免疫组化双重染色技术
免疫荧光双标操作方法及注意事项
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
免疫组化双重染色技术在胸腺肿瘤PD-L1检测中的应用
-1032-临床与实验病理学杂志J Cliv Exp Patinl2020Dec；36(8)网络出版时间：2020-8-258：46网络出版地址：https://kus.c/di.ue/kcms/2e4il/34.1073.R.62221025.1457.025.htul免疫组化双重染色技术在胸腺肿瘤PD-P1检测中的应用邢杰，赵继开，丁闻洁，韩昱晨关键词:胸腺瘤;PDW/PD-L-;免疫组化双重染色中图分类号:R734.5文献标志码：B文章编号：008-7366（2222）10-1435-03doi:44.13315/j.c/di.cjcep.7020.10.226PDW/LD-CI通路已经在多种肿瘤中进行了广泛深入的研究，如黑色素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌等，并且PDN/PD-L8表达可能与恶性肿瘤的临床病理特征或不良预后相关J T。
近年来国内外关于胸腺瘤PDN/PD-C-的研究较少，但均表明PD-CI表达与胸腺肿瘤（包括胸腺瘤和胸腺癌）的组织学类型、MasaWs分期以及疗效相关，并且能够提示肿瘤的恶性程度及预后J「5。
常规PD-C8检测方法为免疫组化，但PD-C8在正常的胸腺上皮细胞及淋巴细胞中也有表达J-6,可能使得免疫组化染色结果判读困难，为解决这 一问题，作者尝试采用P/3+PDW-免疫组化双重染色法对胸腺肿瘤进行染色，由于p/3广泛表达于上皮源性肿瘤细胞胞核,p63+PD-C I免疫组化双重染色法能够更加清楚的判断胸腺源性上皮细胞的PD-C8阳性率。
1材料与方法14材料收集上海市胸科医院病理科存档的胸腺肿瘤手 术切除样本64例，其中B1、B2及B3型胸腺瘤各I5例，胸腺癌-5例，每例胸腺肿瘤连续切片3张，分别用于HE染色、PD-C8免疫组化染色、p63+PD-C I免疫组化双重染色。
14染色方法标本均经I0%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，免疫组化染色采用Mulbmer法，染色平台为Dabu Link48全自动免疫组化染色平台,一抗PD-CI（22C3,5 :50,Dako公司）、p63（-:300,上海长岛生物公司、，其他试剂均为Dako AuWstainr Link48全自动免疫组化染色平台专用试剂,购自安捷伦科技（上海）公司。
免疫荧光双染
免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS 后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
08 免疫组化双重染色技术汇总
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3. 步骤: a: 第一次染色后, 除去抗体和 酶而使有色反应终产物留在 抗原部位, 再用同样方法进行 第二次染色. *. 切片处理, 抑制内源性酶及 NGS封闭同前. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2显色. TBS洗. *. 氧化法洗脱. TBS洗. *. 用PAP法完成第二次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2显色. TBS 洗. 甘油胶封片.
大鼠垂体前叶促性腺激素细胞 (蓝色)和生长激素细胞(棕色), 免疫酶(PAP法)双重染色. 1993.
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b: 第一次染色后, 照相记录结果并记住照相视野的部位. 用有 机溶剂将反应终产物溶解除去, 洗脱抗体复合物, 然后进行第 二次染色. 对同一部位再一次照相, 比较先后照相所得照片. *. 切片处理同上. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2显色. TBS洗. *. TBS封片, 照相(注意防止切片干燥). *. 去盖片, TBS洗, 再用酒精-二甲苯-酒精处理, 除去CN蓝色反 应产物, DDH2O洗. *. 氧化法洗脱, TBS洗. *. PAP法第2次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2显色. TBS洗. *. 甘油胶封片, 找出第一次照相的部位, 再次照相.
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假性双标的来源
第一次用ABC法染色, 氧化法洗脱抗体. 对照 试验证实此为假性双标. 1992.
