免疫组化组织细胞地取材、固定、切片操作方法及要点
免疫组化相关步骤
免疫组化相关步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测、定位和定量特定蛋白质在组织或细胞中的表达。
以下是免疫组化的一般步骤：1.取材和预处理：首先，选择需要研究的物种的组织样本，可以是固定和包埋的组织切片，也可以是细胞培养物。
对于固定组织，常用的固定剂包括福尔马林、乙醛等。
然后进行脱水、透明化、包埋等预处理步骤。
2.标本切片：将处理好的组织或细胞样本切成较薄的切片，常见的切片厚度为4-6微米。
切片后，可以将其固定在载玻片上。
3.抗原恢复：对于一些已经固定的样本，抗体可能无法充分与蛋白质结合。
因此，进行抗原恢复是必要的。
常见的抗原恢复方法包括加热诱导抗原恢复（如高温加热或压力加热）和酶或蛋白酶诱导的抗原恢复。
这些方法有助于揭示抗原并提高抗体的结合。
4.阻断非特异性结合：在进行免疫组化反应之前，需要阻断非特异性结合位点，以减少假阳性结果。
常用的非特异性结合位点阻断方法包括使用血清蛋白、牛血清白蛋白、胶原蛋白等。
5.一抗反应：将特异性抗体（一抗）加入切片或细胞上，并进行孵育。
一抗可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
一般情况下，常用的抗体稀释倍数为1:100到1:1000。
此步骤的时间和温度也需要根据具体的抗体选择进行调整。
6.洗涤：完成一抗反应后，需要进行多次洗涤来去除未结合的抗体。
洗涤可以使用生理盐水、PBS等缓冲液，重复2-3次洗涤，每次洗涤时间持续5-10分钟。
7.二抗反应：8.洗涤：与一抗反应类似，完成二抗反应后需要进行多次洗涤来去除未结合的二抗。
洗涤可以使用生理盐水、PBS等缓冲液，重复2-3次洗涤，每次洗涤时间持续5-10分钟。
9.染色和显微镜观察：根据实验需要，可以选择合适的染色方法，如荧光染色或酶联染色。
染色后，可以使用荧光显微镜或光学显微镜进行观察和拍照记录。
10.分析和结果解读：根据染色的结果和显微镜观察，进行定性和定量分析。
可以使用图像处理软件来分析染色的强度和分布情况。
根据实验设计和相关的对照组，对实验结果进行解读。
免疫组化的注意事项操作要点和技巧
免疫组化的注意事项、操作要点和技巧一些教训：1、对于多甲灌注固定的标本，如要长期保存，要先脱水后冻存，此法对于采用漂片法IHC 较适合。
正确操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——蔗糖梯度脱水——负70度保存——冰冻切片错误操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——负70度保存——蔗糖梯度脱水——冰冻切片，结果是会有大量冰晶形成。
2、如果能确认使用石蜡切片并使用贴片法进行下一步IHC，多甲或甲醛后固定后应尽快脱水并石蜡包埋。
要点和操作技巧：1.固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。
对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。
有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。
适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分钟或37℃过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存6．脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。
如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。
在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
免疫组化实验步骤完整版
免疫组化实验步骤完整版步骤1：标本采集和固定首先，需要从待检测样本中采集组织或细胞。
可以使用手术切片、活体组织、培养的细胞等作为标本。
然后，将采集的样本固定在载玻片或切片上，以保持其结构和形态的完整性。
步骤2：抗原暴露和体细胞抗原消除接下来，需要处理标本以使抗原裸露出来，并消除非特异性的抗体结合和细胞膜结合的抗原。
这一步骤常常涉及对组织或细胞的预处理，例如用石蜡脱脂、酶解抗体和孵化等。
步骤3：抗体特异性结合选择特异性的抗体用于检测待测蛋白质。
这些抗体可以是直接标记的一抗，或间接标记的二抗。
一抗是专门与目标抗原结合的抗体，而二抗则可以与一抗结合，以提高信号的灵敏度和特异性。
这一步骤中还需要选择适当的阴性对照，即未携带待检测抗原的样本。
步骤4：探针检测根据需要，可以使用不同的探针来检测目标分子。
常用的探针有标记的一抗、荧光探针、放射性标记物等。
标记的一抗可以直接结合抗原，然后使用染色剂进行可视化；荧光探针则通过荧光显微镜进行检测；放射性标记物可以通过放射自显影等方法进行检测。
步骤5：显色和对比计数将荧光、酶标记或放射性标记的物质显色，以便于检测和计数。
在染色的过程中，需要防止非特异性的染色，例如使用阻断剂、胶原等。
步骤6：结果分析根据观察到的染色强度、分布模式等结果，分析待测蛋白质在样本中的表达情况。
这可能需要与阴性对照和阳性对照进行比较，以确定实验结果的可靠性。
步骤7：图像捕获和分析使用显微镜或其他成像设备，将荧光、染色或放射性标记的图像捕获下来。
可以使用图像分析软件来计算和比较样本中的染色强度、面积等参数。
步骤8：数据统计和结果报告根据实验结果进行数据统计和分析，并将结果记录在报告中。
报告应包括样本信息、实验方法、结果和结论等内容，并根据需要进行解释和讨论。
总结：免疫组化实验是一种广泛应用于研究、诊断和治疗的方法。
它的步骤包括标本采集和固定、抗原暴露和体细胞抗原消除、抗体特异性结合、探针检测、显色和对比计数、结果分析、图像捕获和分析、数据统计和结果报告。
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用抗体来检测组织或细胞中特定蛋白质的方法。
该技术的原理基于抗体与其特异性抗原结合的特性。
下面将详细介绍免疫组化的步骤。
