#TaqMan实时荧光定量RT

TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测ERCC1变异剪接体
检测平台的建立
前言
对一个基因的各个变异剪接体分别进行精确定检测是深入研究变异剪接的基础。

在TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术( TaqMan real-time quantity RT-PCR)出现前，传统的检测方法有4种[1, 2]：（1）Northern blot; (2)核酶保护分析；（3）相对定量RT-PCR，（4）竞争定量RT-PCR这些方法都有其内在的局限性。

Northern blot耗时，随时面临RNA降解的困扰，而且灵敏度不高，需要相对大量的RNA 才能检测出来，仅仅适合相对定量分析[3]。

核酶保护分析比Northern blot相对灵敏，但是仍然耗时而且需要相对大量的RNA才方便检测[4-8]。

相对定量RT-PCR 则需要在每个反应的指数扩增期停止反应后进行凝胶电泳分析，由于每个样本的起始拷贝数不一致，很难确保每个样本均处于相同的指数扩增期。

而且此方法需要将PCR产物进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，增加了步骤，而且增加了污染的可能性[9]。

竞争定量RT-PCR则需要根据不同的目的基因片断构建相应的竞争子，然后需要确定每个反应体系中竞争子和目的基因的不同比例，不仅仅耗时而且繁琐，更重要的是竞争子的构建不仅仅需要很大的技巧性，而是是一件极其艰难的工作[10, 11]。

这些传统技术不仅繁琐耗时，而且对mRNA的质量要求较高，结果不稳定。

而且，这些传统的方法由于方法学上的差异性，导致研究结果不十分可靠，各研究机构之间的结果差异较大。

应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术则可以分别精确检测各个变异剪接体的表达量，结果稳定，可重复性高，方便快捷，程序简单，无需后续处理，几无污染[1, 12-14]。

本研究拟建立对切除修复交叉互补基因1即ERCC1（excision repair cross-complementation group 1）变异剪接体的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测平台，为深入研究ERCC1的变异剪接奠定基础[15]。

TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术的基本原理是通过设计与目的序列互补的一段寡核苷酸作为TaqMan探针，在此探针的5’端标记报告基团（如FAM），在3’端标记淬灭基团（如TAMRA）。

当探针完整时，报告基团所发射的荧光通过荧光共振能量传递（FRET）被淬灭基团所吸收，从而不能检测到其荧光。

Taq 酶则具有5’外切酶活性，在PCR的延伸阶段，可以从探针的5’端将报告基团水
解掉，并将整个探针完全水解，使得报告基团和淬灭基团的原有空间结构被打散，荧光共振能量传递不复存在，从而可以探测到反应体系中报告基团所发射的荧光。

随着PCR循环的增加，荧光也不断的累加，从而反映产物的生成情况[16-18]。

在研究变异剪接时，只需要将TaqMan探针设计在发生了变异剪接的外显子的前后邻近两个外显子处，即跨在前一个外显子的末端和后一个外显子的前端，便可检测到目的变异剪接体的表达量。

在不同的探针上标记不同的荧光物质，便可以在同一个反应体系中同时检测各个变异剪接体的表达量[12, 19-21]。

变异剪接（alternative splicing）是真核生物中广泛存在的一个现象[22-27]，可以调节基因的表达水平[28]，增加蛋白质的多样性[29, 30]，并对肿瘤的生物学行为有很大的影响[22, 27, 31-34]，和肺癌[13]、乳腺癌[35-37]、卵巢癌等的发生发展存在一定的关系。

ERCC1是核酸切除修复系统NER（nucleotide excision repair）的一个关键基因，在以铂类为基础的化疗中扮演着重要角色。

铂类药物通过与细胞DNA形成加合物（Pt-DNA adducts）从而杀伤肿瘤细胞，NER则可以通过切除加合物并修复被损伤的DNA，从而降低化疗的效果。

研究表明ERCC1的mRNA表达量与肿瘤患者的化疗敏感性和生存时间具有一定的相关性[38]。

ERCC1基因共10个外显子，细胞中存在不同比例的两种形式的剪接体，为含10个外显子的全长剪接体mRNA (full length, FL),和缺失第VIII外显子（长72bp），仅含9个外显子的变异剪接体mRNA( alternative splicing, AS)[39-41]。