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2. 抗体洗脱法: a. 酸洗法: 在pH2.2甘氨酸(Glycine)-HCl缓冲液中加入适量二 甲基甲酰胺(Dimethylfomamide, DMF), 作用1~4小时使抗原-抗 体复合物解离. b. 氧化法: 2.5% KMnO4: 5% H2SO4: DDH2O=1:4:10~260, 1分, 氧 化除去抗体, 0.5%偏重亚硫酸钠 (Sodium Metabisulfite, Na2S2O5)漂白液脱色. 第一次染色用CN显色, 并注意对第二种 抗原的影响(可设立对照). c. 甲醛蒸气法: 1升容器+3g多聚甲醛+切片, 置80℃烤箱1~4小 时, 蒸汽破坏抗体的Ig结合部位.
一种简便、可靠的免疫组化双重标记新方法
一种简便、可靠的免疫组化双重标记新方法崔白苹;高璀乡;熊存全;孙安阳【摘要】Aim To establish a convenient, reliable and high- n<br> contrast method of immunohistochemical double labeling, n<br> which can be observed with ordinary optical microscopy, and the staining results can be preserved permanently. Method This double labeling method employedthe single detection system, HRP conjugated second antibodies, and used the substrates of 3,3′-diaminobenzidine ( DAB) and Nickel-enhanced DABre-spectively. When the first labeling was completed, HRP was to-tally inactivated by boiling for 4~5 min to prevent the cross-re-action in the second labeling. Results ( 1 ) Boiling for 5 min could completely inactivate HRP activity, whereas 5% H2 O2 treatment only reduced HRP activity, and residual enzyme activ-ity generated the cross-reaction between two labeling. Boiling for a few minutes did not damage positive DAB staining in the first labeling or tissue integrity. (2) There was a sharp contrast be- n<br> tween DAB in brown and Nickel enhanced DAB in purple-blue, which also gives clean backgrounds;reversely applying the sub-strates will ruin the quality of double labeling. In addition, the above method allowed conventional mounting protocol using xy-lene and Permount, instead of a water-based mounting medium, thus the staining results could be permanently preserved. Con-clusion As the same HRP detection system is employed, this novel double labeling method is simple, convenient and reliable. The method would bear broad applications in basic and clinicalresearch.%目的：探索一种简便可靠、清晰的免疫组化双重标记方法,可用普通光学显微镜观察,并能长期保存染色结果。
应用双重免疫组化染色法研究P53与细胞角蛋白在鼻咽癌中的表达
应用双重免疫组化染色法研究Ｐ５３与细胞角蛋白在鼻咽癌中的表达[摘要] 目的应用双重免疫组化染色法，研究P53与细胞角蛋白在鼻咽癌中的表达。