第一步，固定组织：将待检测的组织或细胞固定在载玻片上。
常用的固定剂包括甲醛和乙醛，可通过浸泡、喷洒或滴加等方式施加在组织上，使细胞和蛋白质保持其形态和结构。
第二步，脱水：将固定的组织经过一系列浓度逐渐升高的酒精溶剂中处理，以去除水分，使组织逐渐与酒精混合。
第三步，脱脂：将组织在适当的溶剂（如二甲苯或苯）中脱脂，以去除酒精和脂质。
第四步，石蜡浸渍：将脱脂的组织浸泡在液态石蜡中，使其渗透并替代脱脂剂和二甲苯，然后固化组织。
第五步，切片：使用微tome切割固化的样本，制备出薄片，常见的切片厚度为4-5μm。
第六步，脱离：将切好的薄片与载玻片分离，常用的方法是利用热水浸泡薄片，使其松散分离。
第七步，抗原修复：利用高温和压力的方法，如蒸汽煮沸或压力锅，对薄片上的蛋白质进行解散，以恢复其免疫活性。
第八步，阻断非特异性结合：使用一些蛋白质如牛血清蛋白、动物血清或其他蛋白质来包裹薄片上的非特异性结合位点，以减少假阳性反应。
第九步，抗体处理：将特异性抗体加到薄片上，与待检测的蛋白质结合。
抗体可以是原代抗体（直接与靶蛋白质结合）或二抗（与原代抗体结合）。
第十步，洗涤：用缓冲液洗去未结合的抗体，并去除阻断剂和非特异性结合物。
第十一步，检测：将检测试剂滴加到薄片上，以产生特定色素或荧光信号。
常用的检测方法包括酶标法（如辣根过氧化物酶法，HRP法）和荧光标记（如荧光素酶法，AP法）。
第十二步，显微镜检查：使用显微镜观察薄片上的染色结果，评估标记物的定位和表达情况。
通过上述步骤，免疫组化技术可以帮助研究人员检测并定位组织或细胞中感兴趣的蛋白质。
其广泛应用于生物医学研究、临床诊断以及药物研发等领域，为揭示疾病的分子机制和开发新的治疗手段提供了重要的工具。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。
2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。
步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。
2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。
3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。
步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。
2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。
步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。
抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。
2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。
孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。
步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。
2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。
步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。
2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。
步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。
常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。
2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。
步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。
2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。
步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。
2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。
这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。
免疫组化之组织处理、切片和染色实验技术步骤
免疫组化之组织处理、切片和染色实验技术步骤展开全文1.组织处理恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。
如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。
1) 组织及时取材和固定组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm× 0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3cm×5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。
固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。
从而完好的保存抗原和组织细胞形态。
对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2h 内，一般固定时间不应超过24小时。
随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。
2) 组织脱水、透明、浸蜡组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。
掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65℃。
免疫组化方法和步骤