1 ERCC1基因结构特征分析（文章写作不规范，[ERCC1基因结构特征分析]一节是属于材料方法，还是前言部分？我认为这部分ERCC1在GenBank的背景，可以放在综述里）
根据GenBank数据库提供的信息，ERCC1基因ID为GeneID: 2067，位于19号染色体长臂，处于19q13.2-q13.3位置。

ERCC1在染色体的位置：chromosome: 19; Location: 19q13.2-q13.3
Official Symbol ERCC1 and Name: excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 1 (includes overlapping antisense sequence) [Homo sapiens]
Other Aliases: COFS4, UV20
Other Designations: excision repair cross-complementing 1; excision repair protein Chromosome: 19; Location: 19q13.2-q13.3
Annotation: Chromosome 19, NC_000019.8 (50604712..50619017, complement) MIM: 126380
GeneID: 2067
ERCC1是研究比较多的基因，ERCC1在染色体的位置图可以在文章中不列出，而且ERCC1基因的染色体位置，与其外显子剪切无关。

基因组全长14306 bp，转录为含有10个外显子的mRNA全长为1101bp，编码氨基酸的mRNA序列从147开始至1040结束，共计894bp是编码氨基酸的序列，以ATG作为起始密码子，以TGA作为终止密码子（任何一个蛋白质都是与ATG 为起始密码子，以TGA作为终止密码子，这句多余）。

产物ERCC1蛋白含297个氨基酸。

编码核酸序列占基因组核酸的6.25%。

每个外显子的长度在100bp左右，最长外显子是第III外显子，长216bp,最短外显子是第IX外显子，长69bp，平均外显子长度是110bp。

ERCC1基因内含子与外显子的序列
Exons and Intron of ERCC1 Gene
成熟的全长ERCC1 mRNA含有10个外显子，全长1101bp，从1至146bp是3’非编码区3’UTR (3’ untranslated region)，从1041到1101是5’非编码区5’UTR (5’untranslated region)
ERCC1基因mRNA的结构分析
The structure of ERCC1 mRNA
使用BLAST在人基因组和转录子库里面比对ERCC1的mRNA序列，可以发现ERCC1的mRNA序列是非常特异的。

（在人基因组和转录子库里比对，应用的是贪婪比对法则，而且只与人的基因组比对，当然只有ERCC1可比对，这些与外显子检测无关，可删除）
ERCC1基因的BLASTA同源性比对
Homology of ERCC1 gene using BLASTA software（删除）
第八外显子72bp序列GTGACTGAATGTCTGACCACCGTGAAGTCAGTCAACAAAACGGACAGTCA GACCCTCCTGACCACATTTGGA
2. ERCC1全长及缺失第VIII外显子变异剪接体TA质粒的构建（这一节属方法部份，放到方法里）
试验流程如下：
TRIZol 提取RNA PCR 产物克隆至pMD18-T 载体
Oligo (dT)18逆转录cDNA
转化入感受态大肠埃希氏菌并筛选扩增
TaqMan 实时荧光定量PCR 新鲜卵巢癌组织
PCR 扩增ERCC1的CDS 序列，beta-actin
目的片断
抽提质粒，稀释成不同浓度作为标准品
2.1 材料与试剂
2.1.1 标本
标本组织来源来自正常卵巢组织（标本来源单位，时间，何种病人，正常人是不可能被切卵巢的），标本切下后迅速置于液氮中保存直至提取RNA 时取出。