方法50例鼻咽部低分化鳞癌组织，P53单克隆抗体，CK多克隆抗体，双重免疫组化染色。
结果50例鼻咽部低分化鳞癌组织标本均有不同数量的双标记阳性细胞，即P53与CK同时表达。
结论双重免疫组化染色法，可用于研究P53与细胞角蛋白在鼻咽癌中的表达。
[关键词]双重免疫组化染色法；鼻咽癌；P53；细胞角蛋白[文献标识码]A[文章编号] 1673-755512007]02-5-02双重染色法是在一张切片上做两种不同染色的方法，如免疫组化和免疫组化、免疫组化和原位杂交、免疫组化和特殊染色等。
其中双重免疫组化染色是在同一张切片上显示两种不同抗原的免疫组化染色方法，这种方法可以了解不同细胞、组织之间的相互关系，甚至可以了解同一种细胞内抗原之间的相互关系。
本实验运用双重免疫组化染色法，在一张切片上同时显示鼻咽部低分化鳞癌组织P53与细胞角蛋白(cytokeratin，CK)，用以观察CK阳性的癌细胞是否同时表达P53。
1材料和方法1．1材料50例鼻咽部低分化鳞癌组织，选自郑州大学三附院病理科2004年1月～2006年1月标本。
1．2方法1．2．1 P53单克隆抗体，CK多克隆抗体，双重免疫组化染色试剂盒，均为美国Maxim公司产品。
预实验中将同一组织连续切片4张，分别先后进行P53、CK染色，其中每种染色都分别使用不同的显色方法，如链霉菌抗生物素—碱性磷酸酶，用5—溴-4-氯—3吲哚磷酸盐／氯化硝基四氮唑蓝(BCIP／NBT)显色，呈紫黑色；而链霉菌抗生物素—过氧化物酶，则用3—氨基-9-乙基卡唑(AEC)显色，呈橙红色；最后根据着色情况，将着色深的P53(BCIP／NBT显色)定为首先显色的一抗。
1．2．2双重染色过程(1)石蜡切片脱蜡水化；(2)过氧化酶阻断溶液10min，PBS洗；(3)非免疫性动物血清10min，PBS洗；(4)一抗PCNA 60min，PBS洗；(5)生物素标记的二抗10min，PBS洗；(6)链霉菌抗生物素—碱性磷酸酶溶液10min，PBS洗；(7)BCIP／NBT，显微镜下观察10～30min，阳性显色为紫黑色,PBS洗；(8)双染增强液10min，PBS洗；(9)重复(3)；(10)一抗GFAP 60min，PBS洗；(11)重复(5)；(12)链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液10min，PBS洗；(13)新鲜配制的AEC显微镜下观察5～10min，阳性显色为橙红色；(14)自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝，水性封片剂封片，显微镜观察。
免疫荧光双染
免疫荧光双染 Jenny was compiled in January 2021免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
EMA与p53免疫组化双重染色法(1)
・技术交流・EMA与p53免疫组化双重染色法王永军,刘世正,王 珩,王小玲,吴国祥 (河北医科大学第四医院病理科,石家庄 050011)[关键词] E M A; p53; 免疫组化; 双重染色[中图分类号] R44618 [文献标识码] B [文章编号]1007-8096(2005)03-0232-01 免疫组化双重染色法是在同一切片上显示两种不同抗原成分的免疫组化方法。
为了在同一张切片上显示胃癌中E M A和p53,用以观察它们之间的相互关系,我们经实验成功地在同一张切片上完成了胃癌E M A和p53这两种抗原的双向表达,为研究同一细胞内它们之间的相互关系提供了可靠方法。
1 材料与方法111 材料 胃癌标本56例(包括肿瘤及胃上下两残端)取自河北医科大学第四医院病理科2003年存档蜡块,并抽取HE 切片进行复诊。
试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
112 方法 石蜡切片4～5μm厚,脱蜡至水。
3%H2O2室温孵育10min,消除内源性过氧化物酶,蒸馏水洗、P BS洗3×5 min。
5%～10%正常山羊血清封闭10min,倾去勿洗,滴加一抗E M A(1∶100)孵育1h,P BS洗3×5min;滴加二抗,室温孵育10min,PS B洗3×5min;滴加三抗,室温孵育10min,P BS洗3×5min。
DAB显色,镜下控制阳性细胞呈棕色为止,充分蒸馏水洗,0105%Hcl(pH210)洗脱,室温孵育30min,充分水洗, P BS洗3×5min。
枸橼酸盐缓冲液热修复20min,自然冷却后P BS洗3×5min,进行第二种染色。
再次滴加正常山羊血清封闭10min,倾去勿洗,滴加p53(1∶100)孵育1h,P BS洗3×5min。
重复5至6次,AEC显色,镜下控制阳性细胞呈红色为止,充分水洗;苏木精复染核,滴加甘油明胶封固。
