血检四项化学发光法调查

血检四项化学发光法调查
目前血检四项（HBsAg、HCV、HIV、TP）的检测方法主要有酶联免疫（ELISA）、核酸扩增（PCR）、胶体金标记、以及化学发光（CLIA）。

现就CLIA在血检项目中的应用情况做一调查分析。

一．化学发光免疫分析法简介。

化学发光免疫分析法(Chemiluminescence imnunoassay，CLIA)是建立在放射免疫分析技术(radioimmunoassay，RIA)理论的基础上，以标记发光剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。

CLIA是利用化学反应中释放大量自由能，产生激发态中间体，当其回到稳定的基态时发射出光子（hν），用发光信号测量仪对所发出的光量子进行定量测量。

鲁米诺(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim ester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。

表1 化学发光法类型
注：* 严格意义上属于荧光免疫。

二．国内外化学发光法的仪器和试剂情况。

国外化学发光法检测仪器的生产厂家以贝克曼、雅培、罗氏、拜耳这四家的市场占有率
较高。

其中罗氏拥有唯一的电化学发光技术，雅培则独占微粒子酶联免疫（EMIA）。

不同厂家的仪器有各自的优势检测项目，主流的仪器型号如下：
表2 国外主要化学发光免疫分析仪厂家
国内也逐渐有厂家研制化学发光试剂，配合国外引进的仪器（多为半自动）共同销售，也有自发研制的化学发光仪（泰格科信）。

针对血检四项（HBsAg、HCV、HIV、TP），除北京科美生物（科美东雅）外，所有厂家试剂均只有HBsAg试剂。

表3 国内主要厂家仪器和试剂情况
国外厂家的试剂大多随仪器配送，并没有在SFDA单独注册。

目前SFDA注册的血检四项化学发光法试剂列表如下。

就检测项目来看，除梅毒外，其余三项均可使用化学发光法；就现有资料，国内外只有北京科美东雅配有梅毒检测试剂。

表4 SFDA注册的血检四项试剂
三．化学发光法的优势及劣势。

上世纪70 年代末，Halmann 和Vela首先把化学发光(CL)与酶免疫反应结合起来，建立了化学发光酶免疫分析法(CLIA)。

目前，它已成为生命科学研究中的一个重要的分析手段，
广泛应用于核酸分析、蛋白质分析、免疫分析、进行基因分析、发光成像分析、细胞分析等方面。

其主要优势有：
1. 低检测限（高灵敏度）：就HBsAg检测，国内ELISA试剂检测限平均为0.5ng/ml，而胡国茂等试验显示化学发光检测限可达0.1ng/ml。

Thoai Duong Ly.等对欧洲常使用的HbsAg检测试剂进行评测，检测线检测（HbsAg含量为0.04ng/ml—
2.24ng/ml的系列血清）结果显示各试剂盒灵敏度均低于0.2ng/ml。

值得注意的是，伯乐公司的Monalisa Ultra酶联免疫试剂盒达到了0.08ng/ml，甚至优于化学发光类仪器的检测。

王丽梅等也证实Abbott 的Murex HBsAg酶免试剂盒也可达到0.1ng/ml检测限。

可以说，化学发光灵敏度只是优于目前的国内产品，单从技术角度，ELISA应和化学发光法等优。

表5 五种HBsAg检测试剂灵敏度评价
高的灵敏度检测能及早检出HBsAg，确证乙肝病毒感染，在病程观察中大大缩短“窗口期”时间。

另外，电化学发光法定量检测，克服了定性对灰区结果的判断困难，对灰区结果能做出明确客观的评价和判断。

2. 宽的线性范围：一般来说，ELISA的检测范围为2-3个数量级，而化学发光可以达到4～6个数量级，且为线性范围。

这说明不仅能检测低浓度，对高浓度样本同样具有良好的检测能力，并减少了出现钩状效应的几率。

3. 分析速度快：由于采用自动化（半自动化）仪器，除去开机稳定、定标等时间，一般半小时内可以得到第一个标本结果，一小时可以出结果50-100个，这对于医院急诊病人非常重要。

表6 几种化学发光免疫分析仪性能比较
4. 高稳定性：由于全自动化操作，避免了人为的影响因素，结果的重复性很高。

章火
祥使用卫生部定值血清HBsAg项室内质控血清，对Roche的2010化学发光免疫分析仪和厦门新创的ELISA试剂盒进行比较，结果显示cv值：ELISA法批内3％一5％，批间5％一10％，而ECL法批内小于3％，批间小于5％。