质粒与菌株
大肠埃希菌（DH-5à） Escherichia Coli ，E.Coli 为本实验室保存留种。

pMD18-T TA 克隆质粒够自日本Takara 公司[42, 43]。

其结构如下：
pMD18-T质粒结构和酶切位点示意图
The structure and enzyme site of pMD18-T Vector
2.1.2 主要仪器
超速低温离心机德国西门子公司（本实验室没有该品牌）TGL-16C台式高速离心机上海安亭科学仪器厂
Gel doc 2000凝胶成像分析系统美国Bio-Rad公司（本实验室没有该品牌）紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司
PCR扩增仪美国热电公司Thermo electron corporation
电动玻璃匀浆机宁波玻璃仪器厂
OLYMPUS光学显微镜日本OLYMPUS公司
恒温水浴箱国产
冰浴加样盒国产
桥式水平电泳仪槽北京崇文东方仪器厂
DYY-型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂
Eppendorf管国产
微量移液器美国Gilson公司
超低温冰箱中国海尔公司
荧光定量PCR管0.2ml--------------薄壁美国Cepheid 公司Smartcycler ？？？/ 2.1.3试剂
(1) TRizol 试剂购自Invitrogen公司
(2)First Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录试剂盒购自MBI Fermentas 公司，内含：
M-Mulv 反转录酶
Oligo(dT)18 (0.5μg/μl)
高浓度dNTP 10mM dNTP
RNA酶抑制剂Rnasin inhibitor
5×reaction buffer
(3) Taq PCR Master Mix 购自TIANGEN生物有限公司
(4)DNA片段纯化回收试剂盒购自日本宝生物TaKaRa公司
(5)氨苄青霉素贮存液(100μg/ml) -20℃保存备用
(6)LB培养基：
NaCl 10g; Yeast extract 5g; Tryptone 10g; 加蒸馏水溶解,用5M NaOH调至7.0,定容至1000ml，高压灭菌消毒20min。

若加氨苄青霉素到终浓度为100μg/ml 则为AMP(+)，不加氨苄青霉素为AMP(-)。

(7)SOC培养基：
Tryptone 2.0g；Yeast extract 0.5g；NaCl 0.05g；0.25M KCl 1.0ml；5M NaOH 调节PH值至7.0，加蒸馏水至100ml，高压消毒。

使用前加入2mol/L MgCl2 0.5ml 和1M 葡萄糖2ml（过滤除菌）。

(8)感受态细胞制备CaCl2: 连云港润泰化工有限公司
(9)LB培养板：
营养琼脂15g，加LB培养基100ml，高压灭菌，冷却至50℃-60℃时，加入氨苄青霉素使终浓度为100μg/ml，每只无菌平皿中（直径φ10cm）倒入15ml，超净台中紫外灯照射下冷却，即为Amp(+)，同时制备不含氨苄青霉素的LB培养板，为Amp(-)，作为对照使用。

(10)DL2000 DNA Marker 购自大连宝生物公司
(11)异丙醇、无水乙醇国药集团化学试剂有限公司
(12)焦碳酸二乙酯(DEPC) 上海生物工程公司
(13)三氯甲烷（氯仿）东风化工厂
(14)溴化乙锭EtBr 上海生物工程公司
(15)琼脂糖上海捷瑞生物技术公司
(16) 50×TAE BIOWEST AGAROSE公司
2.1.4 试剂配置
(1) 0.1%DEPC水配制
0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）是RNA酶的强烈抑制剂，所有接触RNA的器具均需经过含0.1%的DEPC的水浸泡过夜以便去器具上面沾染的RNA酶，浸泡后高温高压消毒。

1000ml双蒸水中加入1ml DEPC，充分震荡混匀，配制成含0.1%DEPC的水备用。

含0.1%DEPC的水放置过夜，大概16小时后，吸取100ml，经高温高压30min 后，即可除去DEPC，成为不含RNA酶的水。

可用于RNA的提取和逆转录。

(2) RNA酶的去除
RNA酶可以降解RNA, 破坏RNA的完整性,影响试验结果，所以在提取RNA的整个过程都要严防RNA酶的存在。

为减少RNA酶的污染，所用的Tip头、Eppendorf离心管等塑料制品均先用0.1%二乙基焦碳酸酯(DEPC水)浸泡过夜，后高压消毒除去残存的DEPC，进口塑料管已经过射线消毒，可直接使用；其它玻璃、陶瓷器皿均需先水洗晾干后，再经重铬酸钾-硫酸洗液浸泡过夜，洗净后200℃干烤4-6小时，方能使用。