2 结果胃腺癌细胞E M A(+),胞质呈棕褐色颗粒。
免疫组化-双重染色
免疫组化双重染色方法和步骤：在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。
此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);不同种属来源的抗体双重染色。
目前，最常用的是最后一种方法。
不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。
但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。
在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。
即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。
该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。
试剂配制：1、3％过氧化氢甲醇：30％H2O210ml＋纯甲醇90ml→充分混匀。
2、0.3％过氧化氢甲醇：30％H2O21ml＋纯甲醇99ml→充分混匀。
3、免疫组化专用PBS（pH7.2—7.6）：NaCl8.5g＋磷酸氢二钠（无水）2.8g＋磷酸二氢钠（无水）0.4g溶于双蒸水并定容至1000毫升。
然后测pH值使之在7.2—7.6。
如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
4、0.3％TritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚）：TritonX－100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。
双重或多重免疫组化标记PPT
投资银行理论与实务
操作举例：垂体腺瘤----ACTH与GH 双重免疫荧光标记染色（间接法）
(1)石蜡切片，厚5µ m，常规二甲苯 脱蜡，梯度酒精水化，入PBS(pH7.4, 0.01mol/L)。
武汉理工大学经济学院 曾玲玲
投资银行理论与实务
(2)1％人血清白蛋白（HAS）孵育10min （亦可用10％正常羊血清代之），不洗。
武汉理工大学经济学院 曾玲玲
投资银行理论与实务
(2)以0.05mol/L TBS(pH7.4含1％ Triton X-100，下同)，浸洗5min；
(3)加入1％HSA 5min；不洗；
(4)以兔抗ACTH血清(1:200)孵育，4℃， 20h，室温下2h，TBS洗，用上述一抗重 复孵育1次，TBS喷射冲洗，然后浸洗 10min，3次，TBS (pH8.2)浸洗5min；
投资银行理论与实务
(1)石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固定 液固定的组织则需用0.5%碘的乙醇溶液脱 汞5min，乙醇浓度为70％，经自来水洗 后，以2.5%硫代硫到钠浸洗1min，水洗)；
(2)0.3% H2O2甲醇液浸泡切片30min,自来 水洗，蒸馏水洗,入PBS(0.01mol/L
pH7.2);
投资银行理论与实务
技术类型有直接法和间接法之分。前 者特异、快速，后者敏感、多用。
所用抗体试剂可为异种动物抗体，也 可为同种动物抗体。
异种动物抗体常混合应用，操作步骤 少，脱片率相对较低。
武汉理工大学经济学院 曾玲玲
投资银行理论与实务
同种动物抗体多分别应用，操作步骤 加倍，脱片机率相对较高，前后重免疫荧 光标记交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或 多聚甲醛蒸气处理。
双重染色
一、[实验诊断综合]免疫组化双重染色方法和步骤在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。
此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合；同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照)；两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体．用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色)；不同种属来源的抗体双重染色。
目前，最常用的是最后一种方法。
不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应．特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。
