翡翠贻贝内脏团抗氧化防御系统对菲胁迫的生物响应

翡翠贻贝内脏团抗氧化防御系统对菲胁迫
的生物响应
杨涛1,2，陈海刚1，蔡文贵1，秦洁芳1,2，贾晓平1**
（1中国水产研究院南海水产研究所，广东省渔业生态环境重点研究室，农业部南海渔业资源环境重点野外科学观测实验站，
广州510300）
( 2上海海洋大学海洋科学学院，上海201306）
摘要实验室条件下研究了海水中不同浓度（2.0、10.0、50.0 μg L-1）菲胁迫1、4、8、15 d和清水恢复2、7 d后翡翠贻贝（Perna viridis）内脏团中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CA T）活性和丙二醛（MDA）含量的变化。

结果表明，翡翠贻贝内脏团CAT活性在第1 d即受到显著诱导(P<0.05)，对菲胁迫的反应非常敏感；SOD活性和GSH-Px活性对菲胁迫的生物响应呈先诱导后抑制的变化规律，而MDA含量随曝露时间延长呈现上升的趋势，且浓度越高，这3种指标的变化趋势越明显。

因此翡翠贻贝内脏团中SOD、GSH-Px、CA T 活性及MDA含量均适合作为菲污染对水生生物毒性效应的指示指标。

在清水恢复阶段，相对于对照组各指标均表现出一定程度的恢复，也表明翡翠贻贝能对一定程度的菲胁迫带来的氧化损伤进行自我修复。

图4 表1 参19
关键词菲；翡翠贻贝；内脏团；SOD；GSH-Px；CAT；MDA
Biological Effects of Phenanthrene on the Antioxidant Defense System of Viscera in Green-lipped Mussel(Perna viridis)
YANG Tao1,2, CHEN Haigang1, CAI Wengui1, QIN Jiefang1,2, JIA Xiaoping1** (1South China Sea Fisheries Research Institute, CAFS; Key Laboratory of Fishery Ecology Environment, Guangdong Province of China；Key Field Scientific Experimental Station of South China Fishery Resource and Environment, Ministry of Agriculture, Guangzhou
510300, China）
(2Marine Science college of Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)
Abstract Changes on activities of antioxidantive enzymes (SuPeroxide dismutase (SOD),Glutathione Peroxidase (GSH-Px),Catalase (CAT)) and content of malondialdehyde(MDA)in viscera of green-lipped mussel （Perna viridis）were studied after exposured with different phenanthrene concentrations of 2.0、10.0、50.0 μg L-1 for 1、4、8、15 days and then transferred to clean seawater for 2、7 days under experimental condition. Among the results, the CAT activity in viscera of green-lipped mussel was very sensitive as a result of being induced at 1 d after exposured (P<0.05). The variances on activity of SOD are in accordance with GSH-Px, which followed a induced-inhibited trend. However, the contents of MDA increased during the whole exposured time, and reached the peak level after 15d expusured, and it will be more significant when its concentration is higher for this three indicators. As a result, SOD、CAT、GSH-Px activity and MDA content are suit for monitoring the oxidative damage of aquatic life by phenanthrene exposure. The four indicators recover to the control level after transferred to the clean seawater for 7 days, which illustrate that green-lipped mussel can make a good self-repair to
收稿日期Received:2010-8-24 接受日期Accepted:
―科技部科研院所社会公益研究专项(2005DIB3J021)，广东省科技计划项目(2009B030600001)，中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2009YD01)，中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2010YD04)，中国水产科学研究院淡水生态与健康养殖重点开放实验室开放课题(2010FEA03006) Supported by the Ministry of Science and Technology of China (2005DIB3J021),Science and technology projects of Guangdong Province(2009B030600001),Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund(2009YD01), Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund(2010YD04),Key laboratory of fishery ecology and healthy culture open subject,CAFS(2010FEA03006)
**通讯作者Corresponding author (E-mail: jxp60@)
phenanthrene stress. Fig 4, Tab1, Ref 19
Keywords phenanthrene; green-lipped mussel(Perna viridis); viscera; superoxide dismutase(SOD); glutathione peroxidase (GSH-Px); catalase (CAT); malondialdehyde(MDA)
近些年来，由于石油泄露、城镇污水排放以及煤燃料的不完全燃烧，水体环境中的PAHs(多环芳烃类化合物)污染日趋严重，而菲这种典型的PAHs化合物，在水体中的分布也已相当广泛，在我国，辽河流域中检测到的菲含量为4.44 ~25.04 ng g-1，长江流域为16.78~64.11 ng g-1，而珠江三角洲地区河流表层菲含量则高达1460.61ng g-1 [1,2]。

