《病理学》免疫组化讲课-原理及方法
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4 度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
免疫组化的原理和操作PPT讲稿
（三） 组织的脱水、浸蜡、包埋和切片
前三步只用于石蜡切片，冰冻切片和振动切片不需此 步骤。
切片可分为： 石蜡切片：脱水、透明、浸蜡、包埋、切片5~7μm； 冰冻切片：浸糖，20%~30%蔗糖4oC过夜，减少冰
晶；OCT包埋；液氮速冻，减轻组织破 坏。病理切片要薄，5~7 μm；脑片通 常 30~50 μm厚。 振动切片：不需做任何包埋，固定后的组织可直接
⑤ 其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）
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（四）IHC的应用
1. 只要是形态科学均可采用:包括病理学、神经科学、生物学、
病原微生物的检测（病毒、细菌、寄生虫等）、皮肤病学、 器官移植等。
2. 可用于多种材料：A.各种组织（冰冻组织、formalin固定
（离体、液相），而不能定位的缺点。IHC则可在原位和固
相对染色结果进行观察。目前IHC的定位可精确到亚微结 构水平。
随着IHC技术的发展和图象分析技术的发展，IHC 已进入多标记（双标记）和定量研究的阶段，使IHC
在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不仅用于研究，也
用于诊断。IHC与核酸分子杂交相结合形成的原位杂交技术 （in situ hybridization，ISH）既特异性强、灵敏，又 具定位、可视的特点。
用振动切片机做各种厚度的切片，并在 染色后可进一步制作电镜标本观察。
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（四）防脱片剂
（1） 蛋白甘油，蛋清与甘油1：1搅拌、 过滤、防腐；
（2）1%的铬矾明胶涂片； （3）0.1%的多聚赖氨酸涂片，晾干备 用。配制时用塑料
瓶而不能用玻璃瓶； （4） 购买商品化的进口硅化玻片； 当前你正在浏览到的事第十五页PPTT，共三十八页。
免疫组化的原理及操作规程
免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。
该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。
本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。
一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。
在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。
免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。
直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。
间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。
间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。
二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。
固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。
2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。
常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。
具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。
3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。
高级病理学：免疫组化技术原理与应用
乳腺良性肿瘤肌上皮完整， Actin＋ 乳腺癌浸润性，缺乏肌上皮， Actin－ 晚期乳腺癌，肌上皮萎缩或完全破坏消失
（三）神经源性肿瘤标记物
１、胶质纤维酸性蛋白（ Glial fibrillary acide protein ，GFAP）
Eng在1971年首先从人脑胶质细胞中分离出 来的一种酸性蛋白
①植物凝集素与糖 ②葡萄球菌A蛋白与IgG ③生物素Biotin与卵白素Avidin ④受体与配体 ⑤阴阳离子
ABC法(Avidin biotin-peroxidase complex)
染色原理与流程：
ABC：①Biotin+HRP Biotin-HRP
②1分子Avidin+3分子Biotin-HRP
２、与肿瘤生长相关的抗原 ①肿瘤胚胎抗原 ②肿瘤相关抗原 ③细胞机能抗原 ④某些酶与激素 ⑤病毒基因
其中，在肿瘤鉴别诊断中，具有代 表性的是５种中间丝蛋白：
①上皮细胞的角蛋白（Keratin） ②间胚叶细胞的波纹蛋白（Vimentin） ③肌细胞的结蛋白（Desmin） ④神经元的神经细丝
⑤神经胶质细胞的胶质细丝酸性蛋白
或4%胃蛋白酶消化30-60min，37°C 4，PBS 3X3min 5，0.3%H2O2甲醇液，室温10-30min 6，5%-10%正常血清，室温20 min 7，不洗，滴加适当浓度的特异性抗体，
如1：100的McAbDesmin，37°C60min，或4°C过夜 8，PBS 3X3min 9，生物素化羊抗鼠二抗，1：200，37°C，40min 10，PBS 3X3min 11，ABC1：100-1：150，37°C，40-50min
《免疫组化技术》课件
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末
免疫组化PPT课件
E-cad + in membrane
Esophageal carcinoma
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免疫细胞化学阳性结果定位分布
2. 细胞浆阳性：
GFAP+ in cytoplasm of neuroglia cell.
