临床免疫测定技术课件

Patient
1 2 3 4 5 6 7 8
临床免疫测定技术课件
Titer
64 8
512 <2 32 128 32
4
A（间接法—游离） 抗球蛋白抗 体试验-
commbs
（抗RBC不完 全抗体）
B（直接法—结合）：
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(In fluid phase ) 絮状沉淀试验：
环 状 沉 Ag 淀 试 验
2排4孔洗2次 …………… 3排4孔洗3次 8排4孔洗8次 加底物，显色，比色～ 评判原则- 阳性/阴性值保持最大不变的次数
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6、显色(Color is appeared)
• 添加酶特异性底物(HRP- TMB/OPD) • 保证底物溶液的有效性(无色、避光、显色) • 反应温度（37℃、室温） • 反应时间（25～30min） • 终止反应（酸溶液-2mol/L sulfate acid） • 及时比色
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7、比色
(By the plate reader)
• 加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀 • 测定时，要注意酶标仪的波长是否已调至合适 • 比较好的酶标仪可选择单波长或双波长比色测定
所谓双波长比色，即在敏感波长（此时对所显色 具最大光吸收）如450 nm和非敏感波长（所测得 的光吸收为微孔板上的划痕、污迹以及指纹等所 致），最后从仪器得到的读数为在敏感波长测得 的吸光度与非敏感波长测得的吸光度之差。
例举：临床可能出现的问题及原因
现象：1、相同的标本两次测定的结果不一致 原因：加样/试剂量不准，板孔间有差异
加样过快，孔间发生污染 加错样本 加样/试剂时，落在非包被区 不同批号的试剂混用 温育、洗涤及反应时间不一致 孔内污染杂物 酶标仪滤光片不正确 血清分离不充分，纤维蛋白原或血细胞入孔
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• 在洗涤中的作用是通过其疏水基团与被动吸附于 固相载体上蛋白的疏水键相互作用以削弱之；同 时通过其亲水基团结合液相中水分子的作用，促 使非特异的蛋白质吸脱。
• 吐温-20的浓度（≤2%） • 洗涤用量与次数～
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• 例： 选择4条8孔的已包被抗原（HBsAg）ELISA板条 每2条分别加同一份弱阳性和阴性样本 然后按试剂盒的操作说明加conjugate、温育 洗涤：1排4孔洗1次 4排4孔洗4次
IgG
6.5～16.0 2.5～9.0 2.0～9.0 2.9～10.7 3.4～12.4 6.5～16.0 6.5～16.0
IgA
0.01～0.04 0.02～0.5 0.04～0.8 0.15～0.9 0.15～1.6 0.35～2.5 0.40～3.5
IgM
＜0.25 0.20～0.8 0.25～1.0 0.35～1.5 0.45～2.0 0.50～2.5 0.50～3.0
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ELISA操作的基本步骤：
• 标本的收集、运送和保存 • 试剂准备 • 加样 • 温育 • 洗板 • 显色 • 比色 • 结果判断 • 结果报告及解释
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1、标本的收集、运送和保存
• ELISA检测分析用标本— 血清（浆） 特殊项目用： 唾液、脑脊液、尿液、粪便等
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8、结果判断
• 临床ELISA检测的结果报告形式— 定性（阴/阳） 定量（量值）
• ELISA定性测定的“阴性”和“阳性”的判断依据 是试剂盒所确定的阳性判断值（cut-off）。
• ELISA定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标 准品同时测定出的剂量反应曲线（标准曲线）。
• cut-off的建立(略) • S/CO≥1时判为阳性 • S/N或P/N≥2.1阳性为
二、外源性（操作） 溶血、反复冻融 细菌污染 储存时间过长 标本凝固不全
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• 对策：
1、稀释标本 2、改变选用的酶标抗体 3、预封闭（变性IgG） 4、加入某些还原剂 5、血清标本的补体灭活（56℃30min） 6、选择包被或标记抗体～如F(ab)2片段 7、用理化方法解离自身抗体 8、标本中添加Cu2+离子或卵白蛋白
凝集试验
• Widal reaction • Weil-felix reaction • Wright test:布鲁菌病 • 交叉配血试验
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相关帮助
• 需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎 • fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体
等等
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2、试剂准备
• 1、实验开始前，将试剂盒从冰箱取出置室 温放置20min以上启用，谓平衡（balance） 目的：
1）保证反应温度的一致性 2）去湿化，保证试剂浓度 • 2、稀释液的质量和特殊试剂配制的要求
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3、加样
• 原则：量准
•
操作规范
• 量准—移液枪的状态与正确使用
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2.抗原性质分析
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3.抗体效价滴定
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4.抗原或抗体纯度鉴定
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• 免疫浊度试验(略) • 免疫球蛋白的检测（简）
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健康人血清Ig含量（g/L）
年龄
脐血 1月 2～9月 10～12月 1～5岁 6～12岁 12～60岁
Ab
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(In gel phase ) single gel diffusion test
抗原浓度的标准曲线
操作：抗体混于凝胶中 抗原加入孔内 抗原自由扩散 测定沉淀环直径
在标准曲线上查找 相应抗原浓度
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影响因素:
1.抗原分子量：与扩散速度、沉淀环反相关 2.抗体种类：兔抗血清优于马、羊 3.抗体稀释度：抗体浓度大沉淀环小 4.扩散时间：抗原含量高，扩散时间长 5.扩散温度：4～37℃内温度与扩散速度正相
• 通过洗涤将特异性结合与固相的抗原或抗体与反 应温育过程中可能非特异吸附及游离的成分分离， 完成固相免疫检测程序保证测定的特异性。
• 洗涤液 :0.05% tween-phosphate-buffer saline pH7.4
吐温-20(山梨醇-20) 一种非离子去垢剂 含亲水/疏水基团
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临床ELISA测定的常用模式
