《病理学》免疫组化讲课-原理及方法
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一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗 和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种 能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物
一步法：EPOS
tissue antigen
dextran backbone primary antibody enzyme molecule
二步法：EnVision
一步法（EPOS）及两步法（Envision）比较
其目的都是设法提高免疫组化染色的敏感性
联结系统
联结或桥联抗体（一般为第二抗体） 按免疫学要求将识别系统与显色系统联结成为统
一体 应采用何种联结抗体决定于特异性第一抗体是多
克隆还是单克隆： 若一抗是多克隆抗体，则二抗是羊或其它动物
的抗兔血清； 若一抗是单克隆抗体，则二抗常是兔抗鼠的血
空间结构特殊，不易与高荷电 的组织成分（胶原纤维、结缔 组织）联结
酶标亲和素（Labelled streptavidin）
在AB复合物中，酶是 标记在生物素上，而 后与亲和素合成复合 物。在标记的亲和素生物素方法中是将辣 根过氧化酶直接标记 在亲和素上，辣根过 氧化酶与亲和素间有 极强的结合力，因此 LSAB法比ABC法更敏 感
EPOS一步法
Substrate-chromogen solution
EnVision二步法
一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和 素+酶标生物素）
优点：
亲和素和生物素有强大亲和力，使其比直 接和间接酶标法更敏感，也超过PAP法。
能用于常规石蜡切片。
亲和素—生物素复合物 （ Avidin-Biotin Complex ABC ）
亲和素有四个生物素分子特异 性结合部位，其结合力强，不 可逆，还可和辣根过氧化酶或 荧光素等结合
识别系统
特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。特异性 抗体具有识别并结合靶抗原的功能，这是本技术 的理论依据所在
特异性抗体品种繁多，应根据待检测抗原的要求 选用
特异性抗体有的属单抗，有的属多抗，有的既有 单抗又有多抗，可根据不同染色要求而选用
识别系统的组成比较恒定，识别功能由特异的第 一抗完成
AntiPeroxidase
Complex），PAP复合 物属非标记性，保护了 酶的活性，比免疫荧光 法敏感上千倍。
亲和素—生物素复合物 （ Avidin-Biotin Complex ABC ）
亲和素有四个生物素分子特异 性结合部位，其结合力强，不 可逆，还可和辣根过氧化酶或 荧光素等结合
亲和素-生物素复合物是一个三 维空间的结构，它利用亲和素 为中介，一端通过生物素化的 抗体联接第一抗体，另一端通 过生物素化酶与显色系统相连 接，产生多级放大，从而提高 此生物反应的敏感性和特异性
显示系统
也是显色系统。抗体抗原的结合是肉眼看不见的， 显示系统的目的就是使这种看不见的反应变为看 得见，从而确定抗原的存在及其定位
显色系统由酶、底物加上显色剂组成，最终可在 标记位点形成有色分子的终末产物，若显色剂为 DAB，则出现棕褐色细颗粒沉淀
E(酶)+S(底物)
E·S(酶底物复合物) 循环使用
市售抗体的种类
某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如 角蛋白，一些抗原只有多克隆抗体，如α-胰蛋 白酶
有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原 之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检 测。如Desmin来源于鸡的肌肉
近年来,市售单克隆抗体除小鼠源性外，还有兔 源性
标记抗体
在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使 抗原抗体的结合能用肉眼观察到
亲和素-生物素复合物是一个三 维空间的结构，它利用亲和素 为中介，一端通过生物素化的 抗体联接第一抗体，另一端通 过生物素化酶与显色系统相连 接，产生多级放大，从而提高 此生物反应的敏感性和特异性
AB复合物多用于ABC法的免疫 组化中
ABC法
（Avidin-Biotin Complex，亲和素-生物素法）
tissue antigen
dextran backbone primary antibody enzyme molecule
二步法：EnVision
葡萄球菌蛋白A （Staphylococcal protein A, SPA）
二、免疫过氧化物酶染色技术的基本 原理
免疫过氧化酶染色技术的基本原理
优点：特异性高、非特异 染色轻。
缺点：敏感性低，要求抗 体浓度高。每种一抗均需 用酶来标记
间接法
将标记物标记在桥联抗体 上（即二抗、三抗）
一抗往往是兔身上产生的 多克隆抗体，其酶标抗体 必须是针对兔
优点：敏感性高，只需少 数几种动物的二抗就可以 和所有一抗相匹配
缺点：特异性差
常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目 录上常以RaH（Rabbit against Human）表之。