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免疫细胞化学阳性结果定位分布
3.细胞核阳性
C-fos+ in nucleus
特点: ⑴ 敏感性高，（比ＰＡＰ高８～４０倍）； ⑵ 背景淡，链霉亲和素更好； ⑶ 方法较简便，时间较短； ⑷ 应用范围广，也可用于原位杂交和免疫电镜。
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。
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免疫组化阳性结果色度
弱阳性： 淡黄色 中等阳性： 棕黄色 强阳性： 棕黑色 取决于：抗原量 分布密度 方法灵敏度
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免疫细胞化学阳性结果定位分布
肌上皮瘤。
⑴ 结蛋白（Desmin），最常用，肌细胞分化最早的标记； ⑵ 肌动蛋白（Actin），属肌丝蛋白，６种亚型分别存在于不同
的肌细胞、肌上皮细胞 ⑶ 肌球蛋白（Myosin），属肌丝蛋白，分Ⅰ型（慢）和Ⅱ型
（快）收缩纤维，存在于心肌、横纹肌及平滑肌中，肌动蛋白 和肌球蛋白均出现在肌细胞发育分化中期。 ⑷ 肌红蛋白（Myoglobin），是心肌和横纹肌结合氧的肌红蛋白， 存在于分化成熟的横纹肌中。
既 过 氧 化 物 酶 抗 过 氧 化 物 酶 复 合 物 法 (Perixidase Antiperoxidase Complex Method,PAP) 先将过氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗 ＨＲＰ；然后再与ＨＲＰ结合，形成一个稳定的多角形结 构（PAP）。 特点：⑴ 敏感性较高；
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
免疫组化技术课件课件精选课件
色
色
阳性细胞的染色特征：
①阳性细胞的染色分布有三种： 胞浆；细胞核；细胞膜表面
②阳性细胞分布：灶性；弥漫性
③染色强度不一
④切片边缘，刀痕or组织折叠，坏死，挤压区， 胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。
对于阳性结果的定量判断： -，+，++，+++等分级和计数统计
第二十六页，本课件共有45页
第三十七页，本课件共有45页
免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则： ①免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断，必须以HE染色的
形态学为基础，免疫组化只能作为辅助手段。不能把 免疫组化染色作为诊断的“金标准”。
②免疫组化对良、恶性的判断仅供参考。
③免疫组化用于判断组织起源，分型，预后的估计。
④免疫组化染色不好或出现相互矛盾的结果时，以形态学为 准。
第四页，本课件共有45页
显示物： ➢酶标反应：
①碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase,AP）
AP与不同的底物（萘酚As-Mx、快蓝、快红）作用， 可形成不同颜色的终产物。用新品红（New fuchsine） 显色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。
②辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase,) HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕色 沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。
前列腺特异性抗原（PSA）： 甲胎蛋白（AFP）：
甲状腺球蛋白（Tg）：
第三十页，本课件共有45页
软组织标记
软组织：全身各处的纤维结缔组织，脂肪组织，
肌肉组织，滑膜组织及血管淋巴组织。
肌动蛋白（Actin）：分布于所有的肌型细胞中
肌红蛋白（Myoglobin）：是骨骼肌肌浆中的一种
免疫组化的原理和步骤
免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的有哪些？免疫组化实验中常用的抗体为单抗体和多抗体。
单抗体是一个B淋巴细胞分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。
多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体交叉反应的原因：指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。
产生的原因有以下几个方面：1. 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。
免疫组化原理和步骤(精)
