犊牛腹泻沙门菌抗菌药敏感性试验与中药体外抑菌试验
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(Hebei Normal University of Science & Technology ，Hebei Key Labomtm of Preventive Veterinam Medicine ，Qinhuangdao 066004 ，China)
Abstraci: In order to determine the bacteriostatic effect of 15 antikactrial drugs and 22 traditional Chinese medicines on Salmo nella diarrhoea in calves in Hebei，13 strains of Salmonella diarrhoea in calves were tested for tOeir resistance to the 15 antibactrial drugs by K-T disc method. 22 traditional Chinese medicines such as gallnut and schisandra chinensir were extracted by traditional watf decoction method and tested by agaf drilling metOod. The minimum inhibitom concentration ( MIC) and minimum bactericidal concentation ( MBC) of traditional Chinese medicine were determined by modified double dilution plate metOod. The results showed that 13 Sahonella strains were muPi-msistant to antibactrial drugs . They were highly resistant to tmicocin，oxyttracycline，sulfa methoxazole and compound sinomenine. The resistance rate was 100%. The resistance rates of the other 11 antibacterial drugs were 30. 77% - 92. 31%. The sensitivity mte to amikacin was the highest with 69. 23% . Among 22 kinds of traditional Chinese medi cine ，8 kinds of traditional Chinese medicine had bacteriostatic effect on 13 Salmon£Ua strains. The order of bacteriostatic intensity from strong to weak was gallnut，schisandra chinensir，black plum，terracotta chebula，ligustrum lucidum，pomevranate peel，sapphire wood and scutlPriv baicalensis. Among tOem，gallnut had the best effect in this study，MIC and MBC were both 7. 81 -31. 25 mg/ mL. The results showed tOat 13 strains of Salmonella, had high resistance to antibacterial drugs，while some traditional Chinese medi cines had good bacteriostatic effect on Salmonella. This study provibed a scientific basis for clinical application of antibacterial drugs and traditional Chinese medicine in tOe treatment of calf diarrhea caused by Salmonelli.
收稿日期：2019—10—22 基金项目：河北省农业厅项目(HBCT2018130203 ) &石家庄藁 城区科学技术局项目(G201813 )；河北省重点研发项目 (19226629D)；秦皇岛市重点研发计划科技支撑项目(201803B006) 作者简介:刘勃兴(1994 -)，男，硕士生,研究方向为动物传染 病学，E-mail: bxliu77@ 163- com 通信作者：史秋梅，E-mail: shiqiumci @ 126- com；张志强，E-
Key words: caP diarrhea ； Salmonella ； drug resistance ； traditional Chinese medicine Cohesponding authors ：SHI Qiu-mei ，E-mail : shiqiumei@ ； ZHANG Zhi-qiang ， E-mail : wszhangzhiqiang@ yeah. net