多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一 抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用 至关重要。
多克隆抗体与单克隆抗体及其产生
单克隆抗体的产生
应用细胞融合的杂交瘤技术 （Hybridization），以针对单 一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨 髓瘤细胞（肿瘤性B细胞）融 合形成杂交瘤，其特点是既能 产生特异性抗体，又能在体外 无限地增殖。将瘤细胞在体外 培养或注入小鼠腹腔内而获单 克隆抗体，由此产生的小鼠抗 人（抗原）的抗体常以MaH表 示，现在亦有兔的单克隆抗体
可用于福尔马林固定的石蜡切片
PAP
Substrate-chromogene solution Peroxidase-anti-Peroxidase Secondary Antibody
Primary Antibody
ABC法
（Avidin-Biotin Complex，亲和素-生物素法）
组成：
ABC
ABC 二抗
一抗
DAB
ABC与PAP 法的比较
LSAB（SP）法
（labelled streptavidin biotin method）标记 的链霉亲和素-生物素法
特点：将HRP直接标记于链 霉亲和素上
优点：
更快速：空间结构更小 更敏感：链霉亲和素的亲和性
更强，更易于到达深部位点 非特异背景更少：链霉亲和素
Secondary Antibody
Substrate-chromogene solution Primary Antibody
PAP法
（Peroxidase-AntiPeroxidase，过氧化酶-抗过氧化酶法）
组成：
一抗是针对靶抗原的特异 性抗体
二抗是联结抗体，一面联 结一抗，另一面联结PAP复 合物
特点
以多聚体为载体，联结了酶和一抗（一步法） 或二抗的Fab段和酶（二步法）
优点
操作简便，省时 提高了敏感性和特异性 减少了背景着色 避免内源性生物素的干扰
多聚物载体
一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKO EPOS及DAKO Envision试剂
核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分 子，起到载体的作用
免 疫 小 鼠
Mouse
抗原的制备：
传统用蛋白提纯
近来可应用分子生物学技术：已知抗原的基因 结构，用其合成多肽，作为抗原，如ER、PR抗 原的制备
现有兔的单抗
多克隆抗体和多克隆抗体的选用
单克隆抗体的制备比多克隆抗体复杂，价格 更贵；在应用中不一定比多克隆抗体好。
单克隆抗体的特异性强，多克隆抗体则敏感 性高，为何使用完全决定于使用的目的性
AB复合物多用于ABC法的免疫 组化中
酶标亲和素（Labelled streptavidin）
在AB复合物中，酶是 标记在生物素上，而 后与亲和素合成复合 物。在标记的亲和素生物素方法中是将辣 根过氧化酶直接标记 在亲和素上，辣根过 氧化酶与亲和素间有 极强的结合力，因此 LSAB法比ABC法更敏 感
P(反应产物) + E(酶)
显示系统
辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程:
HRP + HRP
H2O2
HRP·H2O2
DAB（电子供体）
有色分子终末产物 +
HRP：酶 H2O2：底物
HRP·H2O2：酶·底物复合物
显示系统
免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的 不同点在于显色系统的差异：
间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 PAP法： 利用PAP复合物 ABC法： 利用AB复合物 LSAB法: 利用直接标记于亲和素的酶 EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体
免疫球蛋白的化学结构及其模式图
Fc
Fab Ag
Fc(Fragmenwk.baidu.com crystalline)
是免疫球蛋白的羧基端，意为 结晶片段，因其纯化时呈结晶 状态而名之，该片段与抗原特 异性有关
Fab(Fragment antigen bingding)
该端是抗体与抗原特异性结合 的部位，每分子Ig能结合2个抗 原分子
标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明 酶：辣根过氧化酶，硷性磷酸酶 金属离子：胶体金颗粒
标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记 物的活性，从而使染色敏感性降低
酶 — 抗酶抗体复合物
通过免疫反应而不是化 学方法，将酶结合到抗 体上，形成具酶活性的 免疫复合物。如PAP复 合物（Peroxidase
SP
Substrate-chromogen solution
Ensyme-conjugated Streptavidin Biotinylated Secondary Antibody Primary Antibody
ABC与LSAB(SP)法的比较
一步法（EPOS）及两步法（Envision）
