：用缓冲液洗涤样品，去除未结合的抗体和杂质，以减少假阳性的干扰。
5.检测标记：将荧光标记、酶标记或金标记等标记
物加入样品中，与免疫复合物结合，以便于检测和定位。
6.显色或荧光：
通过染色或荧光显微镜等设备，观察样品中的免疫复合物的分布和定位，
以确定目标蛋白质的表达和定位情况。
总之，免疫组化方法是一种高灵敏度、高特异性的实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开
发等领域。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的存在和定位。
其步骤包括样本制备、抗原去原、阻断试验、一次抗体处理、二次抗体处理、显色和镜检。
下面将详细介绍每个步骤：1.样本制备：收集需要检测的样本，可以是细胞、组织或体液。
样本收集后，需要进行固定和切片处理，以保持细胞和组织结构的完整性。
2.抗原去原：蛋白质在组织中可能会被结构和其他因素影响，使其在免疫组化实验中难以被检测到。
因此，需要进行抗原去原处理。
常用的方法有热处理、酸碱处理、酶解处理等。
3.阻断试验：细胞和组织常常会存在非特异性结合位点，会使得后续的免疫反应变得模糊不清。
为了减少这种非特异性结合，需要进行阻断试验。
常用的阻断试验方法有牛血清白蛋白（BSA）、动物血清等。
4.一次抗体处理：在一次抗体处理步骤中，需要准备与目标蛋白质特异性结合的一次抗体。
将制备好的一次抗体加入样本中，使其与目标蛋白质发生反应，并形成抗原抗体复合物。
5.二次抗体处理：一次抗体只能与抗原结合，无法提供光学信号。
因此需要加入与一次抗体结合的二次抗体，该二次抗体与荧光物质或酶偶联，可以提供可视化信号。
常见的二次抗体有HRP（辣根过氧化物酶）、荧光染料等。
6.显色：通过加入合适的显色底物，可以使得与二次抗体结合的酶产生可见的颜色反应。
常用的显色底物有DAB（3,3'-二氨基联苯），其在酶的作用下会产生棕色的显色产物。
7.镜检：最后一步是使用光学显微镜对样本进行观察和分析。
通过镜检可以确定抗原存在的位置和分布情况，并对结果进行定量分析。
总结：免疫组化是一种确定蛋白质存在和分布的重要实验技术。
通过以上步骤的顺序操作，可以获得可靠的结果。
实验人员需要熟悉每个步骤的操作方法，并根据实验样本的要求进行调整和优化，以获得准确和可重复的结果。
06 免疫组化常用方法
1
B. 1966年, Nakane和Pierce研发了用HRP作为标记物的酶 标抗体法. 该法结果可永久保存, 但因酶和抗体之间形成 化学键时可能影响双方活性, 造成敏感度降低. C. 1970年, Sternberger等研发了未标记抗体法大大提高了 敏感度, 并将酶和抗酶抗体制成复合物(PAP)以便储存, 使 用和商业化. D. 1971年, Faulk和Taylor研发了胶体金标记的抗体在EM下 检查表面抗原, 但检测内部抗原时因金颗粒穿透力差较 造成敏感度降低. E. 1981年, Hsu等研发了抗生物素蛋白-生物素(AvidinBiotin)系统, 形成比PAP法还要敏感的ABC法. 两者的有色 终产物可用普通LM观察或锇(Os)化后在EM下观察, 但锇 化常掩盖超微结构.
3
DAB-H. 1st anti-urokinase (尿激酶).Human mammary carcinoma tissue.
4
C. 未标记抗体酶法: 酶桥法. 一抗和二抗均未被酶标记. 通 常利用二抗作为桥, 将一抗和终抗体连接起来, 而终抗体 为抗酶抗体(即被酶标记), 产生于与一抗来源相同的动物 种属. 终抗等常被制成复合物形式, 如碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)-抗碱性磷酸酶(APAAP), 过氧化物酶 (Peroxidase)-抗过氧化物酶(PAP), 抗生物素蛋白(Avidin)-生 物素(Biotin)-过氧化物酶复合物(ABC)法, 以及蛋白A法等. 1. APAAP法: 一抗为兔抗鼠IgG, 二抗用未标记的羊抗兔IgG, 终抗是提前制成的AKP-兔抗AKP复合物. 其中二抗需过量, 其一个Fab段与一抗结合, 另一个Fab段与兔APAAP复合物 中抗酶抗体结合.