所以物品均现配现用。

(3) EtBr溶液的配制
溴化乙锭EtBr是有毒物质，皮肤不可以直接接触，整个配置过程都要戴橡胶手套，在通风厨中进行。

配置的溴化乙锭贮存浓度为10mg/ml，工作液的浓度为200μg/ml。

首先将溴化乙锭0.5g溶解于50ml三蒸水中，充分搅拌溶解后放置于棕色瓶中4℃避光保存。

使用时取10mg/ml的贮存液200μl稀释于10ml三蒸水中。

（4）50×TAE电泳缓冲液的配制
Tris 12.1g
0.5mmol/L EDTA(PH=8.0) 5.0ml
冰醋酸 2.9ml
首先称取Tris12.1g加入40ml三蒸水中，依次加入0.5mmol/L EDTA(PH=8.0) 5.0ml，冰醋酸2.9ml，充分搅拌溶解后用三蒸水补足至50ml，高压灭菌后室温保存，作为贮存液。

使用时，取20ml加蒸馏水至1000ml，即得1×TAE的工作液。

（5）不同浓度琼脂糖凝胶配制
①1.0％琼脂糖凝胶50ml
琼脂糖0.5g
1×TAE 50ml
②1.5％琼脂糖凝胶50ml
琼脂糖0.75g
1×TAE 50ml
称取所需剂量的琼脂糖粉末，加入所需体积的TAE缓冲液中，置于微波炉中间断加热，使琼脂糖完全溶解，其间不断缓慢摇动锥形瓶，使贴于壁上的琼脂充分溶解。

冷却至50℃左右，加入200μg/ml溴化乙锭(EB液)125μl混匀(使终浓度为0.5μg/ml)。

（6）SOB培养基
将下列组分溶解在0.9L水中：
蛋白胨20g
酵母提取物5g
氯化钠0.5g
1 mol/L 氯化钾2.5ml
用水补足体积到1L。

分成100ml的小份，高压灭菌。

培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁。

(7) SOC培养基
成分、方法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml 的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁外，再加2ml灭菌的1mol/L葡萄糖（18g 葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌）。

(8) IPTG溶液配制方法
IPTG为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量为238.3），在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

（9）X-gal溶液配制方法
X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。

用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的贮存液。

保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃。

X-gal溶液无须过滤除菌。

3 方法
3.1 总RNA提取
3.1.1RNA提取原理
RNA是极易受到RNA酶的降解，在提取RNA过程中最关键的是抑制RNA酶活性,所以的用具均需经过含0.1%DEPC的水浸泡过夜后高温高压消毒。

RNA提取基本原理是通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。

已经有商品化的RNA提取试剂盒出售，如美国Invitrogen公司的TRIZol和日本Takara公司的RNAiso。

本试验采用美国Invitrogen公司的TRIZol试剂提取RNA。

TRIZol为高浓度强变性裂解液，可迅速破坏细胞结构，使RNA从细胞中释放出来，同时Trizol试剂还含有Rnase 抑制剂使细胞内RNA酶失活，RNA不被降解，同时氯仿能将细胞碎片、DNA、蛋白质与RNA分离开来，得到纯化的总RNA，焦碳酸二乙酯(DEPC)是一种强烈的RNA酶抑制剂，用它来浸泡实验所用器具，及配制70%乙醇，保证实验过程不产生RNA酶污染，并且使所得RNA有较高的纯度，几乎不含有基因组DNA[44, 45]。

3.1.2实验步骤：
本次研究采用美国Invitrogen公司生产的Trizol试剂一步法[44, 46, 47]提取卵巢组织总RNA，以便得到高质量的RNA用于目的基因的克隆。

