粪便病原检查技术

粪便病原检查技术
粪便检查是诊断寄生虫病常用的病原学检测方法，要取得粪便检查的准确结果，必须注意：保证粪便新鲜，送检时间一般不超过24小时，对原虫滋养体检查应立即送检，或暂时保存在
35~37℃条件下待查；盛粪便的容器须干燥、洁净，无尿液或水混入，无药物、泥土和其他杂物污染；严格按照粪检程序进行操作，特别是镜检时要熟悉各病原体的形态特点并遵循顺序观察的原则，以免漏检。

常用方法有以下几种：
一、直接涂片法
直接涂片法（direct smear methed）适用于检查蠕虫卵、原虫的包囊和滋养体。

方法简便，由于用标本较少，故检出率较低，若连续图片3张，可提高检出率。

1、蠕虫卵检查
取一清洁的载玻片，在玻片中央加一滴生理盐水。

再用竹签挑取绿豆（火柴头）大小的粪便一小块，均匀涂布于生理盐水中，涂片厚薄以透过涂片约能辨认书上的字迹为宜。

如果太厚，阻碍光线的透过，太薄则影响检查效果（必要时可加盖玻片）。

先用低倍镜观察，从左至右，由上到下顺序地移动载玻片或镜台推进器，仔细查找，找到被查物后，应将被查物移至视野中央，仔细辨认。

必要时可换高倍镜进一步观察。

观察粪便涂片时，镜台应平放，以免粪液下流污染镜台，同时影响观察。

镜检过程中应防止涂片干燥，如已干燥而不透明时，
可再加生理盐水，涂匀后继续观察。

粪便中常有很多与蠕虫卵相似的杂质，如食物残渣、气泡、脂肪滴、动植物细胞、植物孢子、淀粉颗粒等，必须仔细地与虫卵鉴别，以免误诊。

至于属何种杂质，不必花费过多的时间去研究，以免因此而分散注意力。

蠕虫卵的形态特征：人体检查的蠕虫卵种类较多，但它们皆有一定的形态特征，即有一定的形状、大小、颜色，明显的卵壳及特有的内容物（如卵细胞、卵黄细胞、幼虫等）。

但上述特征可因虫卵位置、死活、个体差异、发育情况、新鲜程度等而有所变化，必须分析情况，做出正确判断。

由于受检的粪量少，检出率较低，故常规检查每份粪便应取不同部位粪便查三片，必要时连续送检三次（三送三检），才可做出报告。

2、原虫检查
（1）活滋养体检查：方法同检查蠕虫卵，但涂片要薄而均匀。

气温低时要注意保温，必要时可用保温台保持温度，以使滋养体保持活动状态，便于观察。

（2）包囊的碘液染色检查：方法同检查蠕虫卵，以碘液代替生理盐水进行涂片。

碘液配方：碘化钾4g，溶于100ml蒸馏水中，再加入碘2g，溶解后储于棕色瓶中即可使用。

（3）隐孢子虫卵囊染色检查：目前最常用的方法是金胺-酚改良抗酸染色法，该法是采用金胺-酚染色法和改良抗酸染色发复染，以提高检出率和准确性。

检查时取患者腹泻的新鲜粪便或经4%甲醛溶液固定保存（4℃一个月内）的粪便，自然沉淀后
取底部粪便，于载玻片上涂成粪膜，干后先用金胺-酚染色，再用改良抗酸染色法复染。

①金胺-酚染色法（auramine-phenol）
染液配制：1g/L金胺-酚染色液（第一液）：金胺0.1g，石碳酸5.0g，蒸馏水100ml；3%盐酸酒精（第二液）：盐酸3%，95%酒精100ml；高锰酸钾溶液（第三液）：高锰酸钾0.5g，蒸馏水100ml。