免疫组化方法和步骤
免疫组化方法和步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测细胞或组织中特定蛋白质的表达水平，以及研究细胞或组织中的蛋白质定位和相互作用。
免疫组化方法涉及一系列步骤，包括样本固定、抗原检测与标记、抗体与抗原结合、可视化和结果分析。
以下是免疫组化方法及步骤的详细介绍。
一、样本固定免疫组化实验的第一步是固定样本，通常使用福尔马林或乙醛等化学物质进行固定。
固定的目的是保持细胞和组织的形态结构，并防止蛋白质的降解。
固定过程中，需要将样本固定在载玻片或膜上，以便之后的实验操作。
可使用刷子或杆状工具将样本涂布在载玻片上，或者使用离心管和离心机将细胞沉淀在载膜上。
二、抗原检测与标记样本固定后，下一步是检测和标记目标抗原。
有两种常用的方法供选择：直接法和间接法。
1.直接法：直接法在一个步骤中同时检测和标记抗原。
直接法可以快速获得结果，但受到抗体的特异性和标记物的可用性的限制。
2.间接法：间接法需要两个步骤，先使用特异性初级抗体与抗原结合，再使用标记有染料或标记物的二级抗体与初级抗体结合。
间接法具有较高的灵敏度和特异性，可以用于多重标记和检测多个蛋白质。
三、抗体与抗原结合蛋白质和抗体结合是免疫组化的关键步骤。
待检样本上固定的抗原与抗体结合可以直接检测或通过信号增强来检测。
抗体与抗原结合的时间和温度取决于抗体的亲和力和特异性，通常需要在较低的温度下进行孵育，并在孵育过程中提供充分的抗体与抗原接触时间。
四、可视化可视化是将抗原抗体结合信号转化为可见光信号的过程。
最常见的可视化方法之一是使用酶标测定法。
酶标测定法将酶（如辣根过氧化物酶）结合到标记物（如荧光素黄标记的二级抗体）上，然后通过加入底物（如DAB）产生可见的色素反应。
除了酶标测定法外，还有其他可视化方法，如免疫荧光技术和原位杂交。
免疫荧光技术使用标记的荧光染料标记一级或二级抗体，然后通过荧光显微镜观察样本。
原位杂交使用与DNA序列互补的标记探针识别特定的DNA序列，并通过可视化标记（如荧光）来检测靶标。
常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法免疫组织化学染色是通过将抗原与抗体结合来检测组织中特定蛋白质的染色方法。
它是现代生物医学中常用的一种技术，可以用于研究分子生物学、细胞生物学、病理学等领域。
以下是一些常用的免疫组织化学染色方法介绍：1. 免疫组化染色(Immunohistochemistry, IHC)：免疫组化染色是免疫组织化学中最常用的方法之一、其基本原理是使用一种与目标抗原特异性结合的抗体，将抗原与抗体结合，然后通过染色方法将表达该抗原的细胞或组织可视化。
常用的染色剂包括多聚酶、酶标、荧光素和放射性同位素。
IHC可以用于检测细胞表面抗原、细胞器中的抗原以及胞内蛋白质的定位。
2. 免疫荧光染色(Immunofluorescence, IF)：免疫荧光染色利用荧光标记的抗体来检测特定抗原。
它可以提供高度特异性和灵敏度的探测，可以用于研究蛋白质的亚细胞定位、蛋白质相互作用等。
利用该方法可以用于检测多种类型的标记（单标记、双标记、复合标记等），从而实现多重染色或共定位染色。
3. 免疫电镜染色(Immunoelectron microscopy, IEM)：免疫电镜染色是一种将金粒标记的抗体用于电子显微镜下观察并定位特定抗原的方法。
通过将金粒结合到抗原-抗体复合物上，可以在电子显微镜下清晰地观察到抗原的位置和分布。
这种方法具有高分辨率和高特异性的优点，广泛应用于超微结构的研究。
4. 免疫酶标染色(Immunoenzyme staining, IES)：免疫酶标染色是使用酶作为标记物，通过化学反应将抗原与酶标记的抗体结合，从而显示出特定抗原的位置和分布。