(1) 手术切除的卵巢癌组织约200mg迅速置于液氮中，在液氮中使用研钵将卵巢癌组织研磨成粉末后加入Trizol 试剂1mL，充分混匀。

(2) 将全部匀浆液转入1.5mL离心管中，加0.25mL氯仿，充分振荡混匀，冰浴15min。

(3) 在4℃低温下13000rpm，离心15min。

(4) 小心吸取上层水相至另一1.5mL离心管中，RNA存在于上层水相，在吸取时注意不要吸到蛋白层或有机相，以免蛋白等杂质的污染。

加等体积异丙醇，摇匀，室温放置10min，在4℃低温13000rpm，离心15min，沉淀RNA。

(5) 加70%乙醇漂洗沉淀，5000rpm，离心10min，小心弃去乙醇，空气中干燥10min。

(6) 加入50μl 经DEPC处理过的，不含RNA酶的水完全溶解总RNA。

3.13 总RNA的定量及纯度测定：
为了检测所提取RNA的纯度和质量，使用紫外分光光度计测量RNA溶液的吸光值，并使用琼脂糖凝胶电泳检测条带。

(1) 总RNA定量分析：用ddH2O稀释3µLRNA样品至150µL，充分混匀；用紫外分光光度仪测总RNA的OD260、OD280的吸光值，计算OD260/OD280比值，比值大于1.80，表明纯度符合要求，如低于此值，表明存在蛋白质污染，需重新用酚/氯仿抽提。

通过OD260值计算RNA总浓度：
总RNA浓度(ug/µL)=(A260 ×40×稀释倍数)/1000
(2) 琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性：选用专用电泳槽、制胶板、梳子，先用无水乙醇擦洗，晾干后用0.1％DEPC处理过的ddH2O彻底冲洗，再用无水乙醇洗一次，待乙醇挥发后即可使用。

制备1％琼脂糖凝胶，其中含有0.5μg/ml的溴化乙锭以便使PCR产物在紫外灯下显色。

取2µL总RNA溶液加1µL上样缓冲液点样，以5V/cm稳压电泳，紫外灯下可见28s、18s两条清晰的条带，但是有时5s条带并不能总是理想的显示，但是本次提取的总RNA是从新鲜的卵巢癌组织中提取所得，5s条带显示较好。

Bio-rad凝胶成像仪成像，使用quality-one 软件分析知其28S条带亮度是18S亮度的2倍（看不出来）。

结果见图。

28s rRNA
18s rRNA
5s rRNA
3.2 逆转录cDNA
3.2.1引物的选择：
以提取到的总RNA作为模板，使用引物和逆转录酶逆转录成cDNA.通常可以选用的引物有三种：
1. 胸腺嘌呤寡聚体Oligo（dT）18
2. 随机六聚体引物random hexamer primer
3. 序列特异的引物sequence-specific primer
细胞内的mRNA在3’端为polyA，Oligo（dT）18作为引物与polyA互补，使用Oligo（dT）18作为引物能够将所提取的总RNA中含有polyA 的mRNA逆转录为cDNA，所得到的cDNA利于后续的PCR扩增基因全长，利于构建基因全长的载体，而且对于引物与总RNA的比例要求不严体，不需要对引物与总RNA 的比例进行优化。

随机六聚体引物为四种脱氧核糖核酸(A,T,G,C)的随机组合，使用此引物逆转录的cDNA长短不一，随机六聚体引物与总RNA的物质的量的比例对所得到的cDNA 长度有关键性的影响，提高引物与总RNA的比例能够得到较短的cDNA产物，通常小于500bp; 如果降低引物与总RNA的比例则使长的cDNA产物增长。

因此实验前对随机六聚体引物与总RNA的比例进行优化是必要的。

序列特异的引物则适用于单管RT-PCR(one tube),逆转录的引物是针对目的基因
而设计的。

Oligo（dT）18与随机六聚体引物适用于两管RT-PCR。

(tow tube).
本研究采用两管（步？）RT-PCR法，使用Oligo（dT）18作为逆转录引物以便克隆得到目的基因ERCC1基因的全长序列。

3.2.2逆转录酶的选择
目前广为使用的逆转录酶是四种，具体如下：
1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H 活性相对较弱。

最适作用温度为37℃。

2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适作用温度为42℃。

3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。

此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

本次研究采用Fermentas公司的Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase，(M-MuLV RT),此酶具有低的RNase H活性,以便从较长的模板（最长可达13kb）中得到全长cDNA序列。