免疫组化方法和步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测细胞或组织中特定蛋白质的表达水平，以及研究细胞或组织中的蛋白质定位和相互作用。
免疫组化方法涉及一系列步骤，包括样本固定、抗原检测与标记、抗体与抗原结合、可视化和结果分析。
以下是免疫组化方法及步骤的详细介绍。
一、样本固定免疫组化实验的第一步是固定样本，通常使用福尔马林或乙醛等化学物质进行固定。
固定的目的是保持细胞和组织的形态结构，并防止蛋白质的降解。
固定过程中，需要将样本固定在载玻片或膜上，以便之后的实验操作。
可使用刷子或杆状工具将样本涂布在载玻片上，或者使用离心管和离心机将细胞沉淀在载膜上。
二、抗原检测与标记样本固定后，下一步是检测和标记目标抗原。
有两种常用的方法供选择：直接法和间接法。
1.直接法：直接法在一个步骤中同时检测和标记抗原。
直接法可以快速获得结果，但受到抗体的特异性和标记物的可用性的限制。
2.间接法：间接法需要两个步骤，先使用特异性初级抗体与抗原结合，再使用标记有染料或标记物的二级抗体与初级抗体结合。
间接法具有较高的灵敏度和特异性，可以用于多重标记和检测多个蛋白质。
三、抗体与抗原结合蛋白质和抗体结合是免疫组化的关键步骤。
待检样本上固定的抗原与抗体结合可以直接检测或通过信号增强来检测。
抗体与抗原结合的时间和温度取决于抗体的亲和力和特异性，通常需要在较低的温度下进行孵育，并在孵育过程中提供充分的抗体与抗原接触时间。
四、可视化可视化是将抗原抗体结合信号转化为可见光信号的过程。
最常见的可视化方法之一是使用酶标测定法。
酶标测定法将酶（如辣根过氧化物酶）结合到标记物（如荧光素黄标记的二级抗体）上，然后通过加入底物（如DAB）产生可见的色素反应。
除了酶标测定法外，还有其他可视化方法，如免疫荧光技术和原位杂交。
免疫荧光技术使用标记的荧光染料标记一级或二级抗体，然后通过荧光显微镜观察样本。
原位杂交使用与DNA序列互补的标记探针识别特定的DNA序列，并通过可视化标记（如荧光）来检测靶标。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理1. 引言免疫组化，听起来就像科学家们的秘密武器，其实它在病理学和生物医学中扮演着不可或缺的角色。
简单来说，这个方法能帮助我们在组织切片中找出特定的蛋白质，就像在侦探故事中找线索一样。
你可能会想：“这玩意儿到底是怎么回事？”别急，今天就带你深入了解免疫组化的每一步，绝对让你大开眼界。
2. 准备工作2.1 组织样本的获取首先，我们得有个“样本”。
这就像做菜，得有食材。
我们通常会从病人那儿获取组织切片，可能是肿瘤、炎症等地方。
切片越薄，越能让我们看的清楚，像是把面包切得薄薄的，涂上黄油才好吃。
2.2 切片处理接下来，把这些切片用固定剂处理，最常用的是福尔马林。
这个步骤就像给切片穿上“保护衣”，确保里面的蛋白质不会在过程中跑掉。
然后，我们还得用乙醇脱水，把水分抽走，这样才不会稀释我们要找的“宝贝”。
最后，用二甲苯清洗，让切片变得干净透亮，准备好迎接接下来的挑战。
3. 免疫反应3.1 抗体的选择免疫组化的核心就是抗体。
选择抗体就像选队友，得找对的！我们得确保这个抗体是专门针对我们想要检测的那个蛋白质的。
想象一下，你在寻找某个特定的明星，当然得找那个最熟悉的粉丝来帮忙。
3.2 抗体结合一旦选择好抗体，就把它涂在切片上，等待它和目标蛋白质结合。
这个过程就像约会，抗体和蛋白质在切片上“相遇”，彼此结合。
结合得越紧密，后面的结果就越清晰！4. 显色反应4.1 连接二级抗体接下来，我们要用二级抗体来“加油”。
这一步是让我们能看到“结合”的效果。
二级抗体会识别一级抗体，并且带上标记，像给你的队伍加上标志，显得更亮眼。
4.2 显色剂的使用然后，加入显色剂，这一步就像给你的作品上色，瞬间让切片变得活灵活现。
显色剂和标记结合后，就会产生颜色反应，形成我们最终需要的信号。
这时候，你能看到那些特定蛋白质的位置，就像在黑暗中点亮了灯塔。
5. 观察与分析5.1 显微镜观察当颜色形成后，我们就可以用显微镜观察结果了。
免疫组化切片步骤
免疫组化切片步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗体与组织中特定抗原结合的方法，通过染色反应来观察和定位抗原在组织中的表达情况。
它在病理学诊断、生物医学研究和药物研发中起着重要的作用。
下面将介绍免疫组化切片的步骤。
1. 标本固定免疫组化切片的第一步是对组织标本进行固定。
通常使用10%的缓冲福尔马林（formalin）溶液进行固定，固定时间一般为24-48小时。
固定的目的是保持组织形态和结构，同时保护抗原的完整性。
2. 组织处理固定后的组织标本需要进行脱水和石蜡包埋处理。
首先，将组织标本从福尔马林中取出，用流动水冲洗去除福尔马林。
然后，将组织置于逐渐升级的酒精溶液中进行脱水，通常是从低浓度（例如70%）的酒精开始，逐渐升级到高浓度（例如100%）的酒精。
脱水的目的是去除水分，使组织与石蜡相容。
3. 石蜡浸渍和包埋脱水后，组织标本需要进行石蜡浸渍和包埋处理。
将组织放入石蜡中，使用真空泵进行抽真空，以便石蜡渗透到组织内部。
然后，将组织置于石蜡中，用石蜡包裹组织标本，使其固定在切片时保持完整。
石蜡的目的是提供支撑和保护组织结构。
4. 切片制备经过石蜡包埋的组织标本需要切片制备。
使用旋转式切片机将石蜡包埋的组织标本切成薄片，通常为4-5微米厚。
切片的目的是将组织标本切割成可以在显微镜下观察的薄片。
5. 切片烘干和质控切片制备后，将切片放在烘箱中进行烘干，以去除切片中的水分。
然后，对切片进行质控，确保切片的质量和完整性。
质控包括切片染色前的切片检查和评估。
6. 抗原修复切片染色前，需要进行抗原修复。
抗原修复的目的是恢复组织中抗原的空间结构和形状，以便抗体能够有效地与其结合。
常用的抗原修复方法包括热诱导抗原修复（heat-induced antigen retrieval）和酶诱导抗原修复（enzyme-induced antigen retrieval）。
7. 抗体染色抗原修复后，进行抗体染色。
免疫组化实验方法
免疫组化实验方法免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用特异性抗体与组织或细胞特定抗原结合的方法，以此可以检测细胞或组织中蛋白质的表达和分布情况。