三抗是以过氧化物酶为抗 原，在与一抗同种动物身 上诱发产生的抗体，并与 辣根过氧化物酶形成复合 物（PAP）
PAP法
（Peroxidase-AntiPeroxidase，过氧化酶-抗过氧化酶法）
优点：
PAP复合物中含酶更多，且是一种非标记的免 疫组化方法，敏感性更高
PAP复合物常来自两种不同的动物（鼠、兔）， 鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色，兔PAP多 用于一抗为多克隆抗体的染色
清 有的联结抗体既能联结多抗，亦能联结单抗
三、免疫组化染色方法的类别
免疫组化染色方法的类别
直接法 间接法 PAP法 ABC法 LSAB法 一步法（EPOS） 两步法（Envision）
直接法
将荧光、酶、金直接标记 在一抗上进行显色，没有 联结系统、未用桥抗体。
多聚物载体
一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKO EPOS及DAKO Envision试剂
核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分 子，起到载体的作用
一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗 和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种 能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物
一步法：EPOS
免疫组织化学技术的原理及 方法
免疫组织化学技术的原理及其方法
一. 基本知识 二. 基本原理 三. 方法 四. 结果的判断及异常着色原因分析和对策
一、免疫组化技术的基本知识
一、 免疫组化技术的基本知识
免疫组化的基本概念 利用抗原-抗体特异性结合原理检测抗原或抗体 一般是用抗体检测抗原
抗原 两个主要属性：免疫原性及特异反应性，蛋白 质具有抗原性
抗体 与抗原能特异性结合—生物学结合是免疫球蛋 白Ig
免疫球蛋白的化学结构及其模式图
免疫球蛋白根据重链结构命名 IgG(γ), IgA(α)，IgD(δ), IgE(ε), IgM(μ)
五种免疫球蛋白只有两种类 型的轻连，即：
Kappa(κ)和Lambda(λ)
每个抗体分子的轻链必须相同； 某一单独的抗体分子 决不可能既 有κ链又有λ链。这一点在免疫组 化的淋巴瘤诊断中十分重要。
多克隆抗体与单克隆抗体及其产生
多克隆抗体
多克隆抗体：多株B细 胞针对多个抗原决定簇 产生的抗体
单克隆抗体
单克隆抗体：针对某一 抗原决定簇，由单株淋 巴细胞（克隆）所产生 的抗体
多克隆抗体与单克隆抗体及其产生
多克隆抗体的产生
以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个 抗原决定簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理 诊断中，有利划归肿瘤的基本类型。
一步法：EPOS
tissue antigen
dextran backbone primary antibody enzyme molecule
二步法：EnVision
一步法（EPOS）及两步法（Envision）比较
其目的都是设法提高免疫组化染色的敏感性
联结系统
联结或桥联抗体（一般为第二抗体） 按免疫学要求将识别系统与显色系统联结成为统
一体 应采用何种联结抗体决定于特异性第一抗体是多
克隆还是单克隆： 若一抗是多克隆抗体，则二抗是羊或其它动物
的抗兔血清； 若一抗是单克隆抗体，则二抗常是兔抗鼠的血
空间结构特殊，不易与高荷电 的组织成分（胶原纤维、结缔 组织）联结
酶标亲和素（Labelled streptavidin）
在AB复合物中，酶是 标记在生物素上，而 后与亲和素合成复合 物。在标记的亲和素生物素方法中是将辣 根过氧化酶直接标记 在亲和素上，辣根过 氧化酶与亲和素间有 极强的结合力，因此 LSAB法比ABC法更敏 感
EPOS一步法
Substrate-chromogen solution
EnVision二步法
一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和 素+酶标生物素）
优点：
亲和素和生物素有强大亲和力，使其比直 接和间接酶标法更敏感，也超过PAP法。
能用于常规石蜡切片。
亲和素—生物素复合物 （ Avidin-Biotin Complex ABC ）
亲和素有四个生物素分子特异 性结合部位，其结合力强，不 可逆，还可和辣根过氧化酶或 荧光素等结合
识别系统
特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。特异性 抗体具有识别并结合靶抗原的功能，这是本技术 的理论依据所在
特异性抗体品种繁多，应根据待检测抗原的要求 选用
特异性抗体有的属单抗，有的属多抗，有的既有 单抗又有多抗，可根据不同染色要求而选用
识别系统的组成比较恒定，识别功能由特异的第 一抗完成
AntiPeroxidase
Complex），PAP复合 物属非标记性，保护了 酶的活性，比免疫荧光 法敏感上千倍。
亲和素—生物素复合物 （ Avidin-Biotin Complex ABC ）
亲和素有四个生物素分子特异 性结合部位，其结合力强，不 可逆，还可和辣根过氧化酶或 荧光素等结合