本次 中
效果最佳,MIC和MBC均为7.81 -31.25 mg/mL。试验结果表明，13株沙门菌对抗菌药的耐药性较高，而部分中药对沙门
具有 的抑菌效果。本试验为临床应用抗菌药和中药治疗沙门菌所致犊
病
学依据。
关键词:犊
；沙
；耐药性；中药
中图分类号：S852.61 j2
文献标志码：A
文章编号：0529—6005(2021)03—0026—05
菌对抗菌药具有多重耐药性，对替米考星、土霉素、磺胺间甲氧hi、复方新诺明高度耐药，耐药 达100%，其他11种抗
菌药耐药率在30.77% -92.31%，对阿米卡星的敏感率最高，敏感率为69.23%。22味中药中，有8味中药对13株沙门菌
有抑 用,抑菌强度从强到弱依次为五、五味子、乌梅、诃、女贞子、石榴皮、苏木、黄苓。其中，五
Antibiotic Susceptibility Test of Salmonella Diarrhea in Calves and in vitro Bacteriostasis Tect of Traditional Chinese MePicine
LU Bv-xiny ，ZHAO An-qi ，LIU Cui-cui ，KANG Yuan-yuan ，MA Jin-hugn ， GAO Gui-sheng ，WU Tong--vi ，SHI Qiu-mvi ，ZHANG Zhi-qiang
mail: wszhangzhiqiang@ yeah. net
腹泻病是犊牛养殖过程中的常见疾病,导致犊
原因有许多，其中，沙
该病的重要病
原[1]$ 沙
病又称牛副伤寒，7~28
犊牛
易发病，主要临床 为发热、
水、
大
等，严时可引起败 而死亡，
犊
Hale Waihona Puke 主要 病原之一。，临床治疗沙 所致犊牛
腹泻病以抗生素类为主，但随着在临床治疗以及养
本试验对13株致犊牛腹泻的沙门菌对抗菌药 物和中药的敏感性进行检测，为临床治疗该病用药 提供理论支持。
1材料与方法
1.1主要试剂与药品中药:黄连、蒲公英、桔梗、板 蓝根、石榴皮、知母、紫花地丁、白头翁、秦皮、乌梅、苏 木、诃子、肉豆蔻、连翘、金银花、五倍子、女贞子、鱼腥 草、黄柏、柴胡、五味子、黄苓，均购自秦皇岛唐人医药 药店$药敏纸片,购自杭州天和微生物科技股份有限 公司。96孔细菌培养板，购自美国Cooing公司。2% 的氯化三苯四氮卩坐，购自北京索莱宝科技有限公司。 1-2菌株河北地区犊牛腹泻沙门菌地方流行株 （NS1 -NS13 ），由河北预防兽医重点实验室提供。 1.3菌液制备将冻存的犊牛腹泻沙门菌接种于 LB琼脂培养基，置于37 °C恒温培养箱培养12 h，挑 取单菌落接种于LB液体培养基中，置于37 C恒温 摇床培养过夜，次日以1：100的比例转接，于37 C 摇床培养至对数期（0Dm nm &0. 6 "，调整菌液浓度 至1 n106 CFU/mL后备用。 1.4沙门菌的抗菌药物敏感性试验 采取K-B纸 片法，参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）药物 敏感性试验方法检测13株沙门菌对氨节西林、头抱 曲松、阿莫西林等15种抗菌药物敏感性。试验结果 按照CLSI标准进行判定。 1.5中药药液制备采用传统的水煎煮法制备中 药药液。称量100 g中药，加入5~10倍量的蒸“水 浸泡1 h，浸泡后大火加热至煮沸，文火煎煮0.5 h，共 煎煮2次。将煎煮的药液合并，用纱布过滤后离心， 浓缩药液至100 mL即含生药浓度1 g/mL，高压后 分装，置于4 C冰箱备用。 1.6中药的体外抑菌直径的测定参考文献［78］，采用琼脂打孔法测定中药对13株沙门菌的体 外抑菌直径。每个LB平板加入100 $L 1. 3中制备 的菌液并涂匀，待平板吸收完全后用直径为6 mm 打孔器打孔,用酒精灯封底，每孔灌满1-5中制备
中国兽医杂志2021年（第57卷）第3期 27
的中药提取液（约0. 1 mL）,对照孔加入灭菌后的 PBS$置于37 C恒温培养箱培养12 h,测量抑菌 圈直径，试验重复3次，取3次抑菌圈直径的平均 值作为最终结果。判定标准:极敏（抑菌圈直径' 20 mm），高敏（20 mm ＞抑菌圈直径'15 mm）,中敏 （15 mm＞抑菌圈直径'10 mm）,低敏或耐药（抑菌圈 直径＜10 mm） $ 1.7中药的最小抑菌浓度（MIC）测定参考文献 ［7,9］，采用改良微量二倍稀释平板法测定中药的 MIC$在96孔细菌培养板的第2 ~ 11孔加入100 $L 灭菌蒸“水，第2孔加入100 $L1.5中制备的中药 提取液，混匀后取100 $L倍比稀释至第9孔后弃 100 $L,第2 ~ 11孔补加100 $L 2 x LB液体培养 基，在第2~10孔加入10 $L1.3中制备的菌液，第 10孔为阳性对照组,不加入中药液，第11孔为阴性 对照组，不加入菌液。置于37 C恒温培养箱培养 24 h。判定结果时，在培养板中加入5 $L 2%的氯 化三苯四氮卩坐（TTC），置于37 C恒温培养箱2 h,以 不显红的最高稀释孔的中药浓度为MIC。 1-8中药的最小杀菌浓度（MBC）测定 分别取 1-7中96孔培养板培养后的液体50 $L,涂布于LB 平板上，置于37 C恒温培养箱培养12 h。以无细菌 生长的中药浓度为MBC$