IHC技术已广泛应用于病理学、癌症诊断、生物医学研究等领域。
以下是免疫组化实验的常用方法：1.样本处理：通常以石蜡包埋切片作为实验样本。
首先，从固定的组织或细胞中取得标本，然后进行脱水、透明化和浸蜡等处理。
接下来，使用切片机将组织或细胞切割成厚度为3-5μm的切片。
2.抗原恢复：由于样本的固定和包埋可能导致抗原的损伤，因此需要对切片进行抗原恢复处理。
常见的抗原恢复方法包括热处理、酶解法和酸性水解法。
热处理是将切片置于缓冲液中，在高温下进行退火。
酶解法是使用胰蛋白酶等酶对切片进行消化。
酸性水解法则使用盐酸或酶进行酸性处理。
3.抗体结合：选择特异性的一抗体与目标抗原结合。
一抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以经商业采购或自家制备。
将一抗体加入待检测切片上，让其与目标抗原结合。
4. 第二抗体结合：待检测切片上结合了一抗体的抗原后，需要添加第二抗体与一抗体结合。
第二抗体通常是反相应物免疫球蛋白（Secondary Antibody），如反人IgG，反兔IgG等。
第二抗体上常会标记有发光物质、酶标记物或荧光染料，用于可视化结果。
5.可视化和显色：根据选择的第二抗体，可以选择显色方法。
例如，辣根过氧化物酶（HRP）结合的第二抗体可以使用3,3'-二氨基联苯思（DAB）作为底物，呈棕色或棕黄色；荧光标记的第二抗体可以用荧光显微镜进行观察。
6.伪染色：为了辅助观察和识别目标组织或细胞，可以进行伪染色。
常见的伪染色方法有对比染色、核染色和细胞质染色等。
7.阴性对照和阳性对照：为了确保实验结果的准确性和可靠性，同时进行阴性对照和阳性对照实验。
阴性对照是在实验中将第一抗体替换为非特异性抗体或缺少抗体的处理组织或细胞组织；阳性对照是在实验中使用已知表达目标蛋白的组织或细胞进行处理。
免疫组化操作规程
免疫组化操作规程
《免疫组化操作规程》
免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，其操作规程的严谨性和标准化对于获得准确可靠的结果至关重要。
下面是一份免疫组化操作规程供参考：
1. 样本处理：将组织标本固定在适当的条件下，然后进行蜡包埋并切片。
注意保护好标本的完整性和质量。
2. 抗原修复：对标本进行适当的热处理或酶处理，以修复由于固定等步骤导致的抗原构象变化。
3. 抗体选择：选择适当的一抗和二抗，确保一抗的特异性和敏感性，二抗的来源和标记物的稳定性。
4. 标本处理：将切片标本进行脱脂、脱水和透明化处理，确保标本的透明度和形态保持完好。
5. 抗体染色：将标本与一抗和二抗分别反应，通过荧光标记或酶标记来检测靶标记的位置和强度。
6. 阅读结果：采用专业显微镜观察标本的染色结果，进行定量分析或者定性分析。
7. 结果验证：通过对照组和阳性对照进行染色结果的验证，确
保结果的准确性。
8. 结果分析：根据染色结果和临床信息进行综合分析，作出科学可靠的结论。
以上是一份免疫组化操作规程的基本内容，但在实际操作中还需要根据具体的实验室条件和要求进行进一步的细化和规范化。
希望这份规程能为从事免疫组化工作的科研人员和临床检验人员提供一些帮助。
免疫组化操作程序
免疫组化操作程序免疫组化操作程序是一种用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达及定位的方法。
它是一种广泛应用于生物医学研究和诊断中的技术，可以帮助我们了解细胞和组织中的分子机制并在疾病诊断中起到重要的作用。
本文将详细介绍免疫组化操作程序的步骤和注意事项。
一、实验前准备：1.样本准备：收集并固定适当的组织样本，使用适当的方法固定样本，如福尔马林或酒精。
2.抗体选择：根据所需研究的蛋白质，选择合适的一抗和二抗。
同时，选择用于检测的标记物，如酶、荧光物质等。
3.条件优化：根据本实验的具体情况，优化实验条件，包括温度、时间和浓度等。
二、免疫组织染色步骤：1.切片制备：将固定的组织样本切片，厚度约为4-6微米。
2.抗原修复：根据实验需求，选择适当的方法进行抗原修复，如高温加热、酶解或酸解等。
3.阻断非特异性结合：将组织切片加入阻断液，如10%牛血清蛋白（BSA）或5%牛血清中所含的非离子阻断剂。
封闭其非特异性结合位点。
4.一抗孵育：将选择的一抗溶液滴于组织切片上，孵育在适当的温度和时间下，让一抗与目标蛋白结合。
5.洗涤：用缓冲液清洗切片，去除未结合的一抗。
6.二抗孵育：将选择的针对一抗的二抗溶液滴于切片上，孵育在适当的温度和时间下，让二抗结合到一抗上。
7.洗涤：用缓冲液清洗切片，去除未结合的二抗。
8.标记物检测：根据选择的标记物，使用适当的方法检测其在切片上的存在，如化学染色、荧光显微镜等。
9.涂覆封片：将固定和染色好的切片放置在玻璃片上，并用适当的封片溶液覆盖切片。
三、实验注意事项：1.样本处理：合适的样本处理和固定方法对实验结果至关重要。
选择适当的固定剂并注意固定时间。
2.抗原修复：不同的抗原修复方法适用于不同的蛋白质，需要根据实验要求选择适当的方法。
3.阻断非特异性结合：添加适当的非特异性结合阻断剂能够减少非特异性结合。
4.孵育温度和时间：根据抗体和样本的特性选择适当的孵育温度和时间，以提高特异性和灵敏度。
免疫组化步骤及原理
免疫组化步骤及原理一、前言免疫组化是一种常用的实验技术，它可以用来检测组织或细胞中的蛋白质表达及其分布情况。
本文将详细介绍免疫组化的步骤及原理。
二、免疫组化的步骤1. 取材首先需要取得需要检测的样本，可以是活体组织或固定后的切片。
对于固定后的切片，需要进行脱水、透明化和包埋等处理。
2. 制备切片将取得的样本制备成厚度为4-6μm的切片，并将其放置在载玻片上。
然后进行脱蜡和再水化处理，以便后续步骤的顺利进行。
3. 抗原修复抗原修复是为了恢复经过固定和包埋处理后被破坏或掩盖了的抗原性位点，使其能够被抗体识别。
抗原修复方法有多种，如高温加压法、微波辅助法等。
4. 阻断非特异性结合位点在进行免疫反应之前，需要阻断非特异性结合位点以减少假阳性结果。
常用的方法是使用牛血清白蛋白、小鼠IgG等。
5. 抗体孵育将特异性的一抗加入载玻片上，在恰当的条件下孵育一段时间，使其与靶分子结合。
然后用洗涤缓冲液洗去未结合的抗体。