3.2.3具体步骤详细叙述如下：
所有操作均在冰上进行。

在0.5ml Eppendorf管内加入以下反应体系：
①总RNA 0.5-5µg
Oligo(dT)181µl
RNase free水至总体积12µl
稍离心混匀后，70℃反应5分钟，立即置于冰上冰浴5分钟
②依次加入以下各成分：
5×Reaction Buffer 4µl
10mMdNTP Mix 2µl
RNA酶抑制剂(RiboLock Ribonuclease inhibitor)(20u/µl) 1µl
稍离心混匀各成分，37℃下反应5分钟
③加逆转录酶M-MuLV(200u/µl) 1µl
42℃反应60分钟
72℃10分钟灭活逆转录酶
④迅速置于冰浴中5分钟，以防cDNA结合成双链
⑤-20℃保存。

⑵质量检测：制作含有0.5μg/ml溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶，然后加入逆转录产物4µl及上样缓冲液2ul，电泳使溴酚蓝前移2cm左右，凝胶成像分析仪可见较宽的电泳区带呈片状。

这个图更象基因组的DNA的电泳图，cDNA产物应是弥漫状的，建议不要。

3.3引物设计
根据GenBank提供的信息，ERCC1基因mRNA序列号：NM_001983.2，分析ERCC1基因的序列同源性，可以发现ERCC1序列比较特异，与其它基因相似性较小。

使用Primer-BLAST设计引物，为了得到ERCC1基因编码序列CDS全长，设计引物时，使上游引物恰好处于编码起始位置，下游引物处于编码结束位置，同时避开单核苷酸多态性SNP位点，避免非特异性扩增。

product length = 894
Forward primer 1 ATGGACCCTGGGAAGGACAAAG 22
Template 147 (168)
Reverse primer 1 TCAGGGTACTTTCAAGAAGGG 21
Template 1040 (1020)
1 CCGGAAGTGC TGCGAGCCCT GGGCCACGCT GGCCGTGCTG GCAGTGGGCC
51 GCCTCGATCC CTCTGCAGTC TTTCCCTTGA GGCTCCAAGA CCAGCAGGTG
101 AGGCCTCGCG GCGCTGAAAC CGTGAGGCCC GGACCACAGG CTCCAG ATGG
151 ACCCTGGGAA GGACAAAG AG GGGGTGCCCC AGCCCTCAGG GCCGCCAGCA
201 AGGAAGAAAT TTGTGATACC CCTCGACGAG GATGAGGTCC CTCCTGGAGT
251 GGCCAAGCCC TTATTCCGAT CTACACAGAG CCTTCCCACT GTGGACACCT
301 CGGCCCAGGC GGCCCCTCAG ACCTACGCCG AATATGCCAT CTCACAGCCT
351 CTGGAAGGGG CTGGGGCCAC GTGCCCCACA GGGTCAGAGC CCCTGGCAGG
401 AGAGACGCCC AACCAGGCCC TGAAACCCGG GGCAAAATCC AACAGCATCA
451 TTGTGAGCCC TCGGCAGAGG GGCAATCCCG TACTGAAGTT CGTGCGCAAT
501 GTGCCCTGGG AATTTGGCGA CGTAATTCCC GACTATGTGC TGGGCCAGAG
551 CACCTGTGCC CTGTTCCTCA GCCTCCGCTA CCACAACCTG CACCCAGACT
601 ACATCCATGG GCGGCTGCAG AGCCTGGGGA AGAACTTCGC CTTGCGGGTC
651 CTGCTTGTCC AGGTGGATGT GAAAGATCCC CAGCAGGCCC TCAAGGAGCT
701 GGCTAAGATG TGTATCCTGG CCGACTGCAC ATTGATCCTC GCCTGGAGCC
751 CCGAGGAAGC TGGGCGGTAC CTGGAGACCT ACAAGGCCTA TGAGCAGAAA
801 CCAGCGGACC TCCTGATGGA GAAGCTAGAG CAGGACTTCG TCTCCCGGGT
851 GACTGAATGT CTGACCACCG TGAAGTCAGT CAACAAAACG GACAGTCAGA
901 CCCTCCTGAC CACATTTGGA TCTCTGGAAC AGCTCATCGC CGCATCAAGA
951 GAAGATCTGG CCTTATGCCC AGGCCTGGGC CCTCAGAAAG CCCGGAGGCT
1001 GTTTGATGTC CTGCACGAG C CCTTCTTGAA AGTACCCTGA TGACCCCAGC
1051 TGCCAAGGAA ACCCCCAGTG TAATAATAAA TCGTCCTCCC AGGCCAGGCT
1101 C
//（用Vector软件将序列排版，太难看，以下均同）
ERCC1引物扩增CDS全序列，斜黑体下划线表示引物序列
所得引物在GenBank中比对，特异性较强，最大得分MaxScore 44.1，总得分Total Score86.2, 期望值E值为0.007。

