RNA的提取总结

一、总的RNA的提取
基础知识：
(1)DEPC：中文名为焦碳酸二乙酯。

分子式为C6H10O5，分子量为162.14。

是一种强烈的RNA酶抑制剂。

它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

DEPC水一般是指千分之一浓度的DEPC,在搅拌器上搅拌至完全溶解，即看不到“油珠”为止，DEPC气味芳香浓烈，强挥发性，有毒，需在通风橱中操作。

(2)RNA分子：
哺乳动物细胞有3种rRNA：28S、18S和5S。

一个典型的哺乳动物细胞含有10-5μg RNA，其中80～85％为rRNA，其余15～20％主要由各种类型的低分子量RNA组成(tRNA、核内小分子RNA等)，这些高丰度的RNA分子具有确定的大小和核苷酸序列、并能用电泳、密度梯度离心、阴离子交换或高效液相层析等技术分离纯化。

mRNA与上述RNA不同，其含量为细胞总RNA的1～5％，大小和核苷酸序列各不相同，从数百至数千碱基不等。

..多数真核细胞mRNA在其3端均有一poly(A）尾，使得mRNA可以通过挂有oligo(dT)-纤维素的亲和层析柱分离纯化，获得的异源性分子集群的总体，可编码细胞内所有的多肽。

RNA酶变性剂
RNA酶：水解RNA。

•含有链内二硫键，使其能抵抗长时间的煮沸和温和变性剂。

另外，变性后可迅速折叠，目前，尚无RNA酶失活的简易办法。

•该酶不需要二价阳离子激活，难以被金属离子鳌和剂（EDTA）失活。

——只好避免污染！
用强烈变性剂，如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。

..RNA酶可耐受多种处理(例如煮沸)而不失活，但却会被4 mo1/L硫氰酸胍和β-疏基乙醇等还原剂所灭活。

因此可联用上述试剂，从组织中提取完整无损的RNA
实验准备工作：
器具和试剂的消毒..
（1）尽可能使用无菌、一次性塑料制品，已标明RNase-Free且未开封过的塑料制品，不必再进行其他处理，对于国产塑料制品，应按下列方法进行处理：在一玻璃烧杯中注入含终浓度为0.1%DEPC的去离子水，将要处理的塑料制品浸泡其中12小时以上，弃DEPC水溶液，适温烘烤干燥已处理过的塑料制品，再经103.4kPa，121℃高压灭菌15分钟，70-80℃烘烤干燥即可使用..
（2）所用的玻璃器皿，置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。

..凡是不能用高温烘烤的材料，如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，再用蒸馏水冲净。

（3）DEPC：..DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。

..DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。

（4）试剂也可用DEPC处理：加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。

但DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。

（5）Tris溶液：用DEPC处理的水配制，然后高压灭菌。

配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。

.（6）除DEPC外，也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。

（7）此外，为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需经硅烷化处理。

实验原理：
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍和酚等物质，能迅速破碎细胞和溶解细胞中的其它成分，抑制细胞释放出核酸酶，维持细胞中RNA的稳定，加入氯仿离心后，RNA进入水相，再用异丙醇沉淀水相中的RNA，即可达到提取总RNA的目的。

实验步骤（Trizol法提取总RNA）：
1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100 mg组织加入1mlTrizol液（观察：液体变粘稠，细胞脱壁），注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10% ，否则会出现DNA的污染。

2、研磨液室温放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体，然后以每1mlTrizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。

3、室温静置2-3分钟后,12000g 离心10分钟4℃，离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，上面是无色的水相。

RNA只存在于水相中。

水相占总TRIZOL的60%。

取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5 ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g 离心10分钟4℃，观察总RNA
在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别丢了沉淀）。

4、按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇（用DEPC水新配制），涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。

..
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。

部份溶解的RNA样品其A260/280 ratio < 1.6然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟，测定OD值（OD260/280值在1.8-2.0视为纯度很高）。

RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

6、电泳
影响RNA提取的因素：
（1）样品破碎及裂解
动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。