菲对水生生物具有很强的毒性，而且具有环境激素的性质。

Correia发现，在高浓度的菲曝露条件下，鲫鱼表现出昏睡，行为迟钝的现象[3]。

Hannam等学者通过研究发现，菲能通过降低细胞膜的稳定性和吞噬能力，继而对大海扇蛤的免疫能力造成不利影响[4]；徐文菊等通过菲对鳗鲡进行14天的水体曝毒后，观察到鳗鲡肝脏细胞肿大，细胞核边缘化或者消失，脾脏血红细胞数增多，部分组织发生坏死的现象[5]。

黄菲等在菲对斑马鱼的水体曝露实验中，发现菲对斑马鱼的繁殖行为、受精率以及产卵量有显著的抑制作用[6]。

PAHs等有机污染物在生物体内代谢时会产生自由基,进而引起抗氧化防御系统酶活的变化，SOD(超氧化物歧化酶)、GSH-Px(谷胱甘肽过氧化物酶)和CA T(过氧化氢酶)在污染物的生态毒理学研究中已经得到了广泛的应用[7]。

王辅明等在五氯酚对鮈鲫的曝毒实验中，发现SOD活性能有效的反映污染物对生物抗氧化系统的氧化损伤，可以作为评价五氯酚对水生生物毒性效应的敏感指标[8]；李康等在对鲫鱼腹腔注射苯并[a]芘后，发现SOD和GSH-Px对污染物最为灵敏，也可应用于生物监测体系中[9]。

但不同污染物作用的结果有很大的差异，以抗氧化防御系统作为水体污染的生物监测指标，还存在很多问题，需要进行更多的基础研究。

本文以翡翠贻贝为生物材料，通过观察菲静态曝露和清水恢复条件下翡翠贻贝内脏团中SOD、GSH-Px 和CA T活性和MDA含量的变化，探讨菲的致毒机理，为研究菲污染对海洋生物和海洋生态环境的影响提供更多理论依据。

1材料与方法
1.1实验材料
从海南陵水新村港附近育苗场采购体色鲜艳、大小均匀、平均壳高5.0±0.5 cm、体重15.58±2.89 g的翡翠贻贝为实验对象。

实验容器采用底部半径0.4 m，高1.2 m，容积为600 L的玻璃钢圆筒。

翡翠贻贝暂养7 d，日换水1／2，养殖密度为200～300个m-3，期间连续充气，并投喂螺旋藻粉。

实验海水取自育苗场附近，经沉淀池沉淀和砂滤后待用，海水盐度为34～36，pH为7.7～7.9，水温为22～25 ℃。

菲（phenanthrene）为分析纯，购于美国Sigma公司。

丙酮为分析纯，购于广州化学试剂公司，其它试剂均为分析纯。

SOD、CAT、GSH-Px、MDA和蛋白质测试试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验方法
1.2.1 浓度设置首先用丙酮溶解菲，配成1 g L-1的储备液。

根据预实验结果，设置2.0、10.0、50.0 µg L-1和丙酮对照（丙酮体积比<0.01%）4个浓度组，每组放入35只翡翠贻贝，设三个平行实验组，每48h 完全更换实验溶液1次。

昼夜充气，采用自然光照，每天定时投喂螺旋藻粉。

实验期间，及时捞出死亡的贻贝个体。

1.2.2组织匀浆的制备分别在菲曝露的1、4、8、15 d和清水恢复后2、7 d从各浓度组随机取5只贻贝个体，迅速解剖取出内脏团组织，用预冷的生理盐水漂洗去血液，再用滤纸吸去表面水分。

准确称取内脏团0.4 g置匀浆器中，加预冷的Tris-HCl缓冲液(pH=7.5)1 mL，在1~4 ℃的冰水浴下匀浆，再用Tris-HCl 定容到4 mL，然后于冷冻离心机（0~4 ℃,3 500 r min -1）离心15 min，取上清液待测。

1.2.3 酶活测定各指标测试方法均按试剂盒说明进行。

SOD活性[λ(SOD)]单位定义：每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活性单位（U）。

GSH-Px活性[λ(GSH-Px)]单位定义：每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶反应的作用，使反应体系中GSH浓度降低1μmol L-1为一个活
力单位（U）。