3.3.1内参基因的选择
为了去除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异,通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。

内参基因扩增中的变化可以反映RNA产量、质量和/或cDNA合成效率的变化。

选择适当的内参基因以减少检测标本间的差异是必须的。

内参基因应具备的条件理想的内参基因应该满足以下条件:
①不存在假基因(pseudogene),以避免基因组DNA的扩增;
②高度或中度表达,排除太高或低表达;
③稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞),而且其表达量是近似的,无显著性差别;
④表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关;
⑤其稳定的表达水平与目标基因相似;
⑥不受任何内源性或外源性因素的影响,如不受任何实验处理措施的影响。

排除内参基因的条件则为:
①在正常和异常的细胞/组织中的表达存在差异;
②呈现细胞周期依赖的表达;
③定位于X染色体。

本次研究选择人beta-actin作为内参基因，可以满足以上条件。

3.3.2内参引物设计
根据GenBank提供的人beta-actin (ACTB, Homo sapiens),序列信息，NM_001101.2，分析beta-acti基因的序列同源性，可以发现beta-actin序列比较特异，与其它基因相似性较小。

使用Primer-BLAST设计引物，设计人β-actin 的引物，同时避开单核苷酸多态性SNP位点，避免非特异性扩增。

以便在定量PCR中作为内参照使用。

1 CGCGTCCGCC CCGCGAGCAC AGAGCCTCGC CTTTGCCGAT CCGCCGCCCG
51 TCCACACCCG CCGCCAGCTC ACCATGGATG ATGATATCGC CGCGCTCGTC
101 GTCGACAACG GCTCCGGCAT GTGCAAGGCC GGCTTCGCGG GCGACGATGC
151 CCCCCGGGCC GTCTTCCCCT CCATCGTGGG GCGCCCCAGG CACCAGGGCG
201 TGATGGTGGG CATGGGTCAG AAGGAT TCCT ATGTGGGCGA CGAG GCCCAG
251 AGCAAGAGAG GCATCCTCAC CCTGAAGTAC CCCATCGAGC ACGGCATCGT
301 CACCAACTGG GACGACATGG AGAAAATCTG GCACCACACC TTCTACAATG
351 AGCTGCGTGT GGCTCCCGAG GAGCACCCCG TGCTGCTGAC CGAGGCCCCC
401 CTGAACCCCA AGGCCAACCG CGAGAAGATG ACCCAGATCA TGTTTGAGAC
451 CTTCAACACC CCAGCCATGT ACGTTGCTAT CCAGGCTGTG CTATCCCTGT
501 ACGCCTCTGG CCGTACCACT GGCATCGTGA TGGACTCCGG TGACGGGGTC
551 ACCCACACTG TGCCCATCTA CGAGGGGTAT GCCCTCCCCC ATGCCATCCT
601 GCGTCTGGAC CTGGCTGGCC GGGACCTGAC TGACTACCTC ATGAAGATCC
651 TCACCGAGCG CGGCTACAGC TTCACCACCA CGGCCGAGCG GGAAATCGTG
701 CGTGACATTA AGGAGAAGCT GTGCTACGTC GCCCTGGACT TCGAGCAAGA
751 GATGGCCACG GCTGCTTCCA GCTCCTCCCT GGAGAAGAGC TACGAGCTGC
801 CTGACGGCCA GGTCATCACC ATTGGCAATG AGCGGTTCCG CTGCCCTGAG
851 GCACTCTTCC AGCCTTCCTT CCTGGGCATG GAGTCCTGTG GCATCCACGA
901 AACTACCTTC AACTCCATCA TGAAGTGTGA CGTGGACATC CGCAAAGACC
951 TGTACGCCAA CACAGTGCTG TCTGGCGGCA CCACCATGTA CCCTGGCATT
1001 GCCGACAGGA TGCAGAAGGA GATCACTGCC CTGGCACCCA GCACAATGAA
1051 GATCAAGATC ATTGCTCCTC CTGAGCGCAA GTACTCCGTG TGGATCGGCG
1101 GCTCCATCCT GGCCTCGCTG TCCACCTTCC AGCAGATGTG GATCAGCAAG
1151 CAGGAGTATG ACGAGTCCGG CCCCTCCATC GT CCACCGCA AATGCTTCTA