Chinese Journai of Veterinag Medicine
殖过程中抗菌药物的不合理应用，细菌耐药问题日 益严重，给细菌病的防治造成困难。因此,迫切需 要筛选出有效的抗菌药物指导临床用药。
中药是我国的传统药材，多属于天然药物，部 分中药具有抗菌、消炎、滋补、提高免疫力等作用， 并且价格低廉，不易产生耐性，毒副作用低，并有研 究表明，中药可以消除耐药质粒，对细菌耐药具有 逆转作用,降低细菌的选择压力（2-）$因此,研发中 药作为抗菌药物的替代药具有重要的现实意义。
摘要:为了测定15种抗菌药物与22味中药对河北地区犊牛腹泻沙门菌的抑菌效果，本研究采用K-纸片法检测13株
犊牛腹泻沙 对15种抗菌药的耐药性，采用 统的水煎煮法提取五 、五味子等22味中药，用琼脂打孔法测定中药液
的体外抑 径，用改良微量二倍稀释平板法测定中药最小抑
(MIC)和小杀
(MBC)$结果显示,13株沙门
26 中国兽医杂志2021年(第57卷)第3期
Chinese Journal of Veterinam Medicinv
犊牛
菌抗菌药敏感性试验
与中药体外抑菌试验
刘勃兴，赵安奇，柳翠翠，康圆圆，马金换，高桂生，吴同垒，史秋梅，张志强
(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛066004)
Abstraci: In order to determine the bacteriostatic effect of 15 antikactrial drugs and 22 traditional Chinese medicines on Salmo nella diarrhoea in calves in Hebei，13 strains of Salmonella diarrhoea in calves were tested for tOeir resistance to the 15 antibactrial drugs by K-T disc method. 22 traditional Chinese medicines such as gallnut and schisandra chinensir were extracted by traditional watf decoction method and tested by agaf drilling metOod. The minimum inhibitom concentration ( MIC) and minimum bactericidal concentation ( MBC) of traditional Chinese medicine were determined by modified double dilution plate metOod. The results showed that 13 Sahonella strains were muPi-msistant to antibactrial drugs . They were highly resistant to tmicocin，oxyttracycline，sulfa methoxazole and compound sinomenine. The resistance rate was 100%. The resistance rates of the other 11 antibacterial drugs were 30. 77% - 92. 31%. The sensitivity mte to amikacin was the highest with 69. 23% . Among 22 kinds of traditional Chinese medi cine ，8 kinds of traditional Chinese medicine had bacteriostatic effect on 13 Salmon£Ua strains. The order of bacteriostatic intensity from strong to weak was gallnut，schisandra chinensir，black plum，terracotta chebula，ligustrum lucidum，pomevranate peel，sapphire wood and scutlPriv baicalensis. Among tOem，gallnut had the best effect in this study，MIC and MBC were both 7. 81 -31. 25 mg/ mL. The results showed tOat 13 strains of Salmonella, had high resistance to antibacterial drugs，while some traditional Chinese medi cines had good bacteriostatic effect on Salmonella. This study provibed a scientific basis for clinical application of antibacterial drugs and traditional Chinese medicine in tOe treatment of calf diarrhea caused by Salmonelli.