CA T活性[λ (CAT)]单位定义：每毫克组织蛋白每秒钟分解1 μmol的H2O2的量为一个活力单位（U）。

MDA含量定义：每毫克组织蛋白丙二醛的含量[nmol mg-1(protein)]。

蛋白含量采用考马斯亮兰法进行测定，以试剂盒中的蛋白标准液为标准蛋白。

所有指标吸光值均用UV-7504单光束紫外可见分光光度计（江苏省常州市诺基仪器有限公司）测定。

1.3 数据处理
实验数据用统计学方法进行处理，结果均用平均值±标准偏差表示。

用SPSS软件中单因素方差分析法分析曝露引起的差异，用LSD法比较组间数据，P<0.05时即被认为差异显著，用回归方法作相关性检验。

2结果
2.1 空白组和丙酮组差异性分析
表1是实验进行1、4、8、15 d后空白对照组与丙酮对照组各指标之间的比较。

从表中可以看出，不同浓度菲的影响实验进行15 d后，翡翠贻贝内脏团空白对照组和丙酮对照组之间的SOD、GSH-Px、CAT 活性和MDA含量均无显著性差异(P>0.05)，表明实验中用作助溶剂的丙酮加入量(最大体积比为0.08‰)对实验结果没有影响。

表1 空白组和丙酮组指标比较
Tab 1 comparison between blank group with acetone group
时间Time(t/d) 浓度组
group
λ (SOD)
[U mg-1 (protein)]
λ(GSH-Px)
（μmol mg-1 min-1）
λ(CAT)
[U mg-1 (protein)]
MDA
（nmol mg-1）
1 B 14.95±0.85 24.36±1.07 14.82±1.07 2.39±0.10 A 13.72±0.33 24.47±1.0
2 13.91±0.38 2.13±0.23
4
B 11.67±0.95 22.65±0.46 12.72±0.18 2.11±0.09
A 12.68±0.33 21.15±0.76 12.67±0.44 1.87±0.03
8 B 10.73±0.96 22.65±0.47 13.17±0.34 2.03±0.08 A 11.95±0.61 22.03±0.99 14.70±0.62 1.87±0.07
15 B 13.97±0.16 21.50±0.56 13.58±0.46 2.39±0.09 A 13.07±0.04 22.45±0.65 13.22±1.06 1.96±0.04
B: 空白对照组; A: 丙酮对照组.
B: blank group A: acetone group.
2.2 菲对翡翠贻贝内脏团抗氧化酶活性的影响
菲胁迫与清水恢复阶段翡翠贻贝内脏团中SOD、GSH-Px、CAT活性变化见图1。

从图1-a中可以看出，在胁迫第1 d，50.0 μg L-1浓度组SOD活性显著高于对照组（P<0.05），其余各组与对照组无显著差异。

随着时间的延长，2.0、10.0 μg L-1浓度组SOD活性也开始被诱导，第4 d时，各浓度组SOD活性分别高出对照组54.4%、60.9%、117.4%，胁迫8 d后，各浓度组SOD活性逐渐下降，但仍显著高于对照组(P<0.05)，由于氧化胁迫的加剧，15 d时，10.0 μg L-1和50.0 μg L-1浓度组的SOD活性被显著抑制（P<0.05），并且浓度-效应显著，R2=0.998。

在清水恢复7 d后，各浓度组SOD活力均恢复到对照组水平(P>0.05)。

由图1-b可见，菲胁迫第1 d，50.0 μg L-1浓度组GSH-Px活性就被显著诱导(P<0.05)。

随胁迫时间的延长，各组GSH-Px活性开始升高，第4 d时，各组GSH-Px活性达到最高，分别比对照组高了61.0%、47.5%、51.8%(P<0.05)。

到第8 d便开始下降，其中，2.0 μg L-1浓度组GSH-Px活性显著低于对照组，而50.0 μg L-1组仍高出对照组25.9%(P<0.05)。

15 d时，10.0、50.0 μg L-1组GSH-Px活性显著低于对照组(P<0.05)。

在清水恢复的第2 d，各组GSH-Px活性仍显著低于对照组水平（P<0.05），到了第7 d，除2.0 μg L-1组外，其余两组GSH-Px活性已恢复到对照组水平。

由图1-c中可以看出，1 d时，各浓度组CA T活性显著高于对照组（P<0.05），并且浓度-效应明显，R2=0.966，其中10.0 μg L-1浓度组高出对照组34.9%。

随着时间的延长，各浓度组CA T活性逐渐下降，其
中，50.0 μg L-1组CA T活性显著低于对照组（P<0.05），而到了15 d各组CA T活性又有所上升，其中2.0、10.0 μg L-1浓度组则显著高于对照组（P<0.05）。