免疫组化原理及步骤免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜 (包括荧光显微镜、电子显微镜的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质 (如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 :9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至 1000 ml;1000 ml 0.2M PB (pH 7.4=5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O+58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或=190 ml A + 810 ml B(A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O:15.6 g in 500 ml ddH 2 O; B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O:71.632 g in1000 ml dH 2 O。
2. Citrate Buffered Saline(0.01 M 柠檬酸缓冲液, PH6.0:28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O(A.Citrate acid (柠檬酸 :10.5 g 加双蒸水至 1000 ml ; B.Citrate sodium(柠檬酸钠:29.41 g 加双蒸水至 1000 ml。
3. 细胞通透液:由终浓度分别为 0.3%双氧水和 0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS, 再接着加 120 ul TritonX-100,并加热一儿,冷却至临用前加 0.4 ml30%H 2 O 2 。
免疫组化实验方法ppt课件
适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐 （6）温度和时间：较高的反应温度（37℃）可加速抗原抗体结合反应，
低温有利于抗原抗体结合率的提高 （7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。
选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇
免疫组化实验标本
• 组织标本（石蜡切片和冰冻切片）
• 细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂 片）。
• 石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连 续切片，有利于各种染色对照观察；还能 长期存档；
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火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
（4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4℃ 冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30％。
（5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景 非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验 摸索，找出最佳稀释度。
（6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻 融次数。
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火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚 甲醛混合使用。
（3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分 子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使 用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
3．常用的固定方法--浸入法和灌注法（适用于动物实验研究）
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火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
免疫组化原理及步骤
免疫组化原理及步骤免疫组化是一种常用于研究细胞和组织中蛋白质的定位、表达及定量的方法。
其原理基于抗原与抗体之间的特异性结合。
在进行免疫组化实验时，通常需经历如下步骤：1. 取样与制片：从待研究的组织或细胞中取得样本，并将其固定在载玻片或切片上，以便后续的实验处理。
2. 抗原恢复：某些样本经过固定处理后，可能会造成抗原的损失或掩盖。
因此，为了使抗原能更好地被抗体识别，常需要进行抗原恢复的步骤。
一般而言，常用的抗原恢复方法包括加热处理、酶解或化学处理等。
3. 阻断非特异性结合：为了避免非特异性的结合，需使用一些非特异性抗体或蛋白质（如牛血清白蛋白、胶原蛋白等）来阻断待测抗体结合样本中的非特异性位点。
4. 抗体标记与孵育：选择特异性与待测抗原结合的一抗体，并将其标记上可视化信号或发光染料等。
在将该标记抗体和样本一同孵育的过程中，待测抗原会与一抗体发生特异性结合。
5. 洗涤：通过洗涤步骤，去除与抗体无关的非特异性结合物，以减少背景信号的干扰。
