SDS凝胶电泳操作手册

各项检验操作注意事项
一.SDS-PAGE操作及注意事项
1.制胶
按如下配方制备分离胶和浓缩胶
4%浓缩胶（3ml）10%分离胶（4ml）
AB-3 0.25mL
AB-6 0.8mL
3×gel buffer 0.75mL 1.335mL
50%甘油(v/v) 0.64mL
H2O 2mL 1.235mL
10%APS(w/v) 22.5uL 20uL
TEMED 2.25Ul 2uL
注意事项：
（1）配制前先将两块玻璃板夹紧，可以先试漏。

首先配置分离胶，用水封，静置40min 后，将水吸干，再注入浓缩胶，插上梳子，注意要避免梳孔出现气泡。

（2）在加入APS（10%过硫酸铵）和TENED后要尽快将胶注入，防止其凝固后无法注入玻璃板内。

2. 电泳
注意事项：
（1）制样：取40uL待测样，加入10uL5×SDS PEGE loading buffer，混匀后煮沸10min （电磁炉1000W），制好的样放至室温后，放4℃保存，待电泳。

（2）电泳：在电泳槽底部加入阳极缓冲液，将制好的胶连同装置放入电泳槽中，在两块胶之间注入阴极缓冲液。

取2uL Marker注入胶孔中作为参照，再一次取5uL样品缓慢注入胶孔中，调整电压800-100V。

待溴酚蓝从浓缩胶进入分离胶后，电压加至120-155V。

继续电泳直到溴酚蓝抵达分离胶底部，断开电源。

小心撬开玻璃板，除去浓缩胶，取出分离胶，加入R250考马斯亮蓝染色40min，再用脱色液脱色。

3. 溶液的配制：
（1）正极缓冲液Anode buffer(1×)：12.114gTris加少量ddH2O溶解后，用HCL调PH至8.9，最后用容量瓶定容至500mL，4℃保存。

（2）负极缓冲液Cathode buffer (1×)：6.057gTris+8.96gTricine+0.5SDS加入少量ddH2O 溶解后，定容至500mL，4℃保存。

（3）凝胶缓冲液Gel buffer (3×)：36.342gTris+0.3gSDS加ddH2O定容至100mL，HCL
调PH=8.45，过滤4℃保存。

（4）AB-3：24g Acrylamide+0.75g Bis-acrylamide加ddH2O溶解定容至50mL，过滤4℃保存。

（5）AB-6：23.25gAcrylamide+1.5g Bis-acrylamide加ddH2O溶解定容至50mL，过滤4℃保存。

（6）5×SDS PAGE Loading buffer：分别取1.25mL1M Tris-HCL(PH6.8)，0.5Gsds,25mg
溴酚蓝及2.5mL甘油，加纯水至5mL。

注：Loading使用前加入巯基乙醇，1mL溶液加100uL巯基乙醇，室温下保存。

（7）脱色液：水：甲醇：冰醋酸=5:4:1
（8）APS：10%过硫酸铵
（9）R250考马斯亮蓝：500ml甲醇+400ml纯水+100ml冰醋酸，加入2.5g考马斯亮蓝
二.BCA法蛋白质浓度测定
操作步骤：
将标准蛋白（1mg/mL）稀释成500ug/mL。

在酶标板上取8孔，按如下加入溶液。

将待测样品稀释到适合的浓度，加20uL在酶标空中，设重复。

再每孔加入200uL AB工作液A:B=50:1。

混匀后37℃保温30min。

冷却至室温，在酶标仪上测各孔的A562值。

使用excel 绘制标准曲线，计算出待测样品浓度。

三．Bradford法蛋白浓度测定
操作步骤：
在酶标板上取8孔，按如下加入溶液。

将待测样品稀释到适合的浓度，加20uL在酶标空中，设重复。

再每孔加入200uLBradford溶液，混匀后室温放置10min。

在酶标仪上测各孔的A595值。

使用excel绘制标准曲线，计算出待测样品浓度。

三.ELISA法测定EGF浓度
操作步骤：
1.待测样品的稀释
取10ul待测样品至1mlPBS（1×）中混匀，取10ul以上溶液至1mlPBS(1×)中混
匀，再取10ul以上溶液至100ul PBS(1×)中混匀，及为稀释1×105倍。

2. 取出ELISA酶标板。