常用的标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等。
在检测抗原时，标记物可以与染色底物产生反应生成可见色素，形成染色，以显示抗原的位置和分布。
5. 免疫组织化学原位杂交(Immunohistochemical in situ hybridization, IHC-IS)：免疫组化原位杂交技术是一种结合了原位杂交和免疫组化技术的方法。
免疫组化实验方法
免疫组化实验方法免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用特异性抗体与组织或细胞特定抗原结合的方法，以此可以检测细胞或组织中蛋白质的表达和分布情况。
IHC技术已广泛应用于病理学、癌症诊断、生物医学研究等领域。
以下是免疫组化实验的常用方法：1.样本处理：通常以石蜡包埋切片作为实验样本。
首先，从固定的组织或细胞中取得标本，然后进行脱水、透明化和浸蜡等处理。
接下来，使用切片机将组织或细胞切割成厚度为3-5μm的切片。
2.抗原恢复：由于样本的固定和包埋可能导致抗原的损伤，因此需要对切片进行抗原恢复处理。
常见的抗原恢复方法包括热处理、酶解法和酸性水解法。
热处理是将切片置于缓冲液中，在高温下进行退火。
酶解法是使用胰蛋白酶等酶对切片进行消化。
酸性水解法则使用盐酸或酶进行酸性处理。
3.抗体结合：选择特异性的一抗体与目标抗原结合。
一抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以经商业采购或自家制备。
将一抗体加入待检测切片上，让其与目标抗原结合。
4. 第二抗体结合：待检测切片上结合了一抗体的抗原后，需要添加第二抗体与一抗体结合。
第二抗体通常是反相应物免疫球蛋白（Secondary Antibody），如反人IgG，反兔IgG等。
第二抗体上常会标记有发光物质、酶标记物或荧光染料，用于可视化结果。
5.可视化和显色：根据选择的第二抗体，可以选择显色方法。
例如，辣根过氧化物酶（HRP）结合的第二抗体可以使用3,3'-二氨基联苯思（DAB）作为底物，呈棕色或棕黄色；荧光标记的第二抗体可以用荧光显微镜进行观察。
6.伪染色：为了辅助观察和识别目标组织或细胞，可以进行伪染色。
常见的伪染色方法有对比染色、核染色和细胞质染色等。
7.阴性对照和阳性对照：为了确保实验结果的准确性和可靠性，同时进行阴性对照和阳性对照实验。
阴性对照是在实验中将第一抗体替换为非特异性抗体或缺少抗体的处理组织或细胞组织；阳性对照是在实验中使用已知表达目标蛋白的组织或细胞进行处理。
免疫组化的检查方法
免疫组化的检查方法
免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种常用的生物医学分析方法，用于检测组织或细胞中特定蛋白质的表达情况。
以下是免疫组化的检查方法流程：
1. 取得组织样本：通常使用组织切片、细胞涂片或细胞悬液作为检测样本。
2. 固定样本：将样本用适当的固定剂进行固定，以保持细胞或组织的形态结构。
3. 抗原修复：修复固定后的样本中的蛋白质，以恢复其免疫反应性。
这一步通常需要使用热解修复（如煮沸法）或酶解修复（如蛋白酶K处理）。
4. 抑制内源性酶活性：使用过氧化物酶抑制剂等化学物质，以抑制组织或细胞中的内源性酶活性，以避免假阳性结果。
5. 孵育抗体：将特异性抗体加入到样本中，并进行适当的孵育条件下，使抗体与目标蛋白质结合。
6. 洗涤：使用缓冲液对样本进行多次洗涤，以去除未结合的抗体。
7. 标记二抗：加入适量的与抗体标记的二抗（如辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗小鼠IgG）与上一步已结合的一抗结合。
8. 再洗涤：使用缓冲液对样本进行多次洗涤，以去除未结合的二抗。