在清水恢复的第2 d，10.0 μg L-1浓度组CA T活性显著低于对照组（P<0.05），第7 d时2.0 μg L-1组CA T活性则显著高于对照组水平（P<0.05），而其余两组无显著性差异。

图1 菲对翡翠贻贝内脏团SOD(a)、GSH-Px (b)、CAT (c)活性的影响
Fig. 1 Effects of phenanthrene on SOD(a) , GSH-Px (b) and CAT (c) activities in green-lipped mussel（Perna viridis）viscera
不同小写字母为同一胁迫时间内各浓度组间生化指标的多重比较结果（P<0.05）。

*号代表清水解毒阶段，下同。

Different lowercases indicated significant differences among treatments different in Phenanthrene concentrations。

* represent the phase of detoxification in clean water. the same below.
2.3菲对翡翠贻贝内脏团脂质过氧化水平(MDA含量)的影响
菲胁迫与清水恢复阶段翡翠贻贝内脏团MDA含量变化见图2。

从图中可以看出，各个浓度组MDA含量随时间的延长呈逐渐上升的趋势，2.0、10.0 μg L-1浓度组的时间－效应明显，关系呈抛物线型，R2分别为0.930，0.973。

在菲胁迫第1 d，10.0、50.0 μg L-1组的MDA含量显著高于对照组（P<0.05），随时间的延长，第4、8 d时各浓度组MDA含量逐渐上升，均与对照组有显著性差异（P<0.05），在15 d时各浓度组MDA含量达到峰值，分别高出对照组26.0%、34.5%、33.3%（P<0.05），且浓度-效应明显，R2=0.997。

在清水恢复阶段，MDA含量逐渐降低，到第7 d时，各组MDA含量均已恢复到对照组水平。

图2 菲对翡翠贻贝内脏团MDA含量的影响
Fig.2 Effects of Phenanthrene on MDA content in green-lipped mussel（Perna viridis）viscera
3 讨论
正常情况下，细胞内活性氧的产生和清除处于一种动态平衡。

当污染物进入生物体内后经一系列代谢转化能产生活性氧自由基和部分H2O2，如不能及时清除则会破坏这种平衡，从而对生物体造成氧化损伤。

SOD是生物体内普遍存在的一种以自由基为底物的抗氧化酶，能够对其进行有效地清除。

很多研究证实，在特定的时间内，生物体受到有毒化合物一定水平的胁迫，其体内SOD活性可受到明显的诱导作用，之后随着曝露时的延长，SOD活性又呈现下降的趋势[9~11]。

结合本研究发现，各浓度组菲溶液在胁迫前期产生的活性氧自由基诱导了SOD活性，而随着时间的延长，自由基的产生超过了抗氧化酶的自我清除能力，导致细胞受到氧化损伤，而造成SOD活性降低。

同时本研究还证实，不同浓度的菲诱导SOD的时间也存在差异性，高浓度组(50.0 μg L-1)菲胁迫下的SOD活性短时间内变化明显，这与Tomas的研究结果相类似[12]，而中低(10.0、2.0 μg L-1)浓度组SOD酶活性在第4 d才受到明显的诱导作用，这反应了生物对有毒化合物的响应存在明显的适应阈值。

在清水解毒阶段，SOD活性逐渐恢复，第2 d时各浓度与对照组已无显著性差异，结合相关研究分析认为：15 d的菲胁迫尚未对贻贝体产生不可逆的损伤，贻贝体内富集的菲经由贻贝代谢释放到清水中。

杨慧赞等的研究显示曝露于苯并[a]芘15 d的栉孔扇贝清水释放时其体内的苯并[a]芘含
量迅速下降，3 d便下降50%[13]。

冯涛等的研究显示曝露于苯并[a]芘3 d的大弹涂鱼在转入清洁海水后抗氧化酶可以恢复至正常水平[14]。

作为机体内重要的抗氧化硒蛋白酶, 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)可特异地催化还原型谷胱甘肽（GSH）对过氧化物的还原反应，催化H2O2及其它过氧化物转变为无毒性产物[15]。

本研究中，翡翠贻贝内脏团中GSH-Px活性呈先被诱导后被抑制的变化趋势，且高浓度组第1 d其活性就被诱导，各组GSH-Px 活性于4 d时达到峰值，这与本研究中SOD活性变化规律较一致，这或许可以由SOD歧化反应后的产物H2O2恰好是GSH-Px的作用底物来解释，而蔡立哲等利用蒽、菲、芘等混合液对菲律宾蛤仔进行曝露，李康等通过苯并[a]芘对鲫鱼染毒后也观察到这种现象[9,16]。