亲和素-生物素复合物是一个三 维空间的结构，它利用亲和素 为中介，一端通过生物素化的 抗体联接第一抗体，另一端通 过生物素化酶与显色系统相连 接，产生多级放大，从而提高 此生物反应的敏感性和特异性
显示系统
也是显色系统。抗体抗原的结合是肉眼看不见的， 显示系统的目的就是使这种看不见的反应变为看 得见，从而确定抗原的存在及其定位
显色系统由酶、底物加上显色剂组成，最终可在 标记位点形成有色分子的终末产物，若显色剂为 DAB，则出现棕褐色细颗粒沉淀
E(酶)+S(底物)
E·S(酶底物复合物) 循环使用
市售抗体的种类
某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如 角蛋白，一些抗原只有多克隆抗体，如α-胰蛋 白酶
有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原 之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检 测。如Desmin来源于鸡的肌肉
近年来,市售单克隆抗体除小鼠源性外，还有兔 源性
标记抗体
在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使 抗原抗体的结合能用肉眼观察到
亲和素-生物素复合物是一个三 维空间的结构，它利用亲和素 为中介，一端通过生物素化的 抗体联接第一抗体，另一端通 过生物素化酶与显色系统相连 接，产生多级放大，从而提高 此生物反应的敏感性和特异性
AB复合物多用于ABC法的免疫 组化中
ABC法
（Avidin-Biotin Complex，亲和素-生物素法）
tissue antigen
dextran backbone primary antibody enzyme molecule
二步法：EnVision
葡萄球菌蛋白A （Staphylococcal protein A, SPA）
二、免疫过氧化物酶染色技术的基本 原理
免疫过氧化酶染色技术的基本原理
优点：特异性高、非特异 染色轻。
缺点：敏感性低，要求抗 体浓度高。每种一抗均需 用酶来标记
间接法
将标记物标记在桥联抗体 上（即二抗、三抗）
一抗往往是兔身上产生的 多克隆抗体，其酶标抗体 必须是针对兔
优点：敏感性高，只需少 数几种动物的二抗就可以 和所有一抗相匹配
缺点：特异性差
常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目 录上常以RaH（Rabbit against Human）表之。
多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一 抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用 至关重要。
多克隆抗体与单克隆抗体及其产生
单克隆抗体的产生
应用细胞融合的杂交瘤技术 （Hybridization），以针对单 一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨 髓瘤细胞（肿瘤性B细胞）融 合形成杂交瘤，其特点是既能 产生特异性抗体，又能在体外 无限地增殖。将瘤细胞在体外 培养或注入小鼠腹腔内而获单 克隆抗体，由此产生的小鼠抗 人（抗原）的抗体常以MaH表 示，现在亦有兔的单克隆抗体
可用于福尔马林固定的石蜡切片
PAP
Substrate-chromogene solution Peroxidase-anti-Peroxidase Secondary Antibody
Primary Antibody
ABC法
（Avidin-Biotin Complex，亲和素-生物素法）
组成：
ABC
ABC 二抗
一抗
DAB
ABC与PAP 法的比较
LSAB（SP）法
（labelled streptavidin biotin method）标记 的链霉亲和素-生物素法
特点：将HRP直接标记于链 霉亲和素上
优点：
更快速：空间结构更小 更敏感：链霉亲和素的亲和性
更强，更易于到达深部位点 非特异背景更少：链霉亲和素
Secondary Antibody
Substrate-chromogene solution Primary Antibody
PAP法
（Peroxidase-AntiPeroxidase，过氧化酶-抗过氧化酶法）
组成：
一抗是针对靶抗原的特异 性抗体
二抗是联结抗体，一面联 结一抗，另一面联结PAP复 合物
特点
以多聚体为载体，联结了酶和一抗（一步法） 或二抗的Fab段和酶（二步法）
优点
操作简便，省时 提高了敏感性和特异性 减少了背景着色 避免内源性生物素的干扰
多聚物载体
一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKO EPOS及DAKO Envision试剂
核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分 子，起到载体的作用
免 疫 小 鼠
Mouse
抗原的制备：
传统用蛋白提纯
近来可应用分子生物学技术：已知抗原的基因 结构，用其合成多肽，作为抗原，如ER、PR抗 原的制备
现有兔的单抗
多克隆抗体和多克隆抗体的选用
单克隆抗体的制备比多克隆抗体复杂，价格 更贵；在应用中不一定比多克隆抗体好。
单克隆抗体的特异性强，多克隆抗体则敏感 性高，为何使用完全决定于使用的目的性
AB复合物多用于ABC法的免疫 组化中
酶标亲和素（Labelled streptavidin）
