柠檬自交后代抗柑橘溃疡病的离体鉴定

58--植物保护·园艺园林
　DOI:10.16498/ki.hnnykx.2017.003.017
柑橘溃疡病是由柑橘黄单孢杆菌柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp. citri ）引起的一种细菌性病害，对柑橘产业危害严重，世界许多国家将其列为重要检疫性病害[1-2]。

多数柑橘枝叶及果实感病后都会出现典型的火山口状病斑，严重影响其树势和产量[3-4]。

感病果实的外观也会影响销售，对产业发展产生不良影响。

目前，主要还是采用化学药剂来防治柑橘溃疡病，根治起来较为困难。

因此，选育抗病品种便成为解决这一问题的最有效途径。

由于对柑橘溃疡病的抗性机理还不清晰，抗病品种的选育进展缓慢，目前还未育成有经济价值的抗病品种。

柠檬是重要的高酸类柑橘栽培种，其主要品种有尤力克、里斯本、费米耐劳、菲诺等，均是柑橘溃疡病的高感品种[5]。

分子标记研究结果表明，柠檬[Citrus
limon （L .）Burm . f.]是枸橼和酸橙类的杂交种[6-7]；由于其亲本之一的枸橼已被鉴定为是柑橘溃疡病的抗病种类[8]，含有对溃疡病的抗性基因；所以柠檬对溃疡病的感病性状应该来自于酸橙。

由此推测，柠檬中控制柑橘溃疡病抗性的基因应该为杂合状态，其自交后代有可能出现抗性分离。

因此，研究拟利用感溃疡病柠檬品种尤力克为材料，构建自交群体，对其后代进行溃疡病的离体抗性鉴定，以期筛选出抗溃疡病的柠檬植株，并初步分析其抗病性状的遗传特征，为抗溃疡病柑橘的选育打下基础。

1　材料与方法1.1　试验材料
供试材料为感溃疡病柠檬品种尤力克。

在尤力克成年树开花前用防虫网单株隔离，促使自花授粉，待果实成熟后，取出柠檬种子。

在温室播种获得实生苗。

研究鉴定的114株柠檬自交后代实生苗均保存在湖南农业大学国家柑橘改良中心长沙分中心的温室内。

1.2　试验方法
 柠檬自交后代抗柑橘溃疡病的离体鉴定 
谭李梅1,2，刘　慧1，朱志媚1,2，周　东1，汤　甜1，邓子牛1,2
（1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.国家柑橘改良中心长沙分中心，
湖南 长沙 410128）
摘　要：为鉴定柠檬自交后代对柑橘溃疡病的抗性，以柠檬鲜叶为材料，通过注射法和针刺法接种不同浓度溃疡病菌菌液，对114株柠檬自交
后代群体进行离体鉴定，并以感病材料冰糖橙、抗病材料枸橼C-05作为对照。

结果表明：柠檬自交后代对溃疡病抗性存在个体间差异；其中，注射接种法中表现为抗104 和105 CFU/mL 病原菌的植株有24株，针刺接种法中表现为抗108 CFU/mL 病原菌的植株有11株；其中，有6株柠檬自交后代在２种鉴定方法中均被认定为抗病株。

综合２种鉴定方法，114株柠檬自交后代中有29株对溃疡病表现出抗104 CFU/mL 病原菌。

关键词：溃疡病；柠檬自交后代；离体接种；抗性评价
中图分类号：S666.5 文献标识码：A 文章编号：1006-060X （2017）03-0058-05
 V itro Identification of Lemon Self-crossed Seedlings for the Resistance to Citrus Canker Disease
T AN Li-mei 1,2，LIU Hui 1，ZHU Zhi-mei 1,2，ZHOU Dong 1，TANG Tian 1，DENG Zi-niu 1,2，
（1. Horticulture and Landscape College, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC;
2. National Center for Citrus Improvement, Changsha 410128, PRC ）
Abstract ：For identifying lemon auto-seedling’s resistance to citrus canker, taking fresh lemon leaves as materials, susceptible Bingtang orange and the resistant citron C-05 as contrast, the resistance of 114 lemon self-crossed-seedlings were identified in vitro leaves, by injecting and needle puncturing different concentration of citrus canker. The results showed that there are differences on the resistance to citrus canker between the individual of lemon selfed progenies, 24 of them are resistant to 104 and 105 CFU/mL citrus canker by injection and 11 of them are resistant to 108 CFU/mL citrus canker by needle puncture. Meanwhile, 6 of them are resistant to citrus canker by two methods. In conclusion, 114 lemon auto-seedlings performed variously faced citrus canker, and 29 of them are resistant to 104 CFU/mL citrus canker.
Key words ：bacterial canker disease; lemon self-crossed-seedlings; vitro inoculation; resistance evaluation
收稿日期：2016-12-14
基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目 [（G）SCX1506]作者简介：谭李梅（1993-），女，湖南资兴市人，硕士研究生，研究方向：果树遗传育种与生物技术。

