结核分枝杆菌16kD-38kD-19kD融合蛋白的构建、表达及纯化

结核分枝杆菌16kD-38kD-19kD融合蛋白的构建、表达及纯

化

摘要】目的：构建结核分枝杆菌（MTB）16kD-38kD-19kD融合基因重组质粒，

并对融合蛋白进行表达及纯化。方法：利用PCR方法分别扩增16kD、38kD及

19kD基因，经过双酶切依次与pET28a载体连接，构建pET28a-16kD-38kD-19kD

融合基因重组质粒，转化至大肠杆菌表达株BL21中，经IPTG诱导获得目标蛋白，并进行镍柱纯化。结果：经过酶切及测序鉴定证实pET28a-16kD-38kD-19kD重组

质粒构建正确，并经原核表达及纯化获得融合蛋白。结论：成功构建并表达纯化16kD-38kD-19kD融合蛋白，为结核病特异性诊断抗原的开发奠定了基础。

【关键词】结核分枝杆菌；16kD蛋白；38kD蛋白；19kD蛋白；融合蛋白

【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）10-0221-03

Construction, Expression and Purification of Recombinant Fusion Proteins 16kD-

38kD-19kD of Mycobacterium tuberculosis

【Abstract】Objective To construct the recombinant plasmid of Mycobacterium tuberculosis (MTB) 16kD-38kD-19kD fusion gene, and to express and purify the fusion protein.Methods: 16 kD, 38 kD and 19 kD protein genes were amplified from the genome of Mycobacterium tuberculosis by PCR, and inserted into the pET28a vector after restriction enzyme digestion. PET28a-16kD-38kD-19kD recombinant plasmid was constructed and transformed into E.coli BL21, and the target protein was induced by IPTG, then the purified protein was obtained by Ni-NTA affinity chromatography. Results PET28a-16kD-38kD-19kD recombinant plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing, and the fusion protein was obtained by prokaryotic expression and purification.Conclusion Construction, expression and purification of

16kD-38kD-19kD fusion protein, which lays the foundation for the development of the tuberculosis specific antigen.

【Key words】Mycobacterium tuberculosis; 16 kD protein, 38 kD protein; 19 kD protein; Fusion protein

结核病（TB）是危害人类健康的一种重要传染病，发病率及病死率居高不下。在我国结核病人数量位居世界第二，仅次于印度，对公共卫生体系造成沉重负担。准确、快速的对结核分枝杆菌感染进行诊断是肺结核防治的重要一环，目前结核

病诊断仍主要依赖于临床观察、痰涂片检测以及细菌培养，但是涂片阳性率低而

且培养耗时过长影响检测的效率，因此，近年来血清免疫学诊断以简单、快速、

经济等优点受到重点关注。近年来人们对MTB培养液进行较多研究，并分离出多种蛋白，如Ag85、16kD、38kD、19kD、CFP10等，但是单一抗原的血清学诊断敏感度有限，难以区分患结核病以及结核菌感染人群[1-3]。本研究分别扩增了16kD、38kD、19kD基因片段并依次构建于原核表达载体形成融合基因，并在大肠杆菌中成功表达及鉴定，为结核病的临床诊断提供一个候选抗原。

1.材料及方法

1.1 主要材料及试剂

结核分枝杆菌标准株H37Rv菌体来源于沈阳市胸科医院，原核表达质粒

pET28a购自Novagen，Taq DNA聚合酶、pGM-T连接试剂盒、DNA快速纯化试剂盒、基因组提取试剂盒、质粒小提试剂盒、DNA Marker、蛋白Marker购自天根

生化（北京），核酸内切酶NdeI、BamHI、EcoRI、HindIII均购自Promega（美

国）。引物委托上海生工合成。

1.2 引物设计与合成

根据GenBank中发表的16kD、38kD以及19kD基因序列设计特异性引物如下：16kD上游：5’-GGAAGGCATATGAACAATCTCGCATTGTGGTCGC-3’（含有Nde I位

点及起始密码子）；16kD下游：5’-TTATTAGGATCCTCCGCCACCCTTCGTGATGGCGATG-3’（含有BamH I位点及Linker）；38kD 上游5’-GCTGACGGATCCGTGAAAATTCGTTTGCATAC-3’（含有BamHI位点）；

38kD下游：5’-GTATTAGAATTCGCTGGAAATCGTC GCGATC-3’（含有EcoRI位点）；

19kD上游：5’- AATAGAATTCGGAGGTGGCGGTAGTGTGAAGCGTGGACT GA-3’（含有EcoRI位点及Linker）；19kD下游5’- GTCCGGAAGCTTTTAGGAACAGGT CACCTCGATTTCG -3’（含有HindⅢ位点）。

1.3 目的基因扩增

参照试剂盒说明书对结核分枝杆菌进行基因组提取，并以之为模板，分别利

用相应引物扩增目的基因16kD、38kD以及19kD，PCR反应条件：95℃预变性

5min，95℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环数29，72℃10min，产物经1.5 琼脂糖凝胶电泳鉴定。与pGM-T载体进行T-A克隆，转化大肠杆菌克

隆菌株XL进行扩培，提取质粒进行测序鉴定。

1.4 重组质粒构建

首先对pGM-T-16kD及pET 28a质粒分别进行双酶切（Nde I/BamH I）、纯化

回收16kD片段及 pET 28a线性片段，经连接酶体系进行重组，获得pET 28a-16kD

重组载体，继续与pGM-T-38kD质粒进行酶切（BamH I/EcoR I）、连接构建pET

28a-16kD-38kD重组质粒，进一步与pGM-T-19kD质粒进行分别酶切（EcoR I/Hind Ⅲ）、连接，最终获得pET 28a-16kD-38kD-19kD基因融合质粒，对重组质粒分别

进行双酶切鉴定。

1.5 融合基因的诱导表达及纯化

将重组质粒转化至表达菌株BL21中，平板划线挑取菌落接种于液体培养基中，继续扩大培养，2%接种于200ml含有卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡培养，当OD600达到0.8左右时，加入0.5mM IPTG进行诱导蛋白表达，30℃诱导

时间为10h，诱导结束后菌液10000 g离心收集菌体，超声破碎收集上清蛋白，Ni 柱纯化，SDS-PAGE电泳鉴定纯化结果。

2.结果

2.1 目的基因的PCR扩增

应用所合成的各种引物，以MTB H37Rv基因组DNA作为模板，经PCR扩增，分别获得16 kD、38 kD以及19 kD 3种目的基因片段，并含有各自酶切位点以及Linker，与预期片段大小相一致，图1。分别插入T载体，选择鉴定为阳性的重组

质粒送由上海生工测序，分别与基因库中报道目标基因序列一致。

M：蛋白分子量Marker；lane 1：超声后总蛋白上清；lane 2：纯化后16 kD-

38 kD-19 kD蛋白

3.讨论

结核病至今仍是全球范围内最具威胁的传染病之一，在中国，对于结核病的

防治仍然很重要，快速、灵敏而有效的诊断在其中意义重大[4]。由于多数活动性

肺结核患者体内存在多种抗MTB抗原的抗体，因此应用多种抗原联合检测是诊断结核病的更有效的方法，目前市面上的结核病诊断试剂多为单一抗原，应用于结