但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。
在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。
即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。
该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。
SP法双重染色步骤1～6步骤与SABC法相同，但无需使用生物素阻断剂：7．切片加入A特异性抗体(如兔抗A抗体)，4=C过夜孵育后，PBS冲洗3次，每次5分钟8.滴加生物素化二抗(如抗兔二抗)，室温孵育切片10分钟，继而PBS冲洗3次，每次5分钟；9.滴加链霉菌抗生物素蛋白—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟10．碱性磷酸酶显色液(BCIP／NBT)显色(紫蓝色)．PBS冲洗3次，每次5分钟；11．滴加0．05％盐酸，室温10分钟(可避免已显色的抗原褪色)；12．滴加抗小鼠二抗同种属的非免疫血清，37~C孵育10分钟；13．滴加B特异性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育。
免疫组化4--双重或多重标记
一、基本原理
双重或多重标记是利用免疫学和细胞化学 原理，在同一张切片上原位示踪组织或细胞 内不同抗原大分子物质的一项标记染色技术。
示踪剂：---荧光素
---酶 ---胶体金等
操作的原则和要求基本上与单标免疫组化
方法雷同
优点：不同抗原成分位置、功能关系更直观 缺点：流程长
脱片机率更高 前后重染色试剂间有交叉干扰
(5)PBS液，5min×3
(6)加二抗(GARG＋GAMG混合液1:200)， 温盒，37℃，30min； (7)PBS洗，5min×3; (8)加酶抗酶抗体复合物(兔PAP＋鼠APAAP 混合液1:100)，湿盒，37℃，30min； (9)PBS洗，5min×3；
(10)过氧化物酶显色反应：以DAB- H2O2 液显色 7～10min(镜下控制显色程度)， PBS洗，5min×3； (11)硷性磷酸酶显色反应：以萘酚AS.MX 及坚固蓝(fast blue)显色10～15min(镜下控
；
4.保证试剂的清洁度与纯度(双蒸水，亲和
免疫层析)，注意增强组织片与载玻片的粘
合 度 ， 以 减 少 脱 片 机 率 ；
5. 封片剂选择应注意显色剂的溶解特性，
一般多采用水封片(10%缓冲甘油)，保存时
间不长，应及时观察记录。
直接法、间接法、桥法均可使用
灵敏度以桥法中的复合物法最高 特异性则以直接法最佳
操作方法类同单酶标记，有直接法、
间接法、复合物法之分。
间接法与复合物法较常采用。 ★操作举例 淋巴瘤轻链κ、λ的双重 酶标记（双酶双底物）
Hale Waihona Puke (1)石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固定
液固定的组织则需用0.5%碘的乙醇溶液脱
双重或多重免疫组化标记(共42张PPT)
4)洗，10min×3，(第一重ACTH-TRITC标记染色已完成)。 （二）双重或多重免疫酶标记染色 (15)荧光显微镜下分别以546nm及490nm波长的激发光观察切片组织内TRITC及FITC所标示的ACTH及GH抗原（TRITC阳性细胞呈红色，FITC
(16)用彩色底片对切片同一部位用546nm及 490nm波长激发光分别作两次曝光，即可在 同一张照片上显示不同颜色标示的ACTH与 GH两种抗原。
TRITC-GAM IgG
游离Fab
T
鼠抗人ACTH （IgG）
ACTH抗原
TITC-GAM IgG
GH抗原
F
Fab被灭活
T
T
鼠抗人GH （IgG）
图1 同种动物抗体间接法（分步固定）双重免疫荧光荧色原理
T F
（二）双重或多重免疫酶标记染色
以酶催化不同底物呈现不同颜色产物标示 同一切片内两种或两种以上抗原为理论基础所 建立起来的多重免疫标记染色方法。特点是光 镜下可以同时观察和对比，样品保存时间相对 较长，一次曝光即可成像，故较双重免疫荧光 染色法更为常用。
(7)蒸馏水浸洗后，空气中干燥；
(8)置盛有多聚甲醛粉末的密闭容器内， 80℃温箱中以多聚甲醛蒸气处理1h，冷却取 出，入蒸馏水，换洗2次。
(9)再按(4)----(8)步骤作第二重抗原染色， 这次一抗用鼠抗GH单克隆抗体(1:400)；二抗 用15nm胶体金标记的羊抗鼠IgG，在二抗孵 育并清洗后，入2％的戊二醛及3％多聚甲醛 的TBS (pH7.4)溶液中固定30min，经蒸馏水 换洗3次，再以1％醋酸铀和构橼酸铅作常规 电子密度的染色。
(3)加入1％HSA 5min；不洗；