收稿日期：2019—10—22 基金项目：河北省农业厅项目(HBCT2018130203 ) &石家庄藁 城区科学技术局项目(G201813 )；河北省重点研发项目 (19226629D)；秦皇岛市重点研发计划科技支撑项目(201803B006) 作者简介:刘勃兴(1994 -)，男，硕士生,研究方向为动物传染 病学，E-mail: bxliu77@ 163- com 通信作者：史秋梅，E-mail: shiqiumci @ 126- com；张志强，E-
Key words: caP diarrhea ； Salmonella ； drug resistance ； traditional Chinese medicine Cohesponding authors ：SHI Qiu-mei ，E-mail : shiqiumei@ ； ZHANG Zhi-qiang ， E-mail : wszhangzhiqiang@ yeah. net
本次 中
效果最佳,MIC和MBC均为7.81 -31.25 mg/mL。试验结果表明，13株沙门菌对抗菌药的耐药性较高，而部分中药对沙门
具有 的抑菌效果。本试验为临床应用抗菌药和中药治疗沙门菌所致犊
病
学依据。
关键词:犊
；沙
；耐药性；中药
中图分类号：S852.61 j2
文献标志码：A
文章编号：0529—6005(2021)03—0026—05
菌对抗菌药具有多重耐药性，对替米考星、土霉素、磺胺间甲氧hi、复方新诺明高度耐药，耐药 达100%，其他11种抗
菌药耐药率在30.77% -92.31%，对阿米卡星的敏感率最高，敏感率为69.23%。22味中药中，有8味中药对13株沙门菌
有抑 用,抑菌强度从强到弱依次为五、五味子、乌梅、诃、女贞子、石榴皮、苏木、黄苓。其中，五
Antibiotic Susceptibility Test of Salmonella Diarrhea in Calves and in vitro Bacteriostasis Tect of Traditional Chinese MePicine
LU Bv-xiny ，ZHAO An-qi ，LIU Cui-cui ，KANG Yuan-yuan ，MA Jin-hugn ， GAO Gui-sheng ，WU Tong--vi ，SHI Qiu-mvi ，ZHANG Zhi-qiang
mail: wszhangzhiqiang@ yeah. net
腹泻病是犊牛养殖过程中的常见疾病,导致犊
原因有许多，其中，沙
该病的重要病
原[1]$ 沙
病又称牛副伤寒，7~28
犊牛
易发病，主要临床 为发热、
水、
大
等，严时可引起败 而死亡，
犊
Hale Waihona Puke 主要 病原之一。，临床治疗沙 所致犊牛
腹泻病以抗生素类为主，但随着在临床治疗以及养
本试验对13株致犊牛腹泻的沙门菌对抗菌药 物和中药的敏感性进行检测，为临床治疗该病用药 提供理论支持。
1材料与方法
1.1主要试剂与药品中药:黄连、蒲公英、桔梗、板 蓝根、石榴皮、知母、紫花地丁、白头翁、秦皮、乌梅、苏 木、诃子、肉豆蔻、连翘、金银花、五倍子、女贞子、鱼腥 草、黄柏、柴胡、五味子、黄苓，均购自秦皇岛唐人医药 药店$药敏纸片,购自杭州天和微生物科技股份有限 公司。96孔细菌培养板，购自美国Cooing公司。2% 的氯化三苯四氮卩坐，购自北京索莱宝科技有限公司。 1-2菌株河北地区犊牛腹泻沙门菌地方流行株 （NS1 -NS13 ），由河北预防兽医重点实验室提供。 1.3菌液制备将冻存的犊牛腹泻沙门菌接种于 LB琼脂培养基，置于37 °C恒温培养箱培养12 h，挑 取单菌落接种于LB液体培养基中，置于37 C恒温 摇床培养过夜，次日以1：100的比例转接，于37 C 摇床培养至对数期（0Dm nm &0. 