并列第一作者：刘　慧通讯作者：邓子牛
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植物保护•园艺园林1.2.1　溃疡病菌准备　取保存于-80℃的溃疡病菌液按“Z ”字型划线到LB 固体培养基，28℃活化培养3 d 。

挑取单菌落于20 mL LB 液体培养基中，在28℃、200 r/min 的摇床上培养18 h 。

取活化菌液5 mL ，7 500 r/min 离心5 min ，弃上清液，加入无菌水，重复此操作一次。

在紫外分光光度计下用无菌水调节后测得OD 600为0.6，再用无菌自来水重悬菌液浓度至108 CFU/mL ，并依次稀释到107、106、105、104、103、102和10 CFU/mL 备用。

1.2.2　接种浓度的筛选　用最感病的冰糖橙和抗病的枸橼C-05刚达到最大叶面积、未革质化的黄绿色健康新叶进行所有溃疡病菌浓度的离体注射接种，以注射清水为对照，观察冰糖橙和枸橼C-05接种不同浓度菌液后的症状，最终选择4个适宜浓度的溃疡病菌液用于柠檬自交后代的抗性鉴定。

1.2.3　注射接种　选取刚达到最大叶面积、未革质化的黄绿色健康新叶进行离体注射接种，在同一叶片上分别接种不同浓度的溃疡病菌液，以清水为对照。

接种后的叶片置于干净培养盒的湿润滤纸上，封上保鲜膜，在28℃恒温光照条件下保湿培养，观察叶片症状。

每个处理重复3次，分别记录每个浓度条件下，柠檬自交后代对溃疡病的表现症状，出现明显病斑（水渍状、黄色晕圈、愈伤状突起、病菌扩张）则为感病，出现坏死斑点（褐色坏死、病菌不扩张）则为抗病。

以最为感病的冰糖橙和抗病的枸橼C-05植株相同发育阶段的叶片为对照。

1.2.4　针刺接种　从70株柠檬自交后代中选取刚达到最大叶面积、未革质化的黄绿色健康新叶进行离体针刺接种，用注射器针尖在叶面轻轻扎两组小孔，每
组4个，用被108 CFU/mL 溃疡病菌菌液充分浸泡的带菌小滤纸片覆盖在针刺孔上，放置于干净培养盒的湿润滤纸上，封上保鲜膜，在28℃恒温光照条件下进行保湿培养，观察叶片症状。

以最感病的冰糖橙和抗病的枸橼C-05为对照。

每个处理重复3次试验，分别记录每组中明显病斑数（愈伤状突起）。

发病率＝病斑数/总的针刺点数。

2　结果与分析
2.1　接种浓度的筛选
从图1中可以看出，冰糖橙注射103 CFU/mL 溃疡病菌菌液后，出现零散愈伤状突起症状；注射104 CFU/mL 菌液后，愈伤状突起增加；注射105 CFU/mL 菌液后，愈伤状突起变为海绵状，叶片开始溃败；注射106 CFU/mL 菌液后，叶片溃败，病斑扩张；注射更高的浓度的溃疡病菌菌液后，叶片短时间内溃烂，无法进行观察；注射清水后不发病。

枸橼C-05注射103
CFU/mL 溃疡病菌菌液后，出现坏死斑点；注射104 CFU/mL 菌液后，出现坏死斑块；注射105 CFU/mL 菌液后，坏死斑块不扩张；注射106CFU/mL 菌液后，病斑褐化坏死；注射清水后不发病。

这说明选用103、104、105和106 CFU/mL 的溃疡病菌浓度对柠檬自交后代注射接种能看到从轻微发病到严重发病的症状范围。

因此，试验确定如图2所示进行注射接种。

2.2　注射接种鉴定结果
试验中发现，各处理叶片离体注射溃疡病菌后，第4天便有部分叶片出现水渍状斑点症状，随后陆续有新病斑出现，且病斑不断扩大；接种7 d 后，不再
图1　冰糖橙与枸橼C-05接种不同浓度溃疡病菌菌液后的症状表现
（图中上排为糖橙，下排为枸橼
C-05）
清 水 103 CFU/mL 104 CFU/mL 105 CFU/mL 106 CFU/mL
103 CFU/mL 104CFU/mL 105 CFU/mL 106 CSFU/mL
清水
图2　注射接种浓度
有新的病斑出现；接种10 d后，所有叶片的病症不再扩大。