6. 二抗孵育加入与第一抗体来源物种不同的二抗，使其结合到第一抗体上。
通常二抗会标记有荧光素、辣根过氧化物酶等标记物，以便于检测。
7. 洗涤在每个孵育步骤之后都需要进行洗涤，以去除未结合的分子和杂质。
洗涤缓冲液可以是PBS、TBST等。
8. 显色对于标记有辣根过氧化物酶等标记物的二抗，需要使用底物进行显色。
底物包括DAB、VIP等，在加入底物之前需要在载玻片上加入过氧化氢等催化剂。
9. 盖片封装最后将载玻片盖上盖片，并使用透明胶水进行封装。
这样可以保持样本的湿度和防止样本污染。
三、免疫组化的原理免疫组化的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够被免疫系统识别并引起免疫反应的分子，如蛋白质、多肽等。
抗体是由B细胞分泌的一种具有特异性结合能力的分子，可以识别和结合到相应的抗原上。
在进行免疫组化实验时，首先需要选择一种特异性较高的一抗，使其与靶分子结合。
然后加入来源于不同物种的二抗，使其与第一抗体结合。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程及操作流程免疫组化（immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用抗体-抗原反应来检测组织中特定蛋白质表达的方法。
它广泛应用于医学研究和临床诊断中，常用于检测肿瘤标志物、免疫细胞浸润和病毒感染等。
I.免疫组化操作规程1.样本处理a.组织固定：将组织标本进行固定，一般使用10%中性缓冲福尔马林进行固定，固定时间一般为24-48小时。
b.去脂化：对于脂肪较多的组织，需要将其进行去脂处理，可使用二甲苯或其他去脂剂进行处理，处理时间一般为20-30分钟。
2.抗原恢复a.热诱导抗原恢复：将固定的组织样本放入蒸汽气锅中，用缓冲液浸泡标本，加热至高压下，进行抗原恢复处理。
具体温度和时间根据样本类型和抗体要求而定。
b.酶诱导抗原恢复：对于抗原蛋白固定后被交联、无法热诱导恢复的样本，可使用酶解剂（如胰蛋白酶）进行抗原恢复。
3.阻断非特异结合a.使用非特异结合阻断剂：在进行免疫染色之前，需要将非特异结合位点进行阻断，可使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）或鱼凝胶蛋白（FSG）等，在阻断液中孵育样本。
4.抗体反应a.一抗孵育：将目标抗体（一抗）稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为1-2小时。
b.二抗孵育：选择免疫印迹试剂盒中对应一抗的二抗，将其稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为30-60分钟。
5.染色和显色a.底物酶标：使用底物和酶的复合物，进行染色和显色反应。
常用的底物有DAB（二氨基苯），TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）等，反应时间一般为5-10分钟。
b.荧光染色：若使用荧光标记的二抗，需进行相应波长的激发光照射，观察荧光信号。
6.降解和清理a.用超纯水洗涤：使用超纯水进行标本洗涤，彻底清除底物和底物残留物。
b.孵育升级脱位溶液：将样本浸泡在脱位溶液中，使特异结合的抗体与抗原分离。
c.用盖玻片封装：涂上透明胶和玻片，使其固定在盖玻片上，并封住。
免疫组化实验没学好？来看CST中国为你整理的操作要点
免疫组化实验没学好？来看CST中国为你整理的操作要点免疫组化，简称IHC，是应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色，对组织细胞内抗原进行定位、定性及相对定量研究的实验方法。
包括石蜡切片的免疫组化技术（IHC-P）和冰冻切片的免疫组化技术（IHC-F），今天主要讲的是IHC-P。
免疫组化操作要点①标本固定——不仅仅是“切一切”和“泡一泡”温柔地取材：大刀阔斧取材的同时，视组织如珍宝，莫挤压组织，轻柔取材和镊取。
尽量避开坏死区域。
太大太厚的组织不利于均匀一致的固定，实质组织取材厚度应小于5mm。
新鲜的固定液：固定液10%中性缓冲福尔马林(NBF) 需新鲜配置，商用型固定液注意其标注的有效期，避免使用过期变质的固定液。
充分及时地固定：固定液要充足，其与组织的体积比最好大于等于20倍；取材后即刻固定。
固定时需将瓶口封住，避免甲醛挥发。
组织的固定时间不宜过长，一般过夜（12-24h）即可。
免疫组化操作要点②修复大法——不仅仅是“煮一煮”微波炉修复：简单易行效果好，CST推荐使用微波炉完成修复。
合适的修复液：根据抗体说明书使用合适的修复液。
用柠檬酸修复后，切片需浸泡在修复液中，自然冷却；而用EDTA修复后，切片可直接从修复缸中取出，直接进行下一步。
注：使用不同的修复方式和不同生产商的抗体检测人肺癌组织中EGFR的表达。
第一排为CST 的EGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb（#4267），EDTA的修复方式明显优于柠檬酸盐及胃蛋白酶，故在该抗体说明书中，标注了使用EDTA修复进行免疫组化实验。
免疫组化操作要点③对的抗体，对的使用——不仅仅是“买买买和加加加”种属和应用范围：确定该抗体可检测所需种属（Reactivity）的石蜡切片上完成组化实验（Application：IHC-P）。
稀释液和稀释比：查看抗体说明书，使用正确的一抗稀释液和稀释比。
免疫组化实验具体步骤及说明
免疫组化实验具体步骤及说明免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织部分或特定分子的表达、定位和定量的技术。
它基于抗原抗体相互作用的原理，通过特异性的抗体与目标分子结合形成复合物，再通过染色反应显示出目标分子的位置和数量。
IHC广泛应用于癌症诊断、疾病研究和药物开发等领域。
以下是免疫组化实验的具体步骤及说明：1.标本制备：首先，取得切片的组织标本，通常是经过固定和包埋的组织。
然后，将组织切片取下玻片，用去离子水处理。
最后，将切片分别置于乙醇溶液中进行脱水，再用苯酚或其他抗氧化剂处理，以保护切片的蛋白质结构。
2.去蜡：将切片置于细胞清洗液中，用搅拌器在室温下搅拌，去除蜡层。
然后，分别使用乙醇降级脱水和再次用去离子水处理，以去除残留的蜡。