在AB复合物中，酶是 标记在生物素上，而 后与亲和素合成复合 物。在标记的亲和素生物素方法中是将辣 根过氧化酶直接标记 在亲和素上，辣根过 氧化酶与亲和素间有 极强的结合力，因此 LSAB法比ABC法更敏 感
P(反应产物) + E(酶)
显示系统
辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程:
HRP + HRP
H2O2
HRP·H2O2
DAB（电子供体）
有色分子终末产物 +
HRP：酶 H2O2：底物
HRP·H2O2：酶·底物复合物
显示系统
免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的 不同点在于显色系统的差异：
间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 PAP法： 利用PAP复合物 ABC法： 利用AB复合物 LSAB法: 利用直接标记于亲和素的酶 EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体
免疫球蛋白的化学结构及其模式图
Fc
Fab Ag
Fc(Fragmenwk.baidu.com crystalline)
是免疫球蛋白的羧基端，意为 结晶片段，因其纯化时呈结晶 状态而名之，该片段与抗原特 异性有关
Fab(Fragment antigen bingding)
该端是抗体与抗原特异性结合 的部位，每分子Ig能结合2个抗 原分子
标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明 酶：辣根过氧化酶，硷性磷酸酶 金属离子：胶体金颗粒
标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记 物的活性，从而使染色敏感性降低
酶 — 抗酶抗体复合物
通过免疫反应而不是化 学方法，将酶结合到抗 体上，形成具酶活性的 免疫复合物。如PAP复 合物（Peroxidase
SP
Substrate-chromogen solution
Ensyme-conjugated Streptavidin Biotinylated Secondary Antibody Primary Antibody
ABC与LSAB(SP)法的比较
一步法（EPOS）及两步法（Envision）
三抗是以过氧化物酶为抗 原，在与一抗同种动物身 上诱发产生的抗体，并与 辣根过氧化物酶形成复合 物（PAP）
PAP法
（Peroxidase-AntiPeroxidase，过氧化酶-抗过氧化酶法）
优点：
PAP复合物中含酶更多，且是一种非标记的免 疫组化方法，敏感性更高
PAP复合物常来自两种不同的动物（鼠、兔）， 鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色，兔PAP多 用于一抗为多克隆抗体的染色
清 有的联结抗体既能联结多抗，亦能联结单抗
三、免疫组化染色方法的类别
免疫组化染色方法的类别
直接法 间接法 PAP法 ABC法 LSAB法 一步法（EPOS） 两步法（Envision）
直接法
将荧光、酶、金直接标记 在一抗上进行显色，没有 联结系统、未用桥抗体。
多聚物载体
一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKO EPOS及DAKO Envision试剂
核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分 子，起到载体的作用
一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗 和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种 能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物
一步法：EPOS
免疫组织化学技术的原理及 方法
免疫组织化学技术的原理及其方法
一. 基本知识 二. 基本原理 三. 方法 四. 结果的判断及异常着色原因分析和对策
一、免疫组化技术的基本知识
一、 免疫组化技术的基本知识
免疫组化的基本概念 利用抗原-抗体特异性结合原理检测抗原或抗体 一般是用抗体检测抗原
抗原 两个主要属性：免疫原性及特异反应性，蛋白 质具有抗原性
抗体 与抗原能特异性结合—生物学结合是免疫球蛋 白Ig
免疫球蛋白的化学结构及其模式图
免疫球蛋白根据重链结构命名 IgG(γ), IgA(α)，IgD(δ), IgE(ε), IgM(μ)
五种免疫球蛋白只有两种类 型的轻连，即：
Kappa(κ)和Lambda(λ)
每个抗体分子的轻链必须相同； 某一单独的抗体分子 决不可能既 有κ链又有λ链。这一点在免疫组 化的淋巴瘤诊断中十分重要。
多克隆抗体与单克隆抗体及其产生
多克隆抗体
多克隆抗体：多株B细 胞针对多个抗原决定簇 产生的抗体
单克隆抗体
单克隆抗体：针对某一 抗原决定簇，由单株淋 巴细胞（克隆）所产生 的抗体
多克隆抗体与单克隆抗体及其产生
多克隆抗体的产生
以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个 抗原决定簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理 诊断中，有利划归肿瘤的基本类型。