9. 染色和可视化：加入合适的底物（如DAB）使其与HRP反应生成可见色素，形成免疫染色，以显示阳性表达的位置。
10. 目视观察：使用显微镜观察样本，并根据染色强度和分布位置来评估阳性的免疫反应。
免疫组化是一种常用的分子生物学技术，可用于研究细胞和组织的分子标志物、蛋白质表达水平及其分布情况，它已广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗评估等领域。
免疫组化鉴定菌种的方法
免疫组化鉴定菌种的方法免疫组化是一种常用的实验技术，用于鉴定菌种和研究细胞和组织之间的相互作用。
该技术基于免疫学原理，通过特异性抗体与靶分子结合来检测菌种的存在和特有的生物学功能。
本文将介绍免疫组化鉴定菌种的原理和常见的实验方法。
一、免疫组化原理免疫组化利用抗体与其特异性蛋白质抗原结合的特性，通过荧光染料或酶标记来检测目标分子的存在。
该技术主要包括以下几个步骤：1.样品处理：菌株或细胞培养液通常需要经过固定、包埋或脱水等处理，以保持其形态和结构的完整性。
2.抗体孵育：将标记有特异性抗体的荧光染料或酶标记与待检测的样品接触，使其与目标抗原结合。
3.清洗：将未结合的抗体去除，以减少非特异性背景信号。
4.信号检测：通过荧光显微镜或酶标测定，观察目标分子的位置和表达水平。
二、免疫组化实验方法1.免疫组化染色法免疫组化染色法是一种常用的实验方法，用于在细胞和组织中检测特定抗原的分布和表达。
该方法可分为直接法和间接法：直接法：将已标记的抗原直接与待检测的组织或细胞接触，然后观察染色结果。
这种方法操作简单、快速，但特异性较差，主要适用于已知抗原的情况。
间接法：通过与辅助抗体结合来增强染色信号的强度和特异性。
首先将待检测样品孵育于特异性抗原的抗体中，然后孵育与特异性抗体结合的辅助抗体，最后使用荧光染料或酶标记的二抗进行检测。
该方法灵敏度高，适用于未知抗原的情况。
2.免疫组化电镜法免疫组化电镜法结合了免疫组化和电子显微镜技术，可用于检测细胞和组织中微小结构的特异性抗原。
该方法主要分为直接法和间接法：直接法：直接将标记有特异性抗体的金或其他金属胶体颗粒与待检测的组织或细胞接触，观察金颗粒在电镜下的位置。
间接法：与免疫组化染色法类似，通过辅助抗体结合来增强信号强度和特异性。
在免疫反应后，使用标记有金或其他金属胶体颗粒的二抗进行检测。
3.免疫组化流式细胞术免疫组化流式细胞术常用于检测细胞表面或细胞内特异的蛋白质抗原。
该方法主要分为两种：直接流式细胞术：将标记有荧光染料的特异性抗体与待检测细胞接触，然后通过流式细胞仪测定细胞的荧光强度和受体数目。
免疫组化量化
免疫组化量化免疫组化是一种常用的分子生物学技术，用于检测细胞或组织基质中特定蛋白质的表达水平、定位及分布情况。
因为其具有高灵敏度、高特异性和高分辨率的优势，所以广泛应用于许多领域，例如生物学、医学、临床医学等。
在免疫组化中，可以利用激光共聚焦荧光显微镜、电子显微镜和光学显微镜等设备，对免疫染色的结果进行观察和分析，并通过计算机处理和量化来得到结论。
免疫组化量化的方法多种多样，常用的包括光度计法、荧光显微镜法、像素面积法、计数法和形态学分析法等。
一般来说，免疫组化染色后的结果可以采用两种方式进行分析：定性分析和定量分析。
定性分析是指通过观察免疫染色后的显微照片或显微镜图像，判断生物标志物在细胞或组织中是否表达或局限于哪些细胞区域。
而定量分析则是在免疫组化染色的基础上，通过计算某种生物标志物在细胞或组织中的积累量或比例，以实现定量化。
免疫组化中最常用的定量分析方法是光度计法和荧光显微镜法。
光度计法的原理是：将组织样品重复挤压到玻璃微孔板（microplate）上，加入一定浓度的色素，通过变光器（photometer）读出标准光谱的吸光度，然后测定样品光谱的吸光度。