6. 可视化和显色：对于免疫组化实验，最终需要将特异性结合的抗原或抗体定位，并使其可视化。
这可以通过结合染色剂、酶标记或荧光标记等方法实现。
7. 评价与分析：最后，通过显微镜观察和图像分析等手段，对标记结果进行定性或定量的评价与分析。
可以使用计算机软件进行图像处理和定量分析以获取更准确的数据。
总之，免疫组化的原理在于利用抗原与抗体的特异性结合来对蛋白质进行检测与定位。
在实验过程中，需要进行样本取样与制片、抗原恢复、非特异性结合阻断、抗体标记与孵育、洗涤、可视化和显色、评价与分析等一系列步骤。
这些步骤均为确保实验结果的准确性和可靠性所必需的。
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多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一 抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用 至关重要。
多克隆抗体与单克隆抗体及其产生
单克隆抗体的产生
应用细胞融合的杂交瘤技术 （Hybridization），以针对单 一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨 髓瘤细胞（肿瘤性B细胞）融 合形成杂交瘤，其特点是既能 产生特异性抗体，又能在体外 无限地增殖。将瘤细胞在体外 培养或注入小鼠腹腔内而获单 克隆抗体，由此产生的小鼠抗 人（抗原）的抗体常以MaH表 示，现在亦有兔的单克隆抗体
市售抗体的种类
某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如 角蛋白，一些抗原只有多克隆抗体，如α-胰蛋 白酶
有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原 之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检 测。如Desmin来源于鸡的肌肉
近年来,市售单克隆抗体除小鼠源性外，还有兔 源性
标记抗体
在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使 抗原抗体的结合能用肉眼观察到
三抗是以过氧化物酶为抗 原，在与一抗同种动物身 上诱发产生的抗体，并与 辣根过氧化物酶形成复合 物（PAP）
PAP法
（Peroxidase-AntiPeroxidase，过氧化酶-抗过氧化酶法）
优点：
PAP复合物中含酶更多，且是一种非标记的免 疫组化方法，敏感性更高
PAP复合物常来自两种不同的动物（鼠、兔）， 鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色，兔PAP多 用于一抗为多克隆抗体的染色
一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和 素+酶标生物素）
优点：
亲和素和生物素有强大亲和力，使其比直 接和间接酶标法更敏感，也超过PAP法。
能用于常规石蜡切片。
亲和素—生物素复合物 （ Avidin-Biotin Complex ABC ）
亲和素有四个生物素分子特异 性结合部位，其结合力强，不 可逆，还可和辣根过氧化酶或 荧光素等结合
标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明 酶：辣根过氧化酶，硷性磷酸酶 金属离子：胶体金颗粒
标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记 物的活性，从而使染色敏感性降低
酶 — 抗酶抗体复合物
通过免疫反应而不是化 学方法，将酶结合到抗 体上，形成具酶活性的 免疫复合物。如PAP复 合物（Peroxidase
抗体 与抗原能特异性结合—生物学结合是免疫球蛋 白Ig
免疫球蛋白的化学结构及其模式图
免疫球蛋白根据重链结构命名 IgG(γ), IgA(α)，IgD(δ), IgE(ε), IgM(μ)
五种免疫球蛋白只有两种类 型的轻连，即：
Kappa(κ)和Lambda(λ)
每个抗体分子的轻链必须相同； 某一单独的抗体分子 决不可能既 有κ链又有λ链。这一点在免疫组 化的淋巴瘤诊断中十分重要。
AB复合物多用于ABC法的免疫 组化中
酶标亲和素（Labelled streptavidin）
在AB复合物中，酶是 标记在生物素上，而 后与亲和素合成复合 物。在标记的亲和素生物素方法中是将辣 根过氧化酶直接标记 在亲和素上，辣根过 氧化酶与亲和素间有 极强的结合力，因此 LSAB法比ABC法更敏 感
识别系统
特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。特异性 抗体具有识别并结合靶抗原的功能，这是本技术 的理论依据所在
特异性抗体品种繁多，应根据待检测抗原的要求 选用
特异性抗体有的属单抗，有的属多抗，有的既有 单抗又有多抗，可根据不同染色要求而选用
识别系统的组成比较恒定，识别功能由特异的第 一抗完成
免 疫 小 鼠
Mouse
抗原的制备：
传统用蛋白提纯
近来可应用分子生物学技术：已知抗原的基因 结构，用其合成多肽，作为抗原，如ER、PR抗 原的制备
现有兔的单抗
多克隆抗体和多克隆抗体的选用
单克隆抗体的制备比多克隆抗体复杂，价格 更贵；在应用中不一定比多克隆抗体好。
单克隆抗体的特异性强，多克隆抗体则敏感 性高，为何使用完全决定于使用的目的性