马蔡昀对Roche的2010化学发光免疫分析仪和科华的ELISA 试剂盒进行比较，结果亦显示电化学法比ELISA法的批内、批间cv值均小。

5. 操作便捷：全自动化仪器，多数仅需加入一种试剂。

虽然化学发光法是标记免疫技术的一项重要发展，也逐渐占据了主流市场，但并不是说没有其局限性。

尤其是针对不同的检测项目，不同的地域差异，化学发光法并不能一统天下。

ELISA法、金标法、甚至放免法仍有广阔的用武之地。

1. 不适于检测大量标本：自动化仪器虽然适宜于急性结果的报告，但对于大量样本的检测，显然ELISA发更具有优势。

目前大型医院的门诊和住院标本采用仪器检测，而体检标本（200-400人/次）均采用ELISA法检测，这当然和检测费用以及结果的不急需有关。

2. 检测费用高：根据北京市医疗服务收费标准。

从下表可以看出，化学发光法的收费基本上是普通ELISA的5-7倍。

这样的价格主要是由于昂贵的仪器以及后继的试剂消耗。

国外厂家的封闭试剂造成了一定的垄断，也导致了价格的虚高。

表7 北京市一些免疫检测项目收费情况
3. 仪器维护需要专业人员：检验科医生经培训应能对仪器进行操作和简单维护，但由于仪器故障造成的试剂、标本浪费、报告延迟也会发生。

这一点上，简便快捷的ELISA、金标法应具有很大优势。

四．化学发光在血筛中的应用前景。

根据《采供血机构质量管理规范》，我国的国内血液筛查项目及检测方法如下表。

《规范》规定所有初筛（批批检四项检测）反应性标本必须使用与最初检测相同的试剂和方法进行双次复检。

两次复检结果均为无反应性，该血液和所制备的血液成分可以放行。

表8 我国血站血液筛查检测项目
ELISA法仍是主要的筛查方法，ELISA方法简便、快速、可大量检测，且随着技术的不断改进，灵敏度/特异性也逐步提高。

但也存在着一些问题，如(1)低滴度血清敏感性问题，如“窗口期”低滴度HBsAg的检测；(2)突变株的检测，如现有的HBsAg检测试剂均采用单克隆抗体，新的突变株不断出现，如何检测这些突变株。

(3)ELlSA检测试剂H00K效应和非特异性反应问题。

化学发光法虽然灵敏度上优于ELISA法，但原理上属于同一大类（抗原抗体反应），对早期的感染也不会反应，对突变逃逸和ELISA面临同样的挑战，且目前对感染窗口期的检测能力也并没有过多的文献研究。

化学发光方法学上又分为许多类型，日后的标准制定也会有一定困难。

目前部分地区也开始采用了PCR方法。

免疫学检测以上三种病毒（HBV、HCV、HIV）的平均窗口期分别为：HBV：56天，HCV：70天，HIV：22天。

在理论上，核酸检测（Nucleic acid test，NAT）技术能够显著的缩短病原体检出的窗口期。

另外，NAT技术灵敏度和特异性均较显著的高于免疫学方法。

核酸检测HBV，HCV，HIV病毒的窗口期较抗体检测分别提前：9天、25天、14天。

但分子检测技术本身也存在一些问题：(1)汇集样本池的大小多少合适?(2)PCR 引物的有效性。

能否检测亚型和突变株感染?(3)PCR扩增反应中抑制物的影响和控制；(4)试验的假阳性和假阴性问题等。

我国的血液筛查还存在一个经济成本问题。

目前每份血样的病毒筛查费用是10-15元/遍，化学发光法应为30-50元/遍，而如果要采用NAT，费用将上升到200-300元，这将极大的限制NAT的实际应用。

解决这一问题的方法，就是大幅度提高NAT试剂的灵敏度，以实现对10至12份血样的混合检测（pooling），这样，平均每份血样的病毒筛查费用将下降，为实际推广应用铺平道路。

五．小结
综合来看，化学发光是一类逐渐成熟，且必将在一段时期占据市场的检测方法，随着经济水平的提高，越来越多的医疗机构已经引进了此项技术。

随着我国对血液制品的管理严格，
血液筛查需要引入更灵敏、可靠的方法，从国际经验来看，NAT技术应是首选。

化学发光和ELISA都需要提高技术，对抗原/抗体进行不断改进。

ELISA的优势是价格便宜，适于大量检测；化学发光的优势是自动化。

附：
表9 血检四项试剂SFDA注册情况。