经过计算比较两个吸光度的误差，就可以确定生物标志物在样品中的浓度。
荧光显微镜法的原理是：将离子染料（如DAPI、Propidium iodide等）与免疫染色材料结合，观察其在荧光显微镜下的荧光强度和分布，以确定生物标志物在样本细胞和组织中的表达和分布情况。
在免疫组化量化中，另一个重要的方法是像素面积法，它适用于基于数字图像的免疫组织染色分析。
该方法的原理是：利用数字图像处理软件对免疫染色后的显微镜图像进行分析，通过计算生物标志物颜色区域像素的数量及其面积，在细胞或组织中定量化生物标志物的表达水平。
另外，免疫组化量化中还可以采用计数法和形态学分析法进行分析。
计数法是在样品的不同区域计算生物标志物的数量和密度，以确定其在细胞和组织中的表达和分布情况。
免疫组织化学常用方法大全.pdf
● HRP/POD（辣根过氧化物酶）
显色原理：
HRP + H2O2 体）
HRP ·H2O2 + 供氢体 （电子供
型）
HRP + H2O + 供氢体 （氧化
DAB（二氢基联苯胺） 棕褐色 AEC（3-氢-9-乙基咔唑） 红色 TMB（四甲基联苯氨） 深蓝色
● ALP/AP（碱性磷酸酶） 底物：萘酚（As-Mx） 发色团：Fast Blue Fast Red BCIP/NBT
6. ABC复合物， 45 min 7. PBS洗涤 5 min × 3次 8. 显色（H2O2/DAB）、复染、封片 9. 观察、记录
second antibody-biotin + Avidin + biotinHRP
ABC复合物的配制： biotin：avidin 1：4 avidin 10μg/ml biotin 2.5μg/ml 临用前30分钟配制
一、SP法 （ Streptavidin Peroxidase conjugated method ）
生物素标记的第二抗体与链霉菌 抗生物素蛋白连接的过氧化物酶结合。
操作步骤： ● 石蜡切片，脱蜡至水； ● 过氧化酶阻断溶液，以阻断内源性过
氧化酶的活性； ● 第一抗体； ● 生物素标记的第二抗体； ● 链霉菌抗生物蛋白-过氧化物酶溶液； ● 显色、复染、封片、观察。
基本原理与操作步骤
第一节 免疫酶细胞化学
免疫酶细胞化学是免疫组织化学中 最常用的方法，它是在抗原抗体特异反 应存在的前提条件下，借助于酶细胞化 学手段，检测某种物质（抗原／抗体） 在组织细胞内的存在部位。即预先将抗 体与酶连结（酶标抗体），再使其与组 织内特异性抗原反应，经细胞化学染色 后，在光镜或电镜下观察分析。
免疫组化方法集合
免疫组化方法集合免疫组化是一种广泛应用于生物学和医学研究领域的方法，主要用于检测和定位细胞和组织中的特定蛋白质分子。
通过结合抗体和荧光标记或酶标记等物质，可以在细胞和组织中准确地定位目标分子，并提供关于它们的表达和分布的定量信息。
在免疫组化中，抗体是核心的关键因素。
抗体是一种特异性识别分子的蛋白质，能够结合到特定的抗原分子上。
在免疫组化中，我们首先需要选择和优化与目标分子结合的抗体。
传统方法包括动物免疫技术和重组DNA技术。
在动物免疫技术中，通常使用实验动物（如小鼠、兔子等）注射抗原来诱导免疫应答，然后从动物体内收集血清作为抗体源；而在重组DNA技术中，通过克隆目标分子的DNA片段来构建重组抗体或单克隆抗体。
近年来，也出现了一些新的技术，如脱敏化兔子技术、脂质体免疫启动技术等，用于提高抗体的产量和特异性。
抗原检测是免疫组化的重要步骤。
根据不同的需求，可以采用直接或间接法检测抗原。
直接法是指将标记有荧光物质或酶物质的特异性抗体直接与细胞或组织中的目标分子结合，然后通过观察荧光或酶标记的反应来检测目标分子的存在。
间接法则是引入第二抗体来增强检测信号。
第二抗体通常与荧光物质或酶物质标记，可以与第一抗体结合，然后观察荧光或酶标记的反应来间接检测目标分子的存在。
间接法可以增强检测的灵敏度和特异性，但也增加了一些额外的步骤和耗时。