15 d的胁迫结束后，10.0、50.0 μg L-1浓度组GSH-Px 活性显著低于对照组，这很可能是机体细胞受到氧化损伤的结果。

在清水解毒的第2 d，GSH-Px活性依然很低，可能与组织中GSH的大量减少且尚未恢复有关[17]，到第7 d，GSH-Px活性已与对照组无显著差异，说明胁迫造成的氧化损伤尚未到不可逆的程度，随着时间延长可以逐渐恢复。

CA T存在于生物体组织的过氧化体中，主要担负H2O2和过氧化物的分解与转化功能，CAT和GSH-PX 活性的提高可以清除代谢中产生的H2O2，使生物体不受到较大的氧化损伤。

本研究中，菲溶液曝露的第1 d，各浓度组CA T活性即受到明显的诱导作用，且其诱导效应先于SOD表现出来，表明CA T对污染物氧化胁迫反应非常敏感，这与王隽媛等观察到的斑马鱼在萘的胁迫下内脏中SOD和CA T的生物响应模式相似，产生这种现象的原因可能是由于O2-的歧化反应并不是H2O2的唯一来源，后者还可以通过氨基酸或细胞色素P450氧化酶激活来生成[18]。

随着时间的延长，各浓度组CAT活性开始下降，而高浓度组CA T活性则被显著抑制，这可能是自由基蓄积而导致的抑制现象，也有的学者认为，在酶活性中心含有较多的-SH可能成为H2O2的主要攻击目标，因此GSH-PX比CA T分解过氧化氢的能力更强[19]，在本研究长期曝露条件下，GSH-PX也比CA T反应更敏感一些。

转入清水中后，CAT活性逐渐恢复，而第7 d 时2.0 μg L-1活力显著高于对照组，这种变化可能与生物适应性有关。

丙二醛(MDA)是膜脂质过氧化的主要产物之一，它含量的高低可指示生物膜受氧化损伤的程度。

本实验中，MDA含量在短时间或低浓度处理下升高幅度不大，这说明在菲的轻度胁迫下，SOD、GSH-PX、CA T 彼此间的协同作用，可以消除活性氧自由基，使脂质过氧化水平不至于很高。

而随浓度的升高或胁迫时间的延长，MDA含量逐渐升高，并在15 d胁迫结束时达到峰值，这也预示着生物体抗氧化酶系统遭到破坏，生物体处在比较严重的致毒状态，同时我们也发现，MDA含量与菲浓度呈显著正相关的关系。

在转入清水2 d后，中低浓度组MDA含量已逐渐恢复到对照组水平，而高浓度组MDA含量仍然显著高于对照组，这也说明，高浓度菲的胁迫对翡翠贻贝内脏团细胞造成的氧化损伤较严重，短时间难以恢复，而随着时间的延长，到了第7 d，其含量下降到对照组水平，说明在清水下贻贝的抗氧化防御能力已逐渐恢复。

在PAHs 污染情况下，双壳类组织内抗氧化酶活性可能被诱导升高，也可能随着时间延长逐渐受到抑制，这也说明PAHs对双壳类抗氧化酶活性的影响模式比较复杂。

结合本研究，CAT活性在菲胁迫早期阶段就出现明显的诱导效应，SOD和GSH-Px活性随菲胁迫时间的延长呈先升高后降低的趋势，但无论抗氧化酶活性增加还是下降，均表示机体内活性氧的大量增加，并已扰乱机体抗氧化防御系统的正常功能，而抗氧化酶活性的显著下降则提示生物已受到较严重和较长时间的污染，本研究中MDA含量在整个胁迫阶段呈逐渐上升的趋势也很好地说明了这一点。

因此在进行海洋环境中PAHs污染的生物监测时，应考虑将翡翠贻贝体内SOD、CA T 和GSH-Px这三种酶的活性变化及MDA含量结合起来进行分析，以期为PAHs 的环境影响作出更为准确的生态毒理学预测和早期警报。

本研究胁迫下的翡翠贻贝在清水恢复7 d后，体内各指标已基本恢复到正常水平，说明翡翠贻贝受到的氧化损伤可逆，同时也为贝类在受到一定程度的PAHs污染后的恢复时间提供理论参考。

致谢：实验得到南海水产研究所海南热带水产研究开发中心李有宁副研究员和陈明祥助理研究员的大力支持，在此表示由衷感谢！
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