• 一、双抗体夹心检测抗原 • 二、竞争法检测抗原 • 三、间接法检测抗体 • 四、竞争法检测抗体 • 五、固相捕获法检测抗体 • 六、双抗原夹心检测抗体 • 七、ABS- ELISA及其他
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一、双抗体夹心检测抗原
信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗 体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的 寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库 之后更为复杂的应用型检索平台
• 需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药 原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网 biomean进行咨询，期待您的加入
• ELISA检测分析的对象— 病原体抗原/抗体 Tumor mark、hormone、cytokine et al
• 采集、运送与保存的注意点： 采集时间、运送条件、暂存点温度
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• 可能影响测定结果的标本因素
一、内源性（标本内） 类风湿因子（rheumatoid factor） 补体（complement） 异嗜性抗体（heterophilic antibody） 治疗或诊断用鼠抗体（抗鼠抗体） 自身抗体或溶菌酶等
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1.检测未知抗原或抗体
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A: 浓度Ag、Ab及扩散率近似； B：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＞Ab ； C：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＜Ab D：浓度Ag＞Ab，扩散率近似； E：浓度Ag＞Ab，扩散率Ag＞Ab ； F：浓度Ag＜Ab，扩散率Ag＜Ab ；
关 6.琼脂板厚度：与沉淀环反相关
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double gel diffusion test
原理:
将可溶性抗原和抗体置于 琼脂凝胶板的对应孔中， 两者各自在凝胶中向四周 自由扩散，当抗原与抗体 相遇，在比例合适时形成 沉淀线。
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琼脂双向扩散试验的应用
• 1.检测未知抗原或抗体 • 2.抗原性质分析 • 3.抗体效价滴定 • 4.抗原或抗体纯度鉴定
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免疫固定电泳（测M蛋白）
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溶血率(%)
CH50(complement hemolysis 50%).
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 01234 豚鼠血清(ml)1:500
原理：组分和功能完整 的补体系统能使抗体致 敏的羊红细胞（SRBC） 发生溶血反应。在一定 范围内，SRBC溶血程度 与补体总活性成正相 关。以溶血百分率作纵 坐标，相应的血清量为 横坐标绘图，在一个适 当的、稳定的反应体系 中，溶血程度与补体剂 量依赖呈一个S形曲线
现象：2、弱阳性质控样本检测不出 原因：温育时间或温度不够，显色反应时间过短，
配置缓冲液（洗涤液）的蒸馏水有问题 现象：3、阳性对照不显色 原因：漏加酶结合物
洗涤液配置？（含有酶抑制物-NaN3） 漏加显色剂，错加（将终止液误为显色液） 现象：4、全部孔都有显色 原因：洗涤不够 显色液变质 底物或洗涤液被酶污染
Y Y
血型鉴定（玻片凝集反应）（直接）
Y+
Y
抗A标准血清
待测RBC
A型
Y+
Y
抗B标准血清 待测RBC
B型
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乳胶凝集试验(间接)
带现象 Zone phenomenon 前带 prezone 后带 postzone
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临床免疫测定技术课件ຫໍສະໝຸດ 1）正向间接凝集试验 (用抗原致敏载体--检测Ab)
2）反向间接凝集试验 间接凝集—(用抗体致敏载体----检测Ag）
3）间接凝集抑制试验 4) 协同凝集试验 (SPA抗体致敏------测抗原)
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反向间接血凝试验(测Ag)
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Pos. Neg.
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• “灰区”（例-HBsAg）
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9、结果报告及解释
• 结果报告根据测定性质，定性--阴性/阳性 定量--具体数值
• 结果解释结合所测项目的相关知识（临床意义）， 考虑各种可能影响的因素～
（关注测定操作中的各环节，尤其是加样、温育和 洗涤）
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Widal reaction（试管内凝集反应）
取： （1：10）待 检血清3.0ml
生理盐水 3.0ml/管
释度1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640
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待测血清的抗体效价（滴度）： 即出现“++”凝集的最终血清稀释度
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Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）
• 原理（Principle）：将抗原或抗体结合到 某固相载体表面，保持其免疫活性，测定时, 把被测sample和conjugate按不同的步骤与固 相载体上的immunosorbent反应。用洗涤的方 法使与固相载体上形成的immunocomplex与其 他物质分开，再加入酶反应substrate，经酶 的催化作用后substrate变为有色产物。产物 的量与标本中被检物的量直接相关。
• 操作规范— ①正确使用加样器
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3、加样
• 操作规范— ②掌握操作要领 吸头与加样器上吸头套密闭 吸头进入液体的深度要适宜 放送液体注意角度（10～40°） 位置（下1/3） 速度（不宜太快） ③关注加样器的状态
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4、温育（incubation）
• 温育是ELISA检测反应中可能影响其检测结果 的最为关键的一个因素。
• 液相的待测抗原/抗体与固相的抗体/抗原反应 需要一定的温度与时间，以保证结合反应充分。
• 温育所需要的时间与反应温度成反比。 • 温育温度：37℃、室温、43℃和2～8℃ • 避免“边缘效应”。
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5、洗板（washing）