荧光免疫组化是一种常用的免疫组化方法之一、在荧光免疫组化中，常用的荧光标记物包括荧光染料、荧光蛋白质（如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等）和钙荧光探针等。
通过将这些标记物与特异性抗体结合，可以在细胞和组织中检测和定位目标分子。
荧光免疫组化具有高灵敏度和高分辨率的优点，可以用于观察细胞和组织中特定蛋白质的亚细胞定位和表达水平的定量测量。
酶标免疫组化是另一种常用的免疫组化方法。
在酶标免疫组化中，常用的酶标记物包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
这些酶标记物能够与特异性抗体结合，并在添加特定底物后产生可见的颜色反应或荧光反应。
免疫组化sp法
免疫组化SP法引言免疫组化(SP)法是一种常用的免疫组织化学染色技术，用于检测细胞和组织中蛋白质的表达情况。
相较于传统的免疫组化方法，SP法的敏感性和特异性更高，能够提供更准确的结果。
本文将介绍免疫组化SP法的原理、步骤和应用，并提供一些实验技巧和注意事项。
原理免疫组化SP法结合了辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）的酶标系统。
HRP可以催化有机物质与底物间的氧化还原反应，生成可见光。
而AP则能够催化磷酸酯与底物间的酸碱中和反应，生成二级离子，进而酶促反应。
SP法利用这两个酶的双重酶标效应，使得染色结果更明显，背景噪音更低。
实验步骤免疫组化SP法通常包括以下步骤：1.取得标本：首先需要准备待检测的组织样本或细胞制片。
可以选择固定、冻存或石蜡包埋样本。
2.制备切片：将组织样本切割成适当的厚度，一般为4-5μm。
使用玻璃片或载玻片使切片固定在切片架上。
3.脱脂去蜡：将切片在温水中浸泡片刻，去除石蜡并暴露组织。
4.抗原修复：根据需要，在组织上施加适当的抗原修复方法，以恢复由于石蜡包埋而导致的抗原损失。
5.抗体孵育：将适当的一抗或多抗添加到切片上，使其与目标蛋白结合。
根据需要，可以在抗体孵育前进行非特异性蛋白质封闭，以防止非特异性结合。
6.一抗信号放大：使用HRP标记的二抗与前一步骤结合的抗体结合。
在此步骤中，HRP将抗原邻近的HRP底物转化为可见的颜色。
7.二抗信号放大：使用AP标记的二抗与前一步骤结合的一抗结合。
AP 酶可将AP底物转化为色素，产生二级离子，使染色结果更明显。
8.染色：在适当的时间和温度条件下，在样本上施加适当的染色试剂，使目标蛋白在显微镜下呈现出想要的颜色。
9.倒置显微镜：使用倒置显微镜观察染色结果，根据需要进行图像拍摄记录。
实验技巧在进行免疫组化SP法实验的过程中，有一些技巧可以帮助提高实验效果：1.样本处理：对样本进行适当的抗原修复和封闭，以免出现非特异反应。
2.抗体选择：选择与目标蛋白有高度亲和力的特异性抗体，以提高染色的准确性。
免疫组化抗体选择及常用染色方法
免疫组化抗体选择及常用染色方法一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
二、免疫组化实验用抗体的选择1、一抗选择要点(1)选择单克隆还是多克隆抗体。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
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标记生物素-抗生物素技术(Labelled Avidin-biotin technique,LAB技术)
2.差异大,注意厂家、批号
3.4C保存
Disadvantages of ABC
1.ABC的IP约为10,中性pH时带正电荷,容易与nucleus等带负电荷结构非特异结合.
