Dako免疫组化操作手册

Dako免疫组化操作手册
原位杂交
RICHARD HARVEY
简介
核酸作为探针用于生物材料的检测大约开始于三十年前。

目前，主要有两类核酸探针检测：固相杂交和液相杂交。

固相杂交技术分为两个类型：原位杂交（ISH)和合成支持物（synthetic support ）。

在此只详细介绍固相杂交。

最古老而应用最广泛的核酸检测方法就是固体的支持物上的杂交。

上世纪70年代出现的Southern 和Northern杂交可能是最广为人知的核酸杂交方法1,2。

其基本原理是将核酸固定于人造支持物上而保持杂交的状态。

这些核酸可以是靶核酸也可以是探针。

有趣的是，一些最近才发展起来的新技术，如基因芯片（microarrays），其实也是基于基本杂交原理上的改进。

在Southern和Northern杂交中，核酸是通过电泳分离后转移到膜上，而基因芯片则是将核酸直接点样到支持物表面的特殊区域。

其他常用的固相核酸技术还包括威力杂交和微球杂交等。

原位杂交（ISH）与固相杂交的关系密切。

其原理是核酸被固定在细胞内而不是被抽提出。

ISH 最显著的优点是可以定位杂交物在组织中的位置。

而最大缺点是由于保持了细胞的形态和结构，可以引入多种潜在的抑制成份。

历来绝大多数ISH检测都是使用福尔马林固定石蜡包埋的组织。

为了保证在这些组织片中的核酸易于杂交，常用蛋白酶进行预处理。

有报道称微波和高压灭菌器也可作为蛋白酶处理的辅助方法或替代方法使用。

标本的复杂性
选择探针和检测系统的关键因素之一是标本的复杂性。

标本越复杂，其非特异性杂交就也可能发生。

即使交叉杂交的程度很低，但如果非特异性的靶点有足够的数量，也会发生假阳性信号。

标本的复杂性主要在两个实验步骤中处理：组织处理和探针设计。

当进行Northern 和Southern杂交时，会去除污染的DNA和RNA，这样制备样品会很明显地降低其标本复杂性。

在Northern杂交中，去除核糖体RNA会使对靶mRNA的识别能力提高20-50倍。

同样地，对于ISH实验，组织预期处理可用化学法或酶法去除一些无关的核酸。

另外，如果用ISH 方法检测RNA，避免使用过强的变性条件可使对基因组DNA的交叉杂交程度减小到最低，因为通常消除RNA的二级结构的条件要比DNA变性的条件温和得多。

免疫组化自动化技术
当手工操作不再满足需要时，自动化技术自然就发展起来了。

由于大制作量的要求和对结果严格的重复性要求，使得自动化技术被许多医学科学分支，如临床化学、血液和细胞菌检查所需求，这些自动化技术在今天已被广泛使用。

尽管免疫组化技术最初被认为是过于复杂的技术而不适合于自动化，但最近几年来，这个态度却有很大程度的转变。

实际工作中的一些需求促进了免疫组化自动化技术的发展，它们是：
提高产量
提高质量和重复性
降低劳动力和材料成本
更好的标准化和不同实验室间的比较
目前市售的自动免疫组化机的类型有几方面的差异，包括玻片处理的自动化技术、每批处理的玻片数量（20-500）和试剂使用的灵活性（“开放式”或“封片式”）等。

毛细间隙法
这种方法是最早应用于玻片自动免疫组化技术的方法之一，其原理是毛细管的虹吸作用。

在该技术中，组织标片放置于两张玻片上或一张玻片、一张盖玻片上，两张玻片并排放在一起，其间留下微小预留间隙。

通常这个间隙为50μm宽，并能够保存一定量的液体，通常为150μL，因而染色结果有较好的可重复性。

在染色运行期间，玻片被部分浸于试剂，由于毛细管吸引作用导致间隙充满液体。

每个试剂
孵育结束后，玻片间隙的液体被吸水纸吸除。

在每个试剂和水洗步骤中重复灌注和吸除间隙的液体。

在操作系统中，每张玻片上都覆盖一个遮盖片，试剂通过位于遮盖片顶部的小漏管加入。

毛细间隙通过表面张力的作用保持恒定的液体量，当有过多液体时可流走并被自动清除掉。

在冲洗步骤时可用缓冲液冲洗间隙。

时刻都保持充足的液体以防止切片干燥。

这个方法有一点小缺陷就是对于某些表面张力的液体来说，毛细间隙太容易被灌注或清空。

另外在系统中使用遮盖片，通过试剂单向流过间隙，可将最大限度地减少气泡形成。

液体封片技术
另一项用于自动染色的技术是液体封片技术。

反应物在热平衡的孵育室中进行处理。

油剂用于覆盖在试剂上以防止在孵育过程中蒸发。

开放系统
其他仪器的应用均模仿手工操作过程，如，玻片放置于水平位置，加试剂时使用特氟纶包被的吸尖或用一次性吸尖。

在室温下孵育。

这个技术可以使用与手工操作相同的试剂，称之为“开放式”系统时因为可使用人和来源的试剂盒操作步骤。

病理技术自动化的需求已经扩展到了其他领域，如原位杂交技术和特殊染色技术。

但是，目前还没有发现能够满足这些领域应用的仪器出现。

由于购买自动化的机械通常是一笔巨大的投资，因而每个实验室都应考虑以下问题：
玻片容量由于不同仪器的破片处理数量不同，所以应当仔细考虑目前和将来的玻片处理量。

人员估测自动化对时间和人力安排的影响
灵活性有些实验要求以一般实验室使用更为灵活的步骤和试剂。

这时应考虑使用开放试剂系统而不是封闭系统
可提供的实验台空间有些仪器需要更大的实验空间，应考虑实验室是使用一台较大的仪器还是使用几台较小的仪器好。

选择供货商实验室的特殊需求则必须选择好的供货商提供。

仪器
的原价、试剂和软件以及维修质量都是重要的选择条件。

将来，临床实验室检查会普遍地应用自动化技术，自动化技术的高效性会给患者提供更好的服务。