空间结构特殊，不易与高荷电 的组织成分（胶原纤维、结缔 组织）联结
酶标亲和素（Labelled streptavidin）
在AB复合物中，酶是 标记在生物素上，而 后与亲和素合成复合 物。在标记的亲和素生物素方法中是将辣 根过氧化酶直接标记 在亲和素上，辣根过 氧化酶与亲和素间有 极强的结合力，因此 LSAB法比ABC法更敏 感
SP
Substrate-chromogen solution
Ensyme-conjugated Streptavidin Biotinylated Secondary Antibody Primary Antibody
ABC与LSAB(SP)法的比较
一步法（EPOS）及两步法（Envision）
EPOS一步法
Substrate-chromogen solution
EnVision二步法
AntiPeroxidase
Complex），PAP复合 物属非标记性，保护了 酶的活性，比免疫荧光 法敏感上千倍。
亲和素—生物素复合物 （ Avidin-Biotin Complex ABC ）
亲和素有四个生物素分子特异 性结合部位，其结合力强，不 可逆，还可和辣根过氧化酶或 荧光素等结合
亲和素-生物素复合物是一个三 维空间的结构，它利用亲和素 为中介，一端通过生物素化的 抗体联接第一抗体，另一端通 过生物素化酶与显色系统相连 接，产生多级放大，从而提高 此生物反应的敏感性和特异性
显示系统
也是显色系统。抗体抗原的结合是肉眼看不见的， 显示系统的目的就是使这种看不见的反应变为看 得见，从而确定抗原的存在及其定位
显色系统由酶、底物加上显色剂组成，最终可在 标记位点形成有色分子的终末产物，若显色剂为 DAB，则出现棕褐色细颗粒沉淀
E(酶)+S(底物)
E·S(酶底物复合物) 循环使用
tissue antigen
dextran backbone primary antibody enzyme molecule
二步法：EnVision
葡萄球菌蛋白A （Staphylococcal protein A, SPA）
二、免疫过氧化物酶染色技术的基本 原理
免疫过氧化酶染色技术的基本原理
免疫球蛋白的化学结构及其模式图
Fc
Fab Ag
Fc(Fragment crystalline)
是免疫球蛋白的羧基端，意为 结晶片段，因其纯化时呈结晶 状态而名之，该片段与抗原特 异性有关
Fab(Fragment antigen bingding)
该端是抗体与抗原特异性结合 的部位，每分子Ig能结合2个抗 原分子
特点
以多聚体为载体，联结了酶和一抗（一步法） 或二抗的Fab段和酶（二步法）
优点
操作简便，省时 提高了敏感性和特异性 减少了背景着色 避免内源性生物素的干扰
多聚物载体
一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKO EPOS及DAKO Envision试剂
核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分 子，起到载体的作用
其目的都是设法提高免疫组化染色的敏感性
联结系统
联结或桥联抗体（一般为第二抗体） 按免疫学要求将识别系统与显色系统联结成为统
一体 应采用何种联结抗体决定于特异性第一抗体是多
克隆还是单克隆： 若一抗是多克隆抗体，则二抗是羊或其它动物
的抗兔血清； 若一抗是单克隆抗体，则二抗常是兔抗鼠的血
清 有的联结抗体既能联结多抗，亦能联结单抗
三、免疫组化染色方法的类别
免疫组化染色方法的类别
直接法 间接法 PAP法 ABC法 LSAB法 一步法（EPOS） 两步法（Envision）
直接法
将荧光、酶、金直接标记 在一抗上进行显色，没有 联结系统、未用桥抗体。
ABC
ABC 二抗
一抗
DAB
ABC与PAP 法的比较
LSAB（SP）法
（labelled streptavidin biotin method）标记 的链霉亲和素-生物素法
特点：将HRP直接标记于链 霉亲和素上
优点：
更快速：空间结构更小 更敏感：链霉亲和素的亲和性
更强，更易于到达深部位点 非特异背景更少：链霉亲和素
P(反应产物) + E(酶)
显示系统
辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程:
HRP + HRP
H2O2
HRP·H2O2
DAB（电子供体）
有色分子终末产物 +
HRP：酶 H2O2：底物
HRP·H2O2：酶·底物复合物
显示系统
免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的 不同点在于显色系统的差异：
间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 PAP法： 利用PAP复合物 ABC法： 利用AB复合物 LSAB法: 利用直接标记于亲和素的酶 EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体
亲和素-生物素复合物是一个三 维空间的结构，它利用亲和素 为中介，一端通过生物素化的 抗体联接第一抗体，另一端通 过生物素化酶与显色系统相连 接，产生多级放大，从而提高 此生物反应的敏感性和特异性
AB复合物多用于ABC法的免疫 组化中
ABC法
（Avidin-Biotin Complex，亲和素-生物素法）
免疫组织化学技术的原理及 方法
免疫组织化学技术的原理及其方法
一. 基本知识 二. 基本原理 三. 方法 四. 结果的判断及异常着色原因分析和对策
一、免疫组化技术的基本知识