因此，选用注射接种10 d后叶片的症状表现对各处理植株进行抗病性的最后评价。

从表1中可以看出，在离体注射接种的114株柠檬自交后代实生苗中，当注射的菌液浓度为103 CFU/mL时，有55株出现病症，属于感病植株；有59株没有表现症状，属于抗病单株，占鉴定总数的51.75%；当菌液浓度为104表1　114株柠檬自交后代注射接种鉴定结果
抗 性植株编号
不抗病
NMZJ-14、NMZJ-15、NMZJ-16、NMZJ-111、NMZJ-114、NMZJ-117、NMZJ-120、NMZJ-122、NMZJ-123、NMZJ-124、NMZJ-126、NMZJ-131、NMZJ-141、NMZJ-155、NMZJ-158、NMZJ-159、NMZJ-165、NMZJ-179、NMZJ-184、NMZJ-211、NMZJ-214、NMZJ-215、NMZJ-224、NMZJ-262、NMZJ-264、NMZJ-357、NMZJ-372、NMZJ-407、NMZJ-612、NMZJ-169、NMZJ-710、NMZJ-248 NMZJ-109、NMZJ-191、NMZJ-293、NMZJ-428B、NMZJ-717、NMZJ-718、NMZJ-356、NMZJ-417B、NMZJ-432、NMZJ-711、NMZJ-106、NMZJ-139、NMZJ-305B、NMZJ-402B、NMZJ-605、NMZJ-105、NMZJ-121、NMZJ-219、NMZJ-265B、NMZJ-246、NMZJ-321、NMZJ-253和
NMZJ-136
抗103 CFU/mL
NMZJ-11、NMZJ-35、NMZJ-36、NMZJ-37、NMZJ-38、NMZJ-100、NMZJ-101、NMZJ-110、NMZJ-118、NMZJ-160、NMZJ-171、NMZJ-182、NMZJ-192、NMZJ-199、NMZJ-230、NMZJ-249、NMZJ-253、NMZJ-281、NMZJ-601、NMZJ-603、NMZJ-458、NMZJ-606、NMZJ-164A、NMZJ-106、NMZJ-330B、NMZJ-386、NMZJ-311、NMZJ-342、NMZJ-450、NMZJ-218、NMZJ-222、NMZJ-292、NMZJ-193、NMZJ-614、NMZJ-30、NMZJ-17、NMZJ-18、NMZJ-116、NMZJ-132、NMZJ-172、NMZJ-176、NMZJ-251、NMZJ-471、NMZJ-255、NMZJ-291、NMZJ-716、NMZJ-705、NMZJ-125、NMZJ-708、NMZJ-706、NMZJ-62、NMZJ-261、NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-144、NMZJ-202、NMZJ-343、NMZJ-383和NMZJ-39
抗104 CFU/mL
NMZJ-17、NMZJ-18、NMZJ-116、NMZJ-132、NMZJ-172、NMZJ-176、NMZJ-251、NMZJ-471、NMZJ-255、NMZJ-291、NMZJ-705、NMZJ-716、NMZJ-125、NMZJ-708、NMZJ-706、NMZJ-62、NMZJ-261、NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-144、NMZJ-202、NMZJ-343、NMZJ-
383和NMZJ-39
抗105 CFU/mL NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-144、NMZJ-202、NMZJ-
343、NMZJ-383和NMZJ-39
CFU/mL时，有24株没有表现症状，属于抗病单株，
占鉴定总数的21.05%；当菌液浓度为105 CFU/mL时，
有7株没有表现症状，属于抗病单株，占鉴定总数的
6.14%；当菌液浓度为106 CFU/mL时，所有柠檬自
交后代实生苗均出现病症。

7株抗105 CFU/mL溃疡
病菌的植株分别为NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-144、
NMZJ-202、NMZJ-343、NMZJ-383和NMZJ-39，可
以初步认定这7株柠檬为抗溃疡病单株。

部分柠檬自
交后代注射溃疡病菌10 d后的症状如图3所示。

2.3　针刺接种鉴定结果
如图4所示，冰糖橙在108 CFU/mL溃疡病菌浓
度下，所有针刺口出现愈伤状突起，发病率为100 %；
枸橼C-05在 108 CFU/mL溃疡病菌浓度下，针刺口出
现坏死状斑点，发病率为0。

由表2可知，鉴定的70株柠檬自交后代实生苗
中，在108 CFU/mL溃疡病菌浓度下，其中有40株发
病率在80%~100%之间，有16株发病率在60%~80%
之间，有3株发病率在40%~60%之间，有11株发病
率在0%~40%之间。

由此可知，发病率在40%~100 %
之间的植株对溃疡病表现为感病，植株数量为59株，
占鉴定总数的84.28 %；发病率在0%~40%之间的
植株对溃疡病具有抗病性，植株数量为11株，占鉴
定总数的15.71 %。