6 "，调整菌液浓度 至1 n106 CFU/mL后备用。 1.4沙门菌的抗菌药物敏感性试验 采取K-B纸 片法，参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）药物 敏感性试验方法检测13株沙门菌对氨节西林、头抱 曲松、阿莫西林等15种抗菌药物敏感性。试验结果 按照CLSI标准进行判定。 1.5中药药液制备采用传统的水煎煮法制备中 药药液。称量100 g中药，加入5~10倍量的蒸“水 浸泡1 h，浸泡后大火加热至煮沸，文火煎煮0.5 h，共 煎煮2次。将煎煮的药液合并，用纱布过滤后离心， 浓缩药液至100 mL即含生药浓度1 g/mL，高压后 分装，置于4 C冰箱备用。 1.6中药的体外抑菌直径的测定参考文献［78］，采用琼脂打孔法测定中药对13株沙门菌的体 外抑菌直径。每个LB平板加入100 $L 1. 3中制备 的菌液并涂匀，待平板吸收完全后用直径为6 mm 打孔器打孔,用酒精灯封底，每孔灌满1-5中制备
中国兽医杂志2021年（第57卷）第3期 27
的中药提取液（约0. 1 mL）,对照孔加入灭菌后的 PBS$置于37 C恒温培养箱培养12 h,测量抑菌 圈直径，试验重复3次，取3次抑菌圈直径的平均 值作为最终结果。判定标准:极敏（抑菌圈直径' 20 mm），高敏（20 mm ＞抑菌圈直径'15 mm）,中敏 （15 mm＞抑菌圈直径'10 mm）,低敏或耐药（抑菌圈 直径＜10 mm） $ 1.7中药的最小抑菌浓度（MIC）测定参考文献 ［7,9］，采用改良微量二倍稀释平板法测定中药的 MIC$在96孔细菌培养板的第2 ~ 11孔加入100 $L 灭菌蒸“水，第2孔加入100 $L1.5中制备的中药 提取液，混匀后取100 $L倍比稀释至第9孔后弃 100 $L,第2 ~ 11孔补加100 $L 2 x LB液体培养 基，在第2~10孔加入10 $L1.3中制备的菌液，第 10孔为阳性对照组,不加入中药液，第11孔为阴性 对照组，不加入菌液。置于37 C恒温培养箱培养 24 h。判定结果时，在培养板中加入5 $L 2%的氯 化三苯四氮卩坐（TTC），置于37 C恒温培养箱2 h,以 不显红的最高稀释孔的中药浓度为MIC。 1-8中药的最小杀菌浓度（MBC）测定 分别取 1-7中96孔培养板培养后的液体50 $L,涂布于LB 平板上，置于37 C恒温培养箱培养12 h。以无细菌 生长的中药浓度为MBC$
Chinese Journai of Veterinag Medicine
殖过程中抗菌药物的不合理应用，细菌耐药问题日 益严重，给细菌病的防治造成困难。因此,迫切需 要筛选出有效的抗菌药物指导临床用药。
中药是我国的传统药材，多属于天然药物，部 分中药具有抗菌、消炎、滋补、提高免疫力等作用， 并且价格低廉，不易产生耐性，毒副作用低，并有研 究表明，中药可以消除耐药质粒，对细菌耐药具有 逆转作用,降低细菌的选择压力（2-）$因此,研发中 药作为抗菌药物的替代药具有重要的现实意义。
摘要:为了测定15种抗菌药物与22味中药对河北地区犊牛腹泻沙门菌的抑菌效果，本研究采用K-纸片法检测13株
犊牛腹泻沙 对15种抗菌药的耐药性，采用 统的水煎煮法提取五 、五味子等22味中药，用琼脂打孔法测定中药液
的体外抑 径，用改良微量二倍稀释平板法测定中药最小抑
(MIC)和小杀
(MBC)$结果显示,13株沙门
26 中国兽医杂志2021年(第57卷)第3期
Chinese Journal of Veterinam Medicinv
犊牛
菌抗菌药敏感性试验
与中药体外抑菌试验
刘勃兴，赵安奇，柳翠翠，康圆圆，马金换，高桂生，吴同垒，史秋梅，张志强
(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛066004)