双重或多重免疫组化标记PPT演示文稿
(12)缓冲甘油封片，光镜下观察
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兔PAP
P
PP
A
A 鼠APAAP A
GAR IgG
GAM. IgG
兔抗K
鼠抗人
Ag
κ
λ
图2 双酶双底物(复合物法)双重酶标染色原理 27
（直接法、间接法、桥法均可使用，灵敏度 以桥法中的复合物法最高，特异性则以直接 法最佳）
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操作方法类同单酶标记，有直接法、 间接法、复合物法之分。
间接法与复合物法较常采用。 ★操作举例 淋巴瘤轻链κ、λ的双重 酶标记（双酶双底物）
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(1)石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固定 液固定的组织则需用0.5%碘的乙醇溶液脱 汞5min，乙醇浓度为70％，经自来水洗后， 以2.5%硫代硫到钠浸洗1min，水洗)；
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(10)电镜观察 结果：见ACTH细胞和GH细胞的分泌
颗粒分别被5nm和15nm的胶体金颗粒所显 示，除很少量背景染色外，标记位置精确， 无交叉重叠与弥散现象。
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（四）其它双重标记法 1.免疫荧光法与免疫酶法联合应用(先酶标
后荧光) ； 2.免疫荧光法与免疫金银法联合应用(先免 疫金银标记后荧光标记) ； 3.免疫酶法与免疫金法联合应用(20nm,红
色），此法忌用银液放大，易吸附干扰； 4.免疫金银法与免疫酶法联合应用(对比明
显)。
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三、注意事项
1.标记染色的顺序确定需视组织标记抗原 的性质，量少、脆弱先标记，量多、耐受
后
标
记
。
2.结构保存与抗原保护并重，电镜样品一 般忌用饿酸后固定，PG固定液中的戊二醛 (G)浓度不宜超过2％，光镜样品的固定剂 类型和固定时间的选择也应如此；
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大鼠垂体前叶GnRH相关肽阳性细胞(左, 蓝色)与促性腺激素细胞 (右, 棕色)为同一种细胞, 免疫酶(PAP法)双重染色.
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B. 双酶法: 1. 原理: a. 用两种无关的酶分别标记显示两种抗原, 常用的酶为 HRP和AKP, 或HRP和葡萄糖氧化酶. b. 两种一抗来源于不同种属的动物, 如兔和小鼠, 或同种动 物(如小鼠)的两种单克隆抗体, 但其Ig亚类不同, 如IgGl和 IgG2a. c. 两种二抗分别是抗兔IgG和抗小鼠IgG, 或抗小鼠IgGl和抗 小鼠IgG2a. 可以来自同种属动物或不同种属动物, 可以是 酶标抗体(一个用HRP, 另一个用AKP标记), 也可以是未标记 抗体(一个用兔PAP, 另一个用小鼠APAAP).
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五. 免疫酶-免疫金(银)双重染色法: A. 免疫酶-免疫金双重染色法: 1. 用PAP法显示第一种抗原, 为了加强与胶体金的红色 的对比, 用CN显色(蓝色), 如该抗原存在于神经, 则用 DAB显色. 2. 用酸洗法洗脱第一次染色的抗体复合物, 继之用IGS 法显示第二种抗原, 在光镜下监视染色, 直到出现满意 的红色为止. 3. 用PAP法后再用IGS法, 可防止标记在二抗的胶体金颗 粒与抗体一起洗脱掉. 金标抗体穿透组织能力差, 常需 用较大的一抗和金标抗体浓度并提高其穿透力.
免疫荧光双重染色法: FITC绿色, TRIT. 间接法: 1. 两种一抗不标记, 但来自 不同种属的动物如兔和豚鼠. 2. 两种来源于同种动物或不 同种动物的二抗(如羊抗兔 IgG和羊抗豚鼠IgG, 或羊抗 兔IgG和猪抗豚鼠IgG)分别以FITC和TRITC标记. 3. 染色程序: a. 先用第一种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片, 显示第 一种抗原; 然后再用第二种一抗和相应的标记二抗依次孵育 切片, 显示第二种抗原. b. 将两种一抗混合后孵育切片, 再将两种标记的二抗混合后 孵育切片, 最后用荧光显微镜观察.