期间动作快速，样品保持冷冻。

样品量适当，保证充分裂解
为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量
（2）纯化：
在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；
RNA提取常见的问题：
（1）RNA降解
❑新鲜细胞或组织：
裂解液的质量
外源RNase的污染
裂解液的用量不足
组织裂解不充分
另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA 的降解。

建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。

❑冷冻样品：
样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。

样品要相对小一点；
先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；
样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。

（2）OD260 /OD280比值偏低
❑蛋白质污染：
不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。

减少起始样品量，确保裂解完全、彻底
解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。

❑苯酚残留：
不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。

解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。

❑抽提试剂残留：
确保洗涤时要彻底悬浮RNA，并且彻底去掉75% 乙醇。

解决办法:再沉淀一次后，溶解。

❑设备限制：
测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在0.10 - 0.50 之间。

此范围线性最好。

❑用水稀释样品：
测OD 时，对照及样品稀释液请使用10 mM Tris，pH 7.5。

用水作为稀释液将导致比值的降低。

（3）电泳带型异常
❑非变性电泳：
上样量超过3ug，电压超过6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致28S 和18S 条带分不开。

❑变性电泳条带变淡：
EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；
甲醛的质量不高。

（4）下游实验效果不佳
❑RNA 降解
❑抽提试剂的残留
75% 乙醇洗涤
❑样品中杂质的残留
多糖等杂质，再次沉淀
❑DNA 污染
使用RNase-Free 的DNase I 消化抽提RNA
实验中常见问题及原因分析：
1.RNA的产量低
可能的原因：
1）RNA溶解不完全；
2）离心速度过大（大于12000g）;
3）加入Trizol reagent后，匀质化不完全，应在室温下放置一段时间后，再加入氯仿。

2.RNA降解
可能的原因：
1）加入Trizol reagent以前，细胞处理步骤过多，改正：弃尽上清，直接加入Trizol reagent，室温放置即可；
2）不正确的储存方法：应存于-70°C，而不是-20°C。

3.A260/280少于1.65
可能的原因：
1）加入Trizol reagent量不够，而使细胞匀质化不完全；
2）溶解RNA的溶液偏酸。

注意事项：
（1）由于mRNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。

（2）.所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。

（3）.整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

（4）.加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

（5）.RNase酶是导致RNA降解的最主要的原因，它广泛存在于人的皮肤上，而RNase酶非常稳定，用常规的高压蒸汽灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase酶完全失活，因此，实验时一定注意戴手套，同时所有的实验用具需经0.1%的DEPC水处理12小时以上，以去除RNase酶。

（6）.Trizol reagent、氯仿、DEPC水是剧毒物质，要注意防护。

在吸取浓DEPC水，或用DEPC水处理塑料制品时，要注意在通风柜中进行。

（7）操作时不要讲话。

二、从总的RNA中提取mRNA
基础知识：
mRNA纯化缓冲液：
1×层析柱加样缓冲液；20mmol/LTris·Cl(pH7.6)，0.5mol/LNaCl，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.1% SDS。

灭菌洗脱缓冲液：10 mmol/LTris·Cl(pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。

mRNA分离纯化原理：
利用mRNA3‘末端含有多聚(A)+ 的特点，当分离的总RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。

经过两次oligo(dT)纤维素柱，可得到较纯的mRNA。

（利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点，合成一段Oligo（dT）引物，根据碱基互补配对的原则，可将mRNA从总RNA中分离出来。

）(分离的总RNA 可利用mRNA3’端含有poly(A)的特点，用oligo(dT)纤维素柱分离，当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA 被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。

然后经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。

纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

)
纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

方法一oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA的步骤：
1、用0.1mol/LNaOH悬浮0.5-1.0goligo(dT)纤维素。

2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。

3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。

4、将提取的总RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析加样缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。

5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD260为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。