3.抗原检出：使用特定的抗体来检测目标分子。
首先，在切片中添加抗原修复溶液，进行退火和抗原修复，以恢复抗原的免疫原性。
然后，用PBS洗涤切片，去除剩余的抗原修复液，并将切片与蛋白质阻断剂孵育，以防止非特异性结合。
最后，将切片与特异性的初级抗体孵育，以形成抗原-抗体复合物。
4.特异性结合检测：添加特异性的二级抗体，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗鼠IgG，与初级抗体特异性结合。
此外，还可以使用荧光标记的二级抗体，以便通过显微镜直接检测目标蛋白质的荧光信号。
完成二级抗体与抗原复合物的结合后，用PBS洗涤切片。
5.信号放大与检测：对于HRP标记的二级抗体，使用辣根过氧化物酶底物，如DAB（二氨基苯类胺）或TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）。
这些底物在酶作用下会形成可见的棕色沉积物。
对于荧光标记的二级抗体，在显微镜下直接检测荧光信号。
6.染色和显微镜观察：将切片用PBS洗涤，然后用余晖蓝染色溶液浸泡，以增强显微镜下观察的对比度。
最后，用水轻轻冲洗切片，除去多余的染色剂。
用显微镜观察切片，评估目标蛋白质的表达和定位。
免疫组化基本操作流程
免疫组化基本操作流程免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测细胞或组织中特定蛋白质的表达水平、定位以及相互作用。
以下是免疫组化基本的操作流程：1.组织固定首先，需要对待检测的组织进行固定。
最常用的方法是将组织置于10%的缓冲福尔马林溶液中，通常时间为24-48小时。
这个步骤的目的是保持组织的形态结构和维持蛋白质的空间位置。
2.制作切片将固定的组织切成5-10微米厚度的切片。
通常使用旋转切片机或者冰冻切片技术来进行切片。
切片后将其放置在载玻片上，通常是带有阳离子的载玻片，如聚胺脂涂层载玻片。
3.抗原恢复固定的组织样本通常会导致部分蛋白质的变性，从而减少抗体的结合能力。
为了恢复这些变性蛋白质的免疫原性，可以进行抗原恢复步骤。
这个步骤通常涉及将切片加热到一定温度，使用酶处理或者盐溶液处理。
常用的抗原恢复方法包括热蒸汽煮沸法、酶消化法等。
4.阻断非特异结合在进行抗体结合之前，需要对样本进行非特异结合的阻断。
这个步骤的目的是防止抗体发生非特异性的结合，从而降低假阳性结果的产生。
通常使用牛血清蛋白（BSA）、奶粉或者干酪蛋白等蛋白质来进行非特异结合的阻断。
5.抗体染色接下来，将切片与目标蛋白质特异性的一抗体一起孵育。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体使用什么抗体取决于试验的目的。
抗体与样本中的特定蛋白质结合后，形成抗原-抗体复合物。
6.检测与显色为了检测抗原-抗体复合物的形成，需要进行二次抗体结合。
二抗与一抗结合，并且经常标记有荧光素或着色剂，用以可视化抗原-抗体复合物。
常用的二抗有荧光标记物（如荧光素、荧光染料等）或酵素标记物（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）。
7.盖片封装在检测和显色后，将玻片放在显微镜下进行观察和分析。
可以使用透明封装剂将玻片封装，以保护样本不受污染和光照损伤。
总结：免疫组化是一种重要的实验技术，被广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
它通过特异性抗体的结合能力来检测目标蛋白质的存在、定位和相互作用。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤1.血样制备：-采集血液样本，离心分离血浆或血清。
-用PBS洗涤血浆或血清，去除杂质。
2.组织固定：-采集待检组织样本，用缓冲福迪液进行固定。
常用的福迪液包括4%的甲醛和10%的中性缓冲福迪液。
-将组织固定在玻片上，通常通过石蜡包埋来保护组织样本。
3.切片：-使用旋转式或电动切片机将固定的组织切割成5-10μm厚的切片。
-将切片放置在带有去福迪剂密封的玻片上，然后进行脱脂和重水处理。
4.抗原恢复：-将切片浸泡在适当的抗原恢复缓冲液中，以恢复切片中的抗原结构。
-常用的抗原恢复方法包括热敏感抗原恢复、酶消化抗原恢复和酸碱抗原恢复等。
5.阻断非特异性结合位点：-使用适当浓度的蛋白抑制剂（如牛血清蛋白）在切片上进行阻断，防止非特异性结合。
-将切片在室温下孵育一段时间，以使蛋白抑制剂有效阻断非特异性结合。
6.抗体染色：-添加特定的初级抗体到切片上，与待检测的特定抗原结合。
-孵育切片，使初级抗体与抗原结合。
-将切片用PBS或缓冲盐水洗涤去除未结合的抗体。
7.信号放大：-添加合适的二级抗体到切片上，与初级抗体结合。
二级抗体可标记有荧光染料、酶或金粒等。
-孵育切片，使二级抗体与初级抗体结合。
-将切片用PBS或缓冲盐水洗涤去除未结合的二级抗体。
8.检测与成像：-根据二级抗体标记的方式，使用合适的检测方法进行信号放大。
-如果使用荧光标记的二级抗体，可以利用荧光显微镜观察和拍摄图像。
-如果使用酶标记的二级抗体，可以使用底物和显色试剂进行检测和成像。
9.结果分析：-观察并分析免疫组化染色结果，评估抗原的定位和表达情况。
-可以使用计算机图像分析系统进行定量分析和比较。
10.结论和报告：-根据实验结果，得出结论并撰写实验报告。
-将实验结果与已知文献资料进行对比和解释，讨论可能的研究价值和应用前景。
注意事项：-实验过程中需严格遵守无菌操作规范，以避免交叉污染和误差。
-选用合适的正对照和阴性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化组织细胞的取材、固定、切片操作方法及要点
从大体标本上切除适量的组织材料进行研究就是取材。
取材不仅在免疫组化而且在常规病理检查中也十分重要。
用于免疫组化的组织一般取材大小为1．OcmXl．OcmX0．2cra。
取材时应剔除脂肪和钙化，否则会影响切片，出现假阳性或假阴性结果。
组织标本包括动物标本、手术活检标本、尸体解剖标本及细胞标本等，有关各种标本的取材方法分述如下。
一、动物的致死法及取材(一)致死法(1)空气栓塞法向动物静脉内注入一定量的空气，使动物很快死亡。