2.Avidin是glycoprotein,与lectins等分子通过碳水化合物连接
•通过用streptavidin(抗生蛋白链霉素)代替avidin克服上述缺陷.
3.标本:不能太厚
4.封裱剂:无自发荧光,无色透明,pH8.5-9.5,常用甘油和0.5mol/L pH9.0-9.5碳酸盐缓冲液等量混合
5.镜油:无荧光镜油,或甘油或液体石蜡
2.Enzyme-Mediated Detection
直接法(Direct)
间接法(Indirect)
基本原理
•以间接法法为例
•阳性对照：已知阳性
•阴性对照：
1.已知阴性
2.空白对照BS代替特异性抗体
3.替代对照:用同种属正常血清代替特异性抗体
4.吸收实验:先用抗原吸收一抗
5.抑制实验:先用未标记抗体,再用标记抗体
6.置换实验:用无关的特异性抗体代替一抗
Antibody Detection
• There are several different methods that can be employed to detect antibodies bound to tissue, depending upon whether the label used is enzymatic or fluorescent.
•光源寿命有限,应集中观察,防止反复点燃,灯熄后应充分冷却才能再次点燃,一次观察时间不能太长,以2-3h内为宜
•标本染色后应尽快观察,存放在4C能延缓荧光衰减,标本不能长时间暴露于紫外线
荧光显微镜标本制作要求
1.载玻片:厚度均匀,0.8-1.2mm之间,光洁,无自发荧光
2.盖玻片:厚度0.17mm,光洁
•一抗是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体（80-90%多抗由家兔制得，单抗由小鼠制备）
•二抗为一抗（IgG）的抗体。
•优点：只要一抗来自同一种属，同一标记的二抗就能用来显示不同的抗原，避免了直接法标记每一种一抗，提高了敏感度。
酶标抗体法的特点
•用于标记的酶应具备以下几点:
1.酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，易于光、电镜观察
抗原与抗体、植物凝集素与糖类、生物素与抗生物素、SPA与IgG、阳离子与阴离子、配体与受体等。
• Avidin-Biotin interactions or other commercially-available amplifiers
生物素-抗生物素基本原理
• Avidin卵白素，统称为抗生物素或亲和素a basic glycoprotein，MW 68 Kd
7.载体蛋白抗体:制备半抗原的抗体时,使用了载体蛋白,用固相吸收技术将载体蛋白抗体除去
增加染色强度方法
1.重复显色
2.重复一抗
3.双桥PAP法
亲和组织化学（Affinity histochemistry）
•新技术的出现----新进展
•特点一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素(Lectin)、生物素（Biotin）和葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein, SPA）等被应用于ICC，其共同特点是以一种物质对某种组织成分具有高亲和力为基础。它们既有别于古老的组织化学的分解、置换、氧化和还原，本质上又非抗原抗体反应。称为亲和组织化学（Affinity histochemistry）。广义的亲和组织化学包括：
Antibody Staining
• Primary antibody may be directly labeled
• labeled secondary antibody or more complex detection system.