这11株抗病植株分别为NMZJ-
47、NMZJ-80、NMZJ-100、NMZJ-144、NMZJ-160、
NMZJ-172、NMZJ-222、NMZJ-343、NMZJ-383、
NMZJ-39和NMZJ-191。

其中，NMZJ-191针刺接种
后的症状如图4所示。

表2　70株柠檬自交后代针刺涂菌接种鉴定结果
针刺涂菌接
种发病率（%）
植株编号
80~100
NMZJ-11、NMZJ-14、NMZJ-15、NMZJ-16、NMZJ-
17、NMZJ-18、NMZJ-35、NMZJ-37、NMZJ-38、
NMZJ-110、NMZJ-105、NMZJ-116、NMZJ-132、
NMZJ-141、NMZJ-155、NMZJ-158、NMZJ-159、
NMZJ-165、NMZJ-171、NMZJ-179、NMZJ-182、
NMZJ-184、NMZJ-192、NMZJ-211、NMZJ-214、
NMZJ-215、NMZJ-219、NMZJ-224、NMZJ-230、
NMZJ-249、NMZJ-255、NMZJ-262、NMZJ-264、
NMZJ-265、NMZJ-357、NMZJ-372、NMZJ-407、
NMZJ-612、NMZJ-601和NMZJ-605
60~80
NMZJ-101、NMZJ-111、NMZJ-114、NMZJ-117、
NMZJ-118、NMZJ-120、NMZJ-122、NMZJ-123、
NMZJ-124、NMZJ-126、NMZJ-131、NMZJ-199、
NMZJ-202、NMZJ-253、NMZJ-281和NMZJ-603
40~60NMZJ-36、NMZJ-176和NMZJ-251
0~40
NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-100、NMZJ-144、
NMZJ-160、NMZJ-172、NMZJ-222、NMZJ-343、
NMZJ-383、NMZJ-39和NMZJ-191
2.4　2种鉴定结果的比较
对比2种鉴定方法，发现注射接种表现为抗104
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植物保护•园艺园林和105 CFU/mL 病原菌的植株与针刺接种表现为发病率在0%~40%之间的植株在抗病性上的差异较小，在田间对溃疡病均表现为抗病。

由注射接种法鉴定的7株抗溃疡病（105 CFU/mL ）植株分别为NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-144、NMZJ-202、NMZJ-343、NMZJ-383和NMZJ-39；由针刺接种法鉴定的11株
抗溃疡病植株分别为NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-100、NMZJ-144、NMZJ-160、NMZJ-172、NMZJ-222、NMZJ-343、NMZJ-383、NMZJ-39和NMZJ-191。

其中，有6株柠檬自交后代在2种鉴定方法中均被认定为抗病株。

这表明这6株的抗溃疡病性状比较稳定，分别为NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-144、NMZJ-343、
图4　针刺接种108 CFU/mL 溃疡病菌后各品种的症状表现
（从左至右依次为冰糖橙BTC、柠檬自交126号、柠檬自交191号和枸橼C-05）
图3　部分柠檬自交后代注射接种10 d 后的症状
（121为感病植株，386可抗103 CFU/mL 的溃疡病菌菌液，471和716均可抗104
CFU/mL 的溃疡病菌菌液）
清水
103CFU/mL
104CFU/mL 105CFU/mL
106CFU/mL
NMZJ-383和NMZJ-39。

3　小结与讨论
通过大量田间调查和长期的栽培观察发现，不同柑橘品种对柑橘溃疡病的敏感性差异明显[9-10]。

在自然条件下，柑橘植株对溃疡病的敏感性程度受到病原菌浓度及致病力、气候条件、植物生长发育阶段和人为因素等的影响。

而实验室离体接种鉴定能保证在病原菌浓度单因素变化条件下研究不同柑橘品种对溃疡病的敏感性差异。

离体叶接种法病症表现较快，发病率较高，试验过程不受外来因素的影响，操作简单，结果可靠，而且试验后菌源便于销毁，可避免扩散。

刘利平[11]通过比较针刺接种的发病症状、发病率、针刺接种7 d的病斑大小以及注射接种的病斑数来判断不同柑橘品种对溃疡病的耐抗性关系。

该研究是通过对比注射接种和针刺接种2种离体接种方法对柠檬自交后代鉴定结果进行分析，注射接种法中表现为抗104和105 CFU/mL病原菌的植株有24株，针刺接种法中表现为抗108 CFU/mL病原菌的植株有11株；其中，有6株柠檬自交后代在两种鉴定方法中均被认定为抗病株，这6株的抗病性属于比较稳定的。

因此，综合两种鉴定方法，114株柠檬自交后代对溃疡病表现出不同程度的抗性，共有29株自交后代对溃疡病表现出抗104 CFU/mL病原菌。

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（责任编辑：成　平）
62--植物保护·园艺园林。