染色步骤：滴加第一液于晾干的粪膜上，10~15分钟后水洗；滴加第二液，1分钟后水洗；滴加第三液，1分钟后水洗；干后置荧光显微镜下观察。

低倍荧光显微镜下，卵囊为一圆形小亮点，呈现乳白色荧光。

高倍镜下卵囊呈乳白或略带绿色，囊壁为一薄层，多数卵囊周围深染，中央淡染，似环状；核深染结构偏位，有些卵囊全部为深染。

有些标本可出现非特异性荧光颗粒，应注意鉴别。

②改良抗酸染色法（modified acid-fast stain）
染液配制：石碳酸复红染色液（第一液）：碱性复红4g，95%酒精20ml，石碳酸8ml，蒸馏水100ml；10%硫酸溶液（第二液）：纯硫酸10ml，蒸馏水90ml（边搅拌边将纯硫酸慢慢倾入水中）；20g/L孔雀绿液（第三液）：20g/L孔雀绿原液1ml，蒸馏水10ml。

染色步骤：滴加第一液于晾干的粪膜上，1.5~10分钟后水洗；滴加第二液，1~10分钟后水洗；滴加第三液，1分钟后水洗；
干后置显微镜下观察。

染色后，卵囊为玫瑰红色，圆形或椭圆形，背景为绿色。

如染色（1.5分钟）和脱色（2分钟）时间短，卵
囊内子孢子边界不明显；染色时间长（5~10分钟），脱色时间
相应延长时，子孢子边界明显。

卵囊内子孢子均染成玫瑰红色，子孢子呈月牙形，共4个，其他非特异颗粒则染成蓝黑色，易与卵囊区分。

③金胺-酚改良抗酸染色法：先用金胺-酚染色，再用改良抗酸染色发复染，然后再光镜下观察。

卵囊同改良抗酸染色法所见，但非特异性颗粒被染成蓝黑色，两则颜色明显不同，极易区别，使检出率和准确性明显提高。

二、厚涂片透明法
厚涂片透明法（改良加藤法，modified Kato’s thick smear）适合于检查蠕虫卵。

用大小约4cm×4cm的100目/英寸的尼龙网或钢筛覆盖在粪便标本上，刮取约50mg粪便于玻片上，用浸透
甘油-孔雀绿溶液的玻璃纸覆于粪便上，轻压粪便铺开约
20mm×25mm大小。

置于30~36℃温箱中约30分钟，或25℃约1
小时，待粪膜稍干病透明即可检查。

本法要注意掌握粪膜的合适厚度与透明时间，如粪膜过厚，透明时间短，虫卵难以发现；若透明时间过长，则虫卵变形，不易辨认。

玻璃纸的准备：将玻璃纸剪成22mm×30mm大小的小片，浸入甘油-孔雀绿溶液（含纯甘油100ml，水100ml和3%孔雀绿1ml 的水溶液）中浸泡24小时以上，直至玻璃纸呈现绿色。

三、浓集法（concentration method）
1、沉淀法（sedimentation method）
原虫包囊和蠕虫卵相对密度大于水，可沉于水底，使包囊或虫卵集中，有助于提高检出率。

但相对密度较小的钩虫卵和某些原虫包囊效果较差。

（1）自然沉淀法（natural sedimentation method）主要用于蠕虫卵的检查。

取粪便20~30g，加水调成混悬
液，经金属筛（40~60目）或两三层纱布过滤于500ml
锥形杯内，用水冲洗粪渣，再加水至杯口，静置20~30
分钟，倒去上清，再加满水再次沉淀，如此重复2~3次，
最后倾去上清，吸取沉淀涂片检查，检查血吸虫卵时，
沉淀时间不宜过长，尤其是在室温高于15℃时，卵内毛
蚴易孵化。

在检查包囊时，换水间隔时间应延长约6小
时，使包囊充分沉于水底。

（2）离心沉淀法（centrifugal sedimentation
method）
将上述滤去粗渣的粪便离心（1500~2000r/min）1~2分
钟，倒去上清，注入清水，再离心，如此反复3~4次，
直至上清液澄清为止，最后到去上清液，取沉渣镜检。