• secondary antibody against the immunoglobulins of the primary antibody source
过氧化物酶抗过氧化物酶法(Peroxidase Antiperoxidase ,PAP法)
•原理与酶桥法相似
•制备PAP复合物:使抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物
PAP复合物的特征
•在抗原稍过量时,所有抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物
• PAP复合物的形状相当稳定,不受抗原量的影响
• PAP复合物中HRP/抗HRP抗体的比例为3:2,即由3个HRP分子与2个抗HRP抗体组成,呈五角形结构
• Streptavidin: a protein (MW 60 Kd) isolated from the bacterium Streptomyces avidinii(链霉亲生物素蛋白), and like avidin, has four high affinity binding sites for biotin. IP接近中性,在中性pH时很少带电荷, not a glycoprotein and therefore does not bind to lectins.
1）脱蜡、水化组织切片。
2）预处理组织切片（据一抗具体说明而定）
3）蒸馏水漂洗，置于TBS中。
4）阻断内源性过氧化物酶（仅用于EnVisionTM/HRP）
5）蒸馏水漂洗，置于TBS，10分钟
6）一抗孵育10-30分钟
7）TBS漂洗10分钟
8）EnVisionTM孵育10-30分钟
9）TBS漂洗10分钟
减少或消除非特异性染色的方法
•最常见原因蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上
•最有效方法
1.在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清（1:5-20）10-20min，
2.加入2-5%牛血清白蛋白可进一步减少非特异性染色，
3.用除制备第一抗体以外的其它动物血清（非免疫的）
对照实验
主要是针对第一抗体对照，常用方法：
10)色源底物溶液孵育10分钟
11)蒸馏水漂洗
12)复染及封片
免疫染色方法
The basic principles of ICC
•抗原抗体反应
•标记化学反应
•呈色化学反应
要求
待检标本形态结构
和抗原性保存良好,Байду номын сангаас
抗原不从原位扩散
或丢失
Specimen preparation
取材新鲜，固定及时，形态保存完好，抗原物质的抗原性不丢失、不扩散和被破坏
2.所形成的终产物必须稳定,不能弥散
3.较易获得,价廉,最好已商品化
4.组织中不应存在内源性酶或类似物质
5.酶应稳定,标记后保持酶和抗体的活性
缺点酶与抗体共价结合损害部分抗体和酶的活性
三步法(HRP labelled)
多层反应法
Alkaline Phosphatase - Anti-Alkaline Phosphatase (APAAP) Technique
免疫组化常用方法
二步法：EnVision System
EnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即
EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。
EnVision工作程序：
1. Fluorescence
2. Enzyme-Mediated Detection
3.亲和组织化学（Affinity histochemistry）
1. Fluorescence
Directly Indirectly
直接法间接法
补体法
双标法
使用荧光显微镜的注意事项
•暗室
•点燃汞灯5-15min,稳定后再开始观察
PAP法的评价
•抗体活性高:非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性
•灵敏度高:3个酶分子对应1个抗原
•不适合免疫电镜AP复合物分子量大
•背景染色低
假阴性及其处理
假阳性及其处理
1.组织细胞内色素:如神经黑色素,可用AKP代替HRP
2.假过氧化物酶活性:如RBC内的血红素辅基,用甲醇-0.3%H2O2预处理15-20min(室温)
• biotin生物素，small water soluble vitamin（vitamin H），MW 24Kd，
• Avidin(卵白素)具有4个同biotin(生物素)亲和力极高（较抗原抗体高100万倍）的结合点。能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。同时它们都具有与其它示踪剂结合的能力。
3.内源性过氧化物酶活性:如粒细胞、巨噬细胞等，用AKP代替HRP
4.游离醛基:与蛋白质(含IgG)非特异性结合,用白蛋白预孵育封闭之
5.疏水键和离子键: Ig可通过疏水键和离子键与组织中的碱性蛋白或Fc受体非特异性结合,用正常血清(首选制备二抗的种属)于一抗前孵育封闭之
6.天然抗体及不纯抗体:增加一抗稀释度
• Fixation
• Sample Type
Cryostat (frozen) sections
Paraffin Sections
Antigen Retrieval Techniques
• Intention: To facilitate the immunological reaction of antibodies with antigens (increase reactivity of the majority of antigens) .