转录代谢解析玉米抵御干旱冷害双重胁迫的分子调控机理

研究背景：
2021年2月，中国农业科学院作物科学研究所周文彬老师课题组在Plant Physiology 发表了题为“Transcription-associated metabolomic adjustments in maize occur during combined drought and cold stress”的研究论文，该研究通过光学生理指标，转录组，代谢组学以及激素分析揭示了玉米苗期在干旱冷害联合胁迫下，干旱缓解了冷害胁迫对植株造成的损伤，为培育耐受联合胁迫的作物以及建立抵御苗期干旱冷害联合胁迫的栽培措施提供重要的理论依据。

随着全球气候变化日益加剧，多重联合胁迫对作物生长发育及产量形成的不利影响日益显著。

因此，努力揭示植物对联合胁迫的反应和适应对提高农业产量至关重要。

目前，大量的研究集中在单一胁迫对作物造成的生长发育、生理及分子的调控机制，而有关作物对多种胁迫组成的联合胁迫响应和适应的生理及分子机制知之甚少。

技术路线：
研究结果：
1不同处理对玉米植株生长的影响-表型，叶片含水量检测：干旱和寒冷组合胁迫提高了玉米植株的耐寒性
作者在不同时间点（1）施加7天的干旱胁迫，并且在第4d施加冷胁迫（第1组）；（2）干旱胁迫与冷胁迫同时进行4d（第2组）；（3）施加冷胁迫4d后施加干旱胁迫3d（第3组）将干旱胁迫与寒冷胁迫相结合，结果发现，去除胁迫后，第1组的植物恢复了，而第2组的植物没有完全恢复，第3组死亡了，可见，第1组中干旱胁迫方式引发了植物在寒冷胁迫下的生存，因此作者筛选出第1组处理进行后续研究。

为了研究玉米对干旱，寒冷及其组合胁迫的响应，作者对玉米幼苗进行了以下处理：如图1A所示，CT：对照组；D：干旱胁迫7d；C：冷胁迫4d（8℃/4℃）；D&C：干旱胁迫7d，且在第4d施加冷胁迫，各处理恢复后两天分别为D-rec，C-rec，D&C-rec，对于进行7天的干旱处理，作者将干旱处理的前3天称为D-pre。

相对于CT和C处理，D和D&C下土壤中的水分含量逐渐降低（图1C）。

D，C和D
＆C处理均导致叶片相对含水量（RWC）降低，恢复2天后，D和D＆C下的RWC 增加到对照水平（图1D）。

此外，单一冷胁迫（C）将植株存活率显着降低至20％，而所有植株在复合胁迫（D&C）下幸免于难（图1）。

图1 （A）不同胁迫以及恢复处理对玉米植株生长的影响。

（A）玉米植株发育阶段，组合胁迫取样时间点展示；（B）各处理表型统计；（C）各处理组土壤中的含水量（%）；（D）叶片相对含水量（RWC）（%）；（E）植株存活率（%）
2 不同处理对光合生理指标的影响-净光合速率，气孔导度，Fv/Fm，ΦPSⅡ，ETR，1-qP以及NPQ：长时间的干旱处理有利于植物适应冷胁迫
接着作者检测了几种胁迫下玉米植株的生理指标，与CT相比， D，C和D＆C组的净光合速率和气孔导度显着降低，其中D&C组植物的光合作用和气孔导度下降幅度最大。

恢复48小时后，在D和D＆C植物中观察到净光合作用速率和气孔导度增加，但在C组中未观察到（图2A-B）。

同样，D，C和D＆C导致Fv/Fm 低于CT组,但是D和D＆C组在恢复阶段下Fv/Fm的值恢复到正常水平，但C组的值并未恢复（图2C）。

接着作者还检测了其他几个叶绿素荧光参数，ΦPSⅡ，ETR，1-qP以及NPQ （2D-G），与CT相比，ΦPSⅡ，ETR在D，C，D&C组中显著降低，而在恢复阶段，除C组外，D，D&C中ΦPSⅡ，ETR都有所增加。