（3）汞碘醛离心沉淀法
（merthiolate-iodine-formaldehyde centrifugation sedimentation method，MIFC）
本法即可浓集，又可固定和染色，适合于原虫包囊、滋
养体以及蠕虫卵和幼虫的检查。

取粪便1g，加适量（约
10ml）汞碘醛溶液，充分混匀，用两层脱脂棉过滤，再
加入乙醚4ml，摇2分钟，离心（200r/min）1~2分钟，即分成乙醚、粪渣、汞碘醛及沉淀物四层。

吸取上三层，
取底层沉淀物镜检。

汞碘醛配制
①汞醛（MF）液：1/1000硫柳汞酊200ml，甲醛溶液（40%）
25ml，甘油50ml，蒸馏水200ml。

②卢戈液：碘5g，碘化钾10g，蒸馏水100ml。

检查时取汞醛液2.35ml及卢戈液0.15ml混合备用。

混合液保存8小时后即变质，不应再用，碘液一周后亦
不宜再用。

（4）醛醚沉淀法（formalin-ether
sedimentation）
取粪便1~2g置于小容器内，加水10~20ml调匀，用两层
纱布或100目金属筛网过滤，离心（200r/min）2分钟，
倒去上层粪液，保留沉渣，再加水10ml混匀，离心2
分钟，倒去上清，加10%甲醛溶液7ml。

5分钟后加乙醚
3ml，塞紧管口充分摇匀，取下管口塞，离心2分钟，即
可见管内自上而下分为四层。

取管底沉渣涂片镜检。

2、浮聚法（flotation method）
利用相对密度大的液体，使原虫包囊或蠕虫卵上浮，集中于液面。

常用的方法有两种：
（1）饱和盐水浮聚法（brine flotation）
此法适合于检查各种线虫卵，尤以检查钩虫卵效果最
好，也可检查带绦虫卵和微小膜壳绦虫卵，但不适宜
检查吸虫卵和原虫包囊。

方法：（1）、自粪便不同处
挑取如黄豆粒大小的粪便，置于盛有少量饱和盐水的
漂浮杯中；（2）、将粪便捣碎，与盐水搅匀，再加饱
和盐水，将满时，改用滴管，加致略高于杯口但不溢
出为止；（3）、取洁净载玻片一张盖在杯口上，静置
15分钟左右；（4）、垂直向上提起载玻片，敏捷地翻
转，覆以盖玻片镜检。

注意事项：（1）、粪便必须搅
拌均匀。

（2）、覆盖杯口的载玻片与液面接触，避免
产生气泡、防止盐水外溢。

（3）、掌握静置时间，不
宜过早或过迟提起载玻片。

（2）硫酸锌离心浮聚法（zine sulfate centrifugal flotation method）
此法用以检查原虫包囊、球虫卵囊、线虫卵及微小膜
壳绦虫卵。

取约1g粪便，加10~15倍的水，充分搅碎，
按离心沉淀法过滤，反复离心3~4次，最后倒去上清，
在沉渣中加入少量相对密度1.18的硫酸锌液（33%的
溶液），调匀后再加硫酸锌液至距管口约1cm处，离
心1分钟，用金属环接触液面轻轻钩取表面粪液至载
玻片上，加碘液一滴（查包囊）镜检。

离心后应立即
取标本检查，如放置时间超过1小时以上，包囊或虫
卵会变形而影响检查效果。

3、尼龙袋集卵法
尼龙袋集卵法主要用于血吸虫卵的浓集。

先将120目/英寸的尼龙袋套入260目/英寸的尼龙袋内（两袋底部均不黏合，分别用金属夹夹住）。

取粪便30g，放入搪瓷杯中加水捣碎调匀，经60目/英寸铜筛滤入内层尼龙袋中，然后将两个尼龙袋一起在清水桶内缓慢上下提动洗滤袋内粪便，或自来水莲蓬头下缓慢冲洗至袋内流出清水为止。