一般适用大动物，例如兔、犬、猫等动物。
(2)麻醉法可将浸有乙醚或氯仿(三氯甲烷)的棉球连同动物一起放人密闭容器内进行麻醉，也可用4％戊巴比妥作静脉注射，或用20％氨基甲酸乙酯做腹腔注射。
适用于鼠等小动物。
(3)断头法用剪刀剪去动物的头部，待血液流出后立即取材。
适用于小动物。
(4)去头法用重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。
(5)股动脉放血法动物麻醉后，切开股动脉放血致死。
(二)取材注意事项易变质，争取在死后半小时内取材完毕，否则免疫组化染色时会产生背景染色。
(2)切取组织使用的刀、剪要求锋利，避免来回挫动组织。
因动物组织质脆，因此夹取组织时切勿用力过重，以免挤压损伤组织。
二、尸体解剖的取材尸体解剖的取材应根据实际需要进行，一般取材部位和数量如下。
(1)心和大血管右心室一块，左心室一块，主动脉一块，取材部位可在距主动脉瓣5cm处。
(2)肺右下叶一块，切成正方形；左下叶一块，可切成长方形。
(3)肝右叶一块，切成正方形；左叶一块，切成长方形。
(3)脾一块。
(4)胰一块。
(6)肾两肾各一块，包括皮质、髓质和肾盂。
右肾一块切成正方形，左肾一块切成长(7)膀胱一块。
(8)肾上腺左、右各取一块。
(9)消化道食管一块，胃窦部一块，小肠一块，淋巴结一块，直肠一块。
(10)骨脊椎骨一块。
(11)胸腺一块。
(12)子宫宫颈和宫体数块。
(13)睾丸或卵巢各一块。
(14)脑左侧运动区一块，左侧豆状核一块，小脑一块。
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从大体标本上切除适量的组织材料进行研究就是取材。
取材不仅在免疫组化而且在常规病理检查中也十分重要。
用于免疫组化的组织一般取材大小为1．OcmXl．OcmX0．2cra。
取材时应剔除脂肪和钙化，否则会影响切片，出现假阳性或假阴性结果。
组织标本包括动物标本、手术活检标本、尸体解剖标本及细胞标本等，有关各种标本的取材方法分述如下。
一、动物的致死法及取材(一)致死法(1)空气栓塞法向动物静脉注入一定量的空气，使动物很快死亡。
一般适用大动物，例如兔、犬、猫等动物。
(2)麻醉法可将浸有乙醚或氯仿(三氯甲烷)的棉球连同动物一起放人密闭容器进行麻醉，也可用4％戊巴比妥作静脉注射，或用20％氨基甲酸乙酯做腹腔注射。
适用于鼠等小动物。
(3)断头法用剪刀剪去动物的头部，待血液流出后立即取材。
适用于小动物。
(4)去头法用重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。
(5)股动脉放血法动物麻醉后，切开股动脉放血致死。
(二)取材注意事项(1)最好在动物心脏还在跳动时立即取材，并迅速投入环保组织固定液。
脏器的上皮组织易变质，争取在死后半小时取材完毕，否则免疫组化染色时会产生背景染色。
(2)切取组织使用的刀、剪要求锋利，避免来回挫动组织。
因动物组织质脆，因此夹取组织时切勿用力过重，以免挤压损伤组织。
二、尸体解剖的取材尸体解剖的取材应根据实际需要进行，一般取材部位和数量如下。
(1)心和大血管右心室一块，左心室一块，主动脉一块，取材部位可在距主动脉瓣5cm处。
(2)肺右下叶一块，切成正方形；左下叶一块，可切成长方形。
(3)肝右叶一块，切成正方形；左叶一块，切成长方形。
(3)脾一块。
(4)胰一块。
(6)肾两肾各一块，包括皮质、髓质和肾盂。
右肾一块切成正方形，左肾一块切成长(7)膀胱一块。
(8)肾上腺左、右各取一块。
(9)消化道食管一块，胃窦部一块，小肠一块，淋巴结一块，直肠一块。
(10)骨脊椎骨一块。
(11)胸腺一块。
(12)子宫宫颈和宫体数块。
(13)睾丸或卵巢各一块。
(14)脑左侧运动区一块，左侧豆状核一块，小脑一块。
(15)脑下垂体一块，前叶或包括前后叶。
如有较严重或复杂病变时应适当增加取材数量，以便彻底检查而作出正确诊断。
三、活检标本的取材(一)常规活检标本的取材应注意病变的部位、形状、大小、颜色以及与周围组织的界限，有无完整的包膜。
取材时应取病变部位、病变的切缘、病变与正常组织交界处以及远离病灶的正常组织。
取材用的刀剪应锋利，避免挤压组织；组织的切面应平整，组织切忌过大、过厚，否则不仅浪费试剂，而且会造成固定、脱水不良而影响镜下观察。
(二)肾穿刺标本的取材进行穿刺取得组织后，立即用生理盐水或PBS冲洗数次去除血迹，并迅速判断所穿组织是否为肾组织(肾组织应为暗红色)。
当确定为肾组织后，立即将组织置于木板上，迅速测量其长度；用解剖显微镜或放大镜进行观察，以区别皮质和髓质，并观察标本是否有肾小球。
在解剖显微镜下，肾皮质较淡，皮质区可见一些分布不规则、朦胧的红色小点，此即为肾小球。
使用解剖显微镜可帮助区别组织，作出准确的判断，使肾活检可靠。
穿刺所取得的标本用手术刀片切开，并迅速固定，一半放人装有光镜固定液的青霉素小瓶，另一半放人装有电镜固定液的小瓶，均置于冰瓶保存。
(三)小标本的活检取材小标本常见为宫颈、宫膜、鼻咽、口腔、喉以及各种窥镜所取得的组织。
它们体积较小，因此取材时要用擦镜纸包起来再进行固定、脱水，特别是由胃镜、肠镜等所取的组织，取材时一定要滴上伊红，以防止丢失。
活检组织多用活检钳夹取，常因过度挤压而变形。
病灶表面有出血坏死，活检时难于采取到深部组织。
因此，活检钳的刀口必须锋利，活检时必须采取主要病灶区，尽量避开坏死区。
免疫组化组织细胞的固定凡需进行病理研究的标本均需进行固定。
将组织置于某些化学试剂中，使细胞的物质免疫组织化学实验技术及应用尽量接近于其生活状态时的形态结构和位置称为固定。
而用于免疫组化研究标本的固定不仅是使细胞的蛋白质凝固，终止或减少外源性和源性细胞分解酶的反应，防止组织细胞自溶，更重要的是保存组织或细胞的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。
不同的抗原，其抗原稳定性不同，依抗原耐受固定液的程度可分为：①不稳定性抗原，如T淋巴细胞表面抗原属此类抗原，一般以冰冻切片进行免疫组化染色；②半稳定性抗原，如B淋巴细胞的胞浆免疫球蛋白等；③较稳定抗原，例如HBsAg、HBcAg、AFP、CEA、S —100、Keratin和部分多肽类激素等，其抗原性受固定剂种类、固定时间、温度等影响不大。