相反，PSII的QA电子受体1-qP 在D、C和D&C植物中的氧化还原态比CT高。

在D，C和D＆C下的NPQ诱导相对较慢，且与CT相比，其值要低很多。

在恢复阶段，D和D＆C处理植物的NPQ与CT组相似，这表明NPQ在很大程度上是可逆的。

但是，未在C组中观察到NPQ的可逆性。

接着作者观察了叶绿体的形态变化（图3），结果与以上保持一致。

这些结果表明，冷胁迫不可逆地破坏了PSII的光合活性，而冷胁迫与干旱胁迫的结合缓解了这种不可逆的破坏。

图2 单一和组合胁迫对玉米植株光合作用的影响。

（A）净光合作用率；（B）气孔导度（C）光系统Ⅱ（Fv/Fm）的最大光能效率；（D）转化效率（Φ PSII）（E）光合电子传递效率（ETR）；（F）PSII的QA电子受体的氧化还原态（1-qP）（G）非光化学淬灭（NPQ）
图3 不同胁迫处理下玉米叶绿体形态变化
3 转录组数据分析-PCA，Venn，GO功能富集：干旱冷害(D&C)复合胁迫下玉米植株转录谱显示出独特的模式
转录组结果分析发现，与对照相比，C,D-pre，D，D&C，C-rec，D-rec，D&C-rec组中分别筛选到12356、7420、10031、12289、4416、1651和1374个差异表达基因（4A）。

PCA结果显示各组内重复性良好，胁迫处理与对照组明显分离，而在恢复后，D-rec和D&C-rec与对照样品之间没有观察到明显分离(图4B)。

胁迫组中D和C与对照明显分离，而D&C组处于D和C间(图4B)。

在D,C以及D&C中，共存在4834个共有DEG，1525个DEG在D&C组中特有(图4C)。

接着作者对这4834个DEG进行GO富集(图4D)，发现主要富集在包括防御反应、细胞壁组织、脂质分解代谢过程、光合作用以及对渗透胁迫的反应，其中激素相关的GO条目，例如，对脱落酸(ABA)，水杨酸（SA）的响应，ABA介导的信号通路被富集(图4D)。

接着作者观察到大量编码转录因子的转录本在联合和单一胁迫下受到差异调节。

包括WRKY、MYB、NAC、AP2/EREBP、bZIP和bHLH 转录因子家族，它们在植物对非生物胁迫的响应中起着关键作用，与C组相比，D&C组中这些转录因子大部分上调。

对胁迫处理期间下调的DEG进行GO富集，发现光合作用、光收获和光合电子传递链相关的GO条目显著富集。

在恢复后，光合作用相关转录本在D和D&C中被上调，但在C中没有上调(图5A)，表明D 和D&C处理组的光合作用得已恢复。

接着作者分析了棉子糖、海藻糖和脯氨酸代谢相关基因的表达(图5B)。

与对照相比，编码半乳糖醇合酶的两个基因(LOC606403和Gols2)的表达在D和D&C 被上调，而Gols2的表达在C组被下调(图5B)。

棉子糖合酶(RS)的三个基因(AGA1、LOC103644222和LOC100281190)在 D&C中显著上调，而只有一个LOC103644222基因在C组轻微上调(图5B)。

当比较单一胁迫和组合胁迫时，编码参与海藻糖合成的酶基因上调程度相似。

在D和D＆C胁迫下，编码脯氨酸合成相关酶基因（三个P5CS基因）的表达量显著上调（图5B）。

与C相比，在D和D＆C中，大多数鉴定出的LEA基因（例如mlg3，LOC100193918和DHN1）的表达量显著上调（图5C）。

接着作者分析了植物激素生物合成基因的表达变化，包括ABA、IAA、JA和SA(图6A)。

我们发现大多数与ABA生物合成相关的基因在D，C和D&C胁迫下表达增加。

与C和D相比，D&C胁迫显著诱导了ABA生物合成相关基因（ZmVP14和NCED基因成员(NCED4和LOC100501444)）的表达(图6A)，IAA生物合成相关基因表达的增加仅出现在C中(图6A)。

参与ABA信号通路的五种ABA 受体差异表达，其中大多数在C、D和D&C中下调；同时作者鉴定了15个PP2C 基因，其中大部分是由胁迫，尤其是复合胁迫诱导的；大多数已鉴定的SnRK2s 和ABF基因的转录本在D&C，C，D中上调(图6B)。

图4 玉米植株对单一和组合胁迫以及恢复阶段转录调控响应。

（A）与对照比较，不同处理组中DEG 数量；（B）PCA结果展示；（C）Venn 图；（D）GO 在干旱（D）、寒冷（C）和组合（D&C）胁迫下的 DEG注释结果
图5 光合作用、糖生物合成基因和LEA基因在各处理组中的调节作用。

（A）光合作用相关基因的表达量如图；（B）棉子糖，海藻糖和脯氨酸合成途径中的DEG 表达热图；（C）编码LEA蛋白相关基因表达热图
图6 激素生物合成途径相关基因在胁迫以及恢复过程中的表达变化。