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5. 染色步骤: 以先后使用PAP法和APAAP法为例. a. 切片处理, 抑制内源性酶及正常血清封闭如前. b. 两种一抗混合液(各自稀释度由单染色决定), 室温30分或 4℃过夜. TBS洗两次, 每次5~10分. c. 两种二抗混合液(各自稀释度由单染色决定), 室温30分. TBS洗同上. d. PAP和APAAP混合液(各自稀释度由单染色决定), 室温30 分. TBS洗同上. e. 显示HRP, 如用0.05%DAB-0.01%H2O2, 镜下控制染色. TBS洗 同上. f. 显示AKP, 如用萘酚AS-MX磷酸盐加固蓝BB, 镜下控制染色. TBS洗同上. g. 甘油胶封片.
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免疫荧光双重染色法: FITC绿色, TRITC红色, 混合色为黄色.
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Y.W Lin. USP26 stained by Alexa Fluor 488 and Myc stained by Alexa Fluor 594 in COS7 cells. Nuclei were stained by Hoechst blue
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B. 免疫酶-免疫金银双重染色法: 1. 用IGSS法显示第一种抗原, 用5nm小颗粒胶体金标记二抗. 应用物理显影液进行银加强后, 在金颗粒周围形成金属银 壳, 不但增强了金颗粒的可见度, 而且封闭了第一次染色的 各级抗体, 从而避免了第二次染色试剂发生交叉反应. 因银 壳可能覆盖第二种抗原, 该法只适用于两种抗原存在于不 同组织结构. 2. 缓冲液彻底清洗后, 再用免疫酶法(如PAP或ABC法等)显 示第二种抗原. IGSS法所得黑色可与免疫酶法所得棕色, 蓝 色等形成显明对比.
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c. 可避免抗体残留而引起的假性双标记, 不需中间洗脱处理. 由 于无交叉反应, 可将两重染色的同一层抗体混合同时使用并先 后显示两种酶的活性, 在同一张切片上获得不同颜色的反应终 产物, 如棕色和蓝色. 如两种抗原共存于同一个细胞, 则出现灰 紫色的混合色.
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2. 染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色, 以决定 合适的抗体稀释度和反应条件等. 3. 双重染色的先后次序: 先显示HRP, 再显示AKP或葡萄糖 氧化酶. 4. 对照试验: a. 单染对照. b. 必需排除两套抗体系统之间的交叉反应. 如第二种羊抗 兔IgG二抗可能与第一种小鼠IgG一抗结合而出现假性双 标记, 因此应事先做抗体进行交叉染色实验.
第一次用ABC法, 氧化法洗脱抗 体. 对照试验证实此为假性双标.
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6. 具体操作步骤: a. 方法1: 第一次染色后, 除去抗体和酶而使有色反应终产 物留在抗原部位, 再用同样方法进行第二次染色. *. 切片处理, 抑制内源性酶及正常血清封闭同前. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2显色. TBS洗两次, 每 次5~10分. *. 氧化法洗脱. TBS洗如上. *. 用PAP法完成第二次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2显色. TBS 洗如上. 甘油胶封片.
第八章. 免疫组化双重染色技术 (Double staining technology in immunohistochemistry)
用免疫组化方法在同一张组织切片上同时显示两种或两 种以上的抗原, 以发现其定位, 形态和功能上的相互关系. 一. 连续切片双重染色法 A. 最简单最可靠. 用同样的免疫组化方法, 在两张相邻切 片上各显示一种抗原, 然后比较. 由于每张切片上只进行 一次染色, 所以不会互相干扰或出现假性双标记. B. 切片厚度1~3m. 如果较厚如神经组织切片(10~20m), 可以采用“镜像”法, 即相邻切片翻转后贴在载玻片上, 或利用软件PS.
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一抗来自同种动物的单酶法免疫酶双重染色
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大鼠垂体前叶促性腺激素细胞(蓝色)和生长激素细胞(棕色), 免疫 酶(PAP法)双重染色.