6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。

7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。

8、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。

9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。

10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。

Rapid mRNA Purification Kit (Amresco Inc.)
A.用rapid mRNA binding buffer悬浮活化的oligo(dT) cellulose
B.取100ul (最多25ug, 1/5样品), 在75℃下保温2min.
C.悬浮活化的oligo(dT) cellulose
D.加100ul的样品与20 ul oligo(dT) cellulose混合, 冰上放置5min, 每一分钟混匀一次. 离心10秒钟(不要太长!)
E.去上清, 加200ul Rapid mRNA wash buffer, 混匀. 在沉淀前, 离心10秒钟(不要太长!)
F.重复步骤E.
G.去上清, 加无RNase的水20ul. 混匀后在75℃下保温30秒钟
H.在沉淀前, 离心10秒钟(不要太长!), 转上清液到一个新的离心管中.
I.在沉淀中加20ul无RNase的水20ul. 混匀后在75℃下保温30秒钟. 在沉淀前, 离心10秒钟(不要太长!)
J.合并步骤H和步骤I 得到的上清液.
保存于-80℃冰箱.
方法2
1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 ul。

2）、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。

用Tip打匀或用手弹匀。

3）、70℃水浴，3分钟（裂解RNA的二级结构）。

4）、20-30℃条件下，静置10分钟（让Oligotex与mRNA结合）。

5）、高速离心2分钟，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50 ul的上清在原管里。

6）、用Buffer OW2 400 ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟。

7）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400 ul到柱子，高速离心1分钟，丢掉滤过液。

8）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100 ul热的（70℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1分钟。

9）、为保证最大的mRNA产量，可再次重复第8步。

10）、电泳。

mRNA试剂盒使用步骤
1.将RNA放到一个新EP管中，并用无RNase的水或者DEPC水添加至200μL。

再向EP管中加入200μLmRNA Binding Buffer，使用涡旋仪
混合均匀。

注意：如果是使用总RNA，则最多使用RNA的量为1mg。

2.将RNA混合液转入一个装有50mg oligo（dT）-cellulose 的EP管中并用涡旋仪混合均匀。

然后放入70℃水浴3min。

3.将（2）中的样品放在室温下（20-30℃）使用涡旋仪混合均匀30min（或者每隔5min使用涡旋仪混匀一下）。

（实际操作时：把样品放在恒温振荡器中600r/min，每个5min用旋涡仪振荡一次。

）
4.将（3）中的匀浆放入一个空的spin-column中，spin-column放在试剂盒中的离心管（collection-tube）中。

室温下1000g离心1min。

弃
滤液。

（匀浆可以用枪头拨入spin-column管中）
5.将spin-column放在（4）中离心管中，加入500μL mRNA wash buffer。

用枪头吹打几次混匀，室温下1000g离心1min。

弃滤液。

（静置了一会儿）
6.将spin-column放到一个2mL EP管中。

加入400μL mRNA Elution buffer（70℃预热）并用枪头吹打使沉淀分散均匀。

离心。

并将滤液转
到一个新的1.5mlEP管中，再加一下次mRNA Elution buffer（70℃预热）于spin-column 中混合均匀，离心到第一次相同的2ml EP管中。

7.两次的洗脱液混合，测量其体积。

加入1/10体积的3 M NaAc（pH=5.2）混匀，然后加等体积的异丙醇，涡旋混匀。

放- 20℃静置至少
30min。

实际操作时：加650μL混合液于1.5mlEP管中（用枪头将余液吸干净时避免碰到沉淀。

）
8.至少12000g 4℃离心20min，弃上清。

用80%的预冷乙醇洗涤RNA。

用涡旋仪混匀，然后不超过7500g 5min 4℃。

9.弃上清，干燥沉淀5min 或使用吸水纸将液体吸干。

10.用无RNase的水或者DEPC水溶解沉淀。

（10μL/100mg tissue）。

（加10μL DEPC水）
注意事项：
1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

..
2、oligo(dT)纤维素柱用后，可用0.3mol/lNaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。

每次用前需用NaOH、水、层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。

3、OD260溶液RNA含量约为=40μg／ml
反转录
mRNA 8μL
dNTP 1μL 65℃5min 然后迅速放在冰上。

oligo dT 1μL 注：（上述处理模板RNA变性，提高反转录效率）
10μL
上述产物10μL 然后放在pcr仪中
5 x PrimerScriptⅡBuffer 4μL 45℃30min
RNase Inhibitor 0.5μL 99℃5min
PrimerScript ⅡRT ase 1μL 5℃5min
H2O 4.5μL
20μL。