将内袋提出，取下外袋下端金属夹，将袋内粪渣全部洗入三角烧瓶内，静置15分钟。

倒去上清液，取沉渣镜检。

或将沉渣倒入三角烧甁内做血吸虫毛蚴孵化。

4、毛蚴孵化法（miracidium hatching method）
毛蚴孵化法为依据血吸虫卵内毛蚴在适宜温度的水中，短时间内可孵出的特性而设计的方法，适用于早期血吸虫病患者的粪便检查。

取粪便约30g，先经自然沉淀法或尼龙袋集卵法浓集处理，将粪便沉渣倒入三角烧瓶内，加清水至瓶口，在20~30℃的条件下，经4~6小时候用肉眼或放大镜观察结果。

如见水面下有白色点状物作直线来往游动，即为毛蚴。

必要时可用吸管将其吸出镜检。

如无毛蚴，每隔4~6小时（24小时内）观察一次。

气温高时，毛蚴可在短时间内孵出，因此要用1.2%食盐或冰水冲洗粪便，最后一次才用室温清水。

5、肛门拭子法（anal awab）
肛门拭子法适用于肛周产卵（蛲虫），或常可在肛门附近发现虫卵（带绦虫卵）的检查。

(1)棉签拭子法
先将棉签浸泡在生理盐水中，取出挤干过多的盐水，在肛
周擦拭，随后将棉签放入盛有饱和盐水的试管中，用力搅
动，迅速提起棉签，在试管内壁挤干盐水后弃去，再加饱
和盐水至液面稍高于管口，覆盖一载玻片，5分钟后取下
载玻片镜检。

也可用清水替换饱和盐水，采用自然沉淀或
离心沉淀法进行检查。

(2)透明胶纸法（cellophane tape）
用宽约2cm的透明胶纸剪成长约6cm的小段，一端向胶面
折叠约0.4cm（易于揭开）后，再贴在洁净的载玻片上。

检查时揭开胶纸，使胶面朝外，粘贴患者肛周皮肤，然后
将胶纸复位贴在玻片上镜检。

6、钩蚴培养法（culture method for hookworm larvae）
钩蚴培养法亦称滤纸培养法，为根据钩虫卵在适宜条件下在短时间内孵出幼虫的原理设计的方法。

取1cm×10cm的洁净试管一只，加冷开水约1.5~2ml。

将滤纸剪成与试管内经等宽但较试管稍短的T字形纸条，用铅笔在纸条横条部分写上受检者姓名或编号、受检日期。

用竹签挑取约0.4g粪便均匀涂于滤纸中2/4处，再将纸条插入试管，下端浸泡在水中，以粪便不接触水面为宜。

在20~30℃条件下培养，培养期间每天沿管壁补充冷开水，以保持液面高度。

3天后用肉眼或放大镜检查试管底部。

钩蚴在水中常作蛇样运动。

如无钩蚴，可继续培养观察至第5天。

如需做虫种鉴定，应从管底吸取钩蚴镜检。

气温太低时可将培养管放入温水（30℃左右）中数分钟后再做镜检。

7、淘虫检查法
为考核驱虫效果，常需从粪便中淘取蠕虫进行鉴定与计数。

取患者服药后24~72小时的全部粪便，加水搅拌，用筛（40目）
或纱布滤去粪渣，经水反复冲洗后，倒在盛有清水的大型玻皿中，器皿下衬以黑纸，检出混在粪渣中的虫体进行鉴别。

8、带绦虫孕节检查法
将绦虫节片用清水洗净，置于两玻片之间，轻轻压平，对光观察内部结构，并根据子宫分支情况鉴定虫种。

也可用注射器从孕节后端正中插入子宫慢慢注射碳素墨水，待子宫分支显现后计数。