（A）参与激素（ABA，IAA，JA，SA）生物合成途径基因表达的箱线图；（B）参与ABA信号传导途径的基因表达谱热图
4 代谢组学数据分析-PCA，聚类热图：不同处理对玉米叶片代谢物积累（碳水化合物，糖，氨基酸，有机酸）产生影响
接着作者进行代谢组学检测，PCA分析发现D与C样品之间存在差异，且明显与对照分离，与转录组结果一致。

另外，D&C组与D组聚集在一起，表明干旱减轻了D&C处理下冷胁迫的影响。

恢复后，D-rec组和D&C-rec组样本仍然聚集
在一起，且更接近对照组，表明其在代谢水平上得已恢复。

相比之下，C-rec组仍然与对照组分离，并与C组聚集，表明冷处理组植物并未恢复(图7A)。

聚类热图分析产生六个Clusters（图7B），发现在碳水化合物、氨基酸和有机酸中观察到明显的变化。

其中Clusters 3在C组和D&C组间显著差异，与C组相比，D&C组碳水化合物的丰度显著增加。

另外，棉子糖、果糖、葡萄糖等在D和D&C 组中比在C组中更丰富(图7C)。

Clusters 4中的一些代谢物在C组中积累高于D&C和D组。

在Clusters 5中发现了氨基酸的大规模增加，其在C组中的水平较高，而在D和D&C组中，它们的丰度也增加，但随后在恢复过程中降低(图7B)。

图7 玉米植株在不同胁迫处理下的代谢谱。

（A）PCA结果展示；（B）代谢物聚类热图；（C）与对照相比，糖代谢相关物质在各处理组中变化柱状图
5 不同处理对玉米植物激素含量的影响-ABA，IAA，JA，SA：ABA在玉米植株响应干旱冷害(D&C)胁迫中发挥重要作用
作者检测了ABA、IAA、JA和SA在不同处理下的含量变化(图8)。

发现ABA 含量在D、C和D&C组中显著增加。

其中D&C组中ABA的含量明显高于D或C组。

恢复后，相对于对照组，只有C组中ABA含量更高(图8)。

该结果与ABA生物合成途径中基因的表达趋势一致，表明脱落酸在响应联合胁迫中的关键作用。

此外，我们发现IAA含量被冷处理强烈诱导，而SA水平被联合和单一胁迫抑制，JA的含量在D&C-rec呈上升趋势，表明JA在植物适应复合胁迫中可能起作用(图8)。

图8 不同处理组中植物激素含量变化柱状图
6 ABA处理对玉米植株抵御胁迫的影响-净光合速率，气孔导度，Fv/Fm，φPSII，ETR，NPQ：干旱预处理引起的脱落酸的增加可能在玉米适应D&C胁迫中起关键作用
为了进一步研究ABA在植物对干旱和冷胁迫的反应中的作用，作者将ABA处理的植物暴露于冷胁迫中。

类似于干旱预处理的植物，用ABA处理的植物在暴露于冷胁迫表现出耐寒性，相对于没有ABA处理的植物具有更高的存活率(图9A)。

同样，脱落酸预处理的植株在冷胁迫下净光合速率、气孔导度和Fv/Fm显著降低，在解除胁迫后48小时，光合速率和Fv/Fm显著增加(图9B-D)。

在ABA&C组中，φPSII和ETR比对照植物低得多，随后在恢复阶段有所增加，这在D&C和D植物中也观察到相同趋势(图9E，F)。

ABA&C植物中的NPQ表现出与D&C和D植物相似的模式(图9G)。

这些结果进一步表明，干旱预处理引起的脱落酸的增加(图8)可能在玉米适应D&C胁迫中起关键作用。

图9 单胁迫、组合胁迫以及ABA预处理后进行冷胁迫（ABA＆C）对植物光合作用的影响。

（A）表型图片；（B）净光合作用率；（C）气孔导度（D）光系统Ⅱ（Fv/Fm）的最大光能效率；（E）转化效率（Φ PSII）（F）光合电子传递效率（ETR）；（G）非光化学淬灭（NPQ）
研究目的：玉米植株对联合胁迫（干旱，冷害）响应及其适应的生理及分子机制研究结论：冷胁迫不可逆地破坏了玉米植株的光合活性，而联合胁迫缓解了这种不可逆的破坏，相比于单一冷胁迫，联合胁迫诱导玉米植株中激素（ABA），糖类（如棉子糖、海藻糖等），LEA蛋白合成，且进一步通过外源ABA喷施的平行试验验证了联合胁迫下干旱诱导产生的ABA在增强植物冷害耐受性中具有关键作用。

锦上添花：作者利用光学生理指标，转录组，代谢组学以及激素解析玉米抵御干旱冷害双重胁迫的分子调控机理，为植物多重胁迫研究提供研究手段和思路。