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b. 方法2: 第一次染色后, 照相记录结果并记住照相视野的部 位. 用有机溶剂将反应终产物溶解除去, 并将第一次染色形成 的抗体复合物洗脱掉, 然后进行第二次染色. 对同一部位再一 次照相, 比较先后照相所得照片. *. 切片处理同上. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2显色. TBS洗两次, 每次 5~10分. *. 以TBS封片, 照相(注意随时从盖片边缘补加TBS, 防止切片 干燥). *. 去盖片, TBS洗, 再用酒精-二甲苯-酒精处理, 除去CN蓝色反 应产物, DDH2O洗. *. 氧化法洗脱, 然后TBS洗两次如前. *. PAP法完成第2次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2或CN-H2O2显色. *. TBS洗同上, 封片. *. 找出第一次照相的部位, 再次照相.
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5. 抗体洗脱: a. 酸洗法: pH2.2甘氨酸-HCl缓冲 液(可加入适量二甲基甲酰胺, DMF)1~4小时使抗原-抗体复合物 解离. b. 氧化法: 2.5% KMnO4: 5% H2SO4: DDH2O=1:4:10~260, 1分, 氧化除去 抗体, 0.5% Na2S2O5漂白液脱色. 第一次染色用CN显色, 并注意对 第二种抗原的影响. c. 甲醛蒸气法: 1升容器+3g多聚 甲醛+切片, 置80℃烤箱1~4小时, 蒸汽破坏抗体的Ig结合部位.
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3. 观察: 同一个视野里. a. 对每一种荧光标记物(绿色或红色)使用不同的滤色板进行 观察和照相, 每张照片显示一种荧光, 比较两张照片. b. 两种荧光重叠照相, 则在一张照片上可发现分别含不同抗 原的细胞(呈绿色或红色), 如果两种抗原存在于同一个细胞 或结构, 则呈现两种红绿荧光的混合色, 如黄色.
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二. 免疫荧光双重染色法: 用不同的荧光色素标记不同的抗 体, 染色后观察, 相应的抗原物质显示不同的颜色. A. 直接法: 1. 一步法: 将FITC (490~495→520~530nm, 黄绿色荧光)和TRITC (550→620nm, 红色荧光)分别标记的两种抗体按一定比例混 合, 使每个抗体均为最适稀释度, 然后孵育切片. 2. 二步法: 先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片.
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抗体, 酶和反应产物洗脱
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2. 染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色, 以决定合适的 抗体稀释度和反应条件等. 3. 双重染色的先后次序: a. 先显示含量较少的抗原. b. 先显示容易受染色过程和洗脱过程影响的组织抗原. c. 先用不太敏感的抗体. d. 先用DAB显色. 4. 对照试验: a. 单染对照. b. 在进行第二次染色前, 要证明第一次染色的各级抗体和酶活 性被完全除去, 而且洗脱后对第二个待检抗原无影响.
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6. 注意事项: a. 过厚切片(>7m)可能出现混合色(双标记)的假象. b. APAAP法中缓冲液用TBS而不用PBS, 或至少在显示酶 活性的一步中用TBS. c. 内源性AKP一般不会引起问题. d. 正常血清封闭用两种二抗来源动物的正常血清. 四. 免疫酶-免疫荧光双重染色法: 首先用免疫酶法显示 第一种抗原, 然后用间接免疫荧光法定位第二种抗原. 若 两个一抗来自同一动物, 需要注意可能发生的交叉反应.
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三. 免疫酶双重染色 A. 单酶法: 1. 原理: a. 用一种酶如 HRP标记显示两种不同的抗原, 但用不同 的电子供体如 DAB和CN呈现不同颜色的反应终产物. b. 两种一抗来自同种属动物, 两重染色之间需将第一次 染色反应中的各级抗体和酶或各级抗体, 酶和反应产物 从组织上洗脱. c. 连续做两次染色, 所费时间较长.