固定剂的种类很多，性能不一，因此固定不同的组织应选择合适的固定剂，特别是标记半稳定抗原时，更要选择合适的固定剂和固定条件。
一、固定液的种类较好的固定液应具有强渗透力，能迅速渗入至组织部；其次不会使组织发生过度收缩变形，并能使组织易观察的成分得以凝固为不溶性物质；还要使组织达到一定硬度，有较好的折光率。
固定液分为简单固定液和混合固定液。
因目前大多数固定液都是有毒有机溶剂组成，欧美国家已不再使用，基本由环保组织固定液替代。
西奈山环保组织固定液由植物多糖、乙醇、醋组成，固定效果明显优于常规甲醛。
二、固定的方法1．浸泡法这是最常用的固定法，将取好的组织直接浸泡在固定液中，固定的时间一般在2～24h它适用于动物标本、尸检标本及临床活检标本等。
2．蒸气法比较小而薄的标本可用锇酸或甲醛蒸气固定。
主要用于血液、细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。
具体方法：在一有盖培养皿滴人1％一2％锇酸水溶液3滴，将涂片放人其中，固定30s至lmin左右，立即水洗后进行染色。
3.注射、灌注固定法主要适用于动物实验标本的固定。
将固定液注入血管，以达到充分的固定。
经血管分支到达整个组织或全身(1)局部灌注固定固定肺组织可将固定液从气管或支气管注入，注入速度不要太快，用力均匀，注入量适当，以免胀破肺泡。
固定眼球组织可从眼后房注人固定液。
固定肝、肾组织则可从肝、肾动脉注入固定液，同时切断其静脉使得血液排出。
脑组织的固定，必须先麻醉动物，分离颈动脉，注射器的针尖向着头部的方向注入固定液。
(2)全身灌注固定较大的动物往往采取输液方法，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，将另一侧相应的静脉切开放血。
固定液的输入量因动物而异，兔、猫约500～1000ml，猴、狗约1000—2000ml。
4．微波固定法近几年来微波固定法一直可见报道。
经微波固定的组织具有收缩较小、核膜清晰、染色质均匀、分辨清晰等特点，但必须严格控制微波固定的时间和温度。
免疫组化组织细胞的脱水(一)概述组织经固定和水洗后，会有大量的水分留在组织中，而水又不能与苯融合，因此必须在透明前脱去组织中的水分。
用某些溶剂将组织中的水分置换出来的过程称为脱水。
对于不同的组织应分开脱水，特别是一些易脆的组织(如肝、脾等)应严格掌握脱水时间，防止在无水酒精中停留时间过长。
对于动物组织，应比人体标本相应缩短脱水时间。
脱水应按照从低浓度到高浓度的过程，否则标本直接进入高浓度溶液中极易引起组织的强烈收缩或使组织发生变形，从而影响切片，还会造成免疫组化实验过程中的脱片。
(二)脱水剂的种类(1)乙醇最常用的脱水剂，脱水能力强，并能使组织硬化，与二甲苯能混合。
其缺点是在高浓度乙醇，特别是无水乙醇中停留时间长会引起组织收缩、变脆而影响后续的切片。
尤其是应用全自动脱水机，因是加压抽真空并加温脱水，在高浓度乙醇中停留时间更不能太长，应经试验摸索出适合自己单位脱水需要的时间，不能盲目从书本上套用脱水时间。
脱水时，应从低浓度向高浓度梯度进行。
一般是人体组织从?5％乙醇开始，对于小动物、胚胎及柔软的组织可从30％乙醇开始脱水。
只有脱水充分，才能在透明剂中透明。
若是人工脱水，必须在加盖的容器进行，尤其是高浓度乙醇很易吸收空气中的水分，阴雨天更应注意。
在透明前最好将组织取出，用滤纸吸干后再透明。
(2)丙酮脱水作用比乙醇强，但对组织的收缩也大，毒性强，价格高，因此一般不用于常规组织的脱水，主要用于快速脱水及固定兼脱水。
此时应注意个人防护，最好在带有抽风功能的装置中进行，脱水时间1～3h左右。
丙酮还可作为染色后的脱水剂，用于甲基绿—派显示DNA及RNA。
(3)正丁醇为五色液体，微溶于水，在100ml水中只能溶解8．3g，故脱水能力较弱，但能与水、乙醇及石蜡混合，因此经正丁醇脱水的组织可直接浸蜡。
它的优点是很少引起组织的收缩及变脆。
一般用法为：组织经固定及冲洗后，依次人50％、70％、80％乙醇中脱水，然后人正丁醇，12～24h后浸蜡。
使用时也应注意防护。
(4)叔丁醇异丁醇的一种，可与水、乙醇、二甲苯混合，可以单用或与乙醇混合使用，是一种使用较广的脱水剂，它不会使组织收缩或变硬，不必经过透明而直接浸蜡。
电镜上为常用的中间脱水剂。
(5)环己酮沸点为140~C，冰点为一40~C，密度与水相似，无毒，可与苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂混合，也是石蜡溶剂，可代替纯乙醇脱水后直接浸蜡，组织不会变硬，不需经二甲苯透明。
(6)松脂醇组织固定后按常规经各浓度乙醇至95％乙醇中，按下列顺序进行脱水和透明处理：①浸入等份95％乙醇和松脂醇的混合液中，待组织块下沉后转入下步处理；②95％乙醇1份加松脂醇2份的混合液中浸泡1h；③95％乙醇1份加松脂醇3份的混合液中浸泡1h；④松脂醇I、Ⅱ、Ⅲ中各浸泡1h；⑤松脂醇5份加石蜡1份的混合液中浸泡lh，然后浸蜡包埋。
多用于经乙醇或Carnoy液固定的组织。
经松脂醇处理的组织收缩较小，发生硬化也少。
中性缓冲福尔马林影响HE染色用中性缓冲福尔马林后，细胞核颜色的确不够鲜艳，可在染木素前用3%冰醋酸媒染10分钟，会有所改善。
免疫组化组织细胞的固定（续）三、固定的注意事项1．固定液的量固定组织时，必须有足够的固定液，一般为组织块体积的10～15倍。
固定用的容器必须足够大，组织材料不要太多，避免组织中的水分渗出而影响固定液的浓度。
2.固定的组织必须新鲜组织取材后应立即固定，否则，组织易收缩变形，并发生自溶现象。
3.组织块的体积组织块的体积宜小而薄，一般用于免疫组化的组织大小宜为1．OcmXl．OcmX 0．2cm。
组织太大，部得不到充分固定，导致组织结构破坏，给切片带来一定的困难，还增加非特异染色，同时浪费试剂。
4．组织固定后的冲洗组织固定后，因固定液渗到组织中，所以必须彻底冲洗，除去固定液，否则会影响下一步的脱水。
特别对于长时间固定的标本应用流水冲洗，尽可能减少色素沉着。
对于混合固定液固定的组织，更要及时冲洗，否则将影响免疫组化切片的质量。
四、影响固定的因素1．温度一般固定液固定效果随温度升高而加强，温度一般在-70～37℃之间，?以室温22℃常用。
某些酶的固定要求在37℃以下进行，而某些病毒的固定则要在低温下进行，如用丙酮在-20一-40℃之间固定30min最佳。