1201 GGCGGACTAT GACTTAGTTG CGTTACACCC TTTCTTGACA AAACCTAACT
1251 TGCGCAGAAA ACAAGATGAG ATTGGCATGG CTTTATTTGT TTTTTTTGTT
1301 TTGTTTTGGT TTTTTTTTTT TTTTTGGCTT GACTCAGGAT TTAAAAACTG
1351 GAACGGTGAA GGTGACAGCA GTCGGTTGGA GCGAGCATCC CCCAAAGTTC
1401 ACAATGTGGC CGAGGACTTT GATTGCACAT TGTTGTTTTT TTAATAGTCA
1451 TTCCAAATAT GAGATGCATT GTTACAGGAA GTCCCTTGCC ATCCTAAAAG
1501 CCACCCCACT TCTCTCTAAG GAGAATGGCC CAGTCCTCTC CCAAGTCCAC
1551 ACAGGGGAGG TGATAGCATT GCTTTCGTGT AAATTATGTA ATGCAAAATT
1601 TTTTTAATCT TCGCCTTAAT ACTTTTTTAT TTTGTTTTAT TTTGAATGAT
1651 GAGCCTTCGT GCCCCCCCTT CCCCCTTTTT GTCCCCCAAC TTGAGATGTA
1701 TGAAGGCTTT TGGTCTCCCT GGGAGTGGGT GGAGGCAGCC AGGGCTTACC
1751 TGTACACTGA CTTGAGACCA GTTGAATAAA AGTGCACACC TTA
//
ACTB引物扩增全序列，斜黑体下划线表示引物序列
所得引物在GenBank中比对，特异性较强，最大得分MaxScore 36.2，总得分Total Score72.4, 期望值E值为1.3。

3..3.3引物的溶解稀释
由于合成后的引物Olig Primer呈膜状附在管壁上，在使用前先瞬时离心，再轻轻打开管盖。

加入灭菌的去离子水，稀释成100 μmol/m l的贮存液，在使用前调整终浓度至所需的工作液浓度，置于-20℃保存。

3.3.4 PCR扩增目的片断
3.3.
4.1 PCR原理
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核
酸扩增技术。

它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性(Denaturation step)：模板DNA经加热至93℃～95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火(复性) (Annealing step)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃～60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸(Extension/elongation step)：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

④最后延伸（Final elongation）：为了使PCR充分延伸，一般在充分循环后，最后72℃充分延伸。

⑤保持温度（Final hold）:PCR程序结束后将反应体系保存于4℃，直至后续处理。

PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。

短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。

短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。

进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。

引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。

不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得
PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

PCR反应原理
The PCR reaction
3.3.
4.2 PCR条件优化：
为了使PCR反应达到最优化，在扩增目的基因前先对PCR进行退火温度和镁离子浓度的优化。

退火温度的优化
退火温度Annealing temperature对PCR反应有极其关键的影响，首先根据Primer Premier5.0的计算分析结果，显示最佳退火温度Ta为60.5℃，据此在进行温度梯度PCR(gradient PCR)时选择的温度范围为55℃～65℃。

共配制10管反应混和
液，每管12.5μl，共计12.5μl×10管。

本次研究采用“冷启动”（cool start）即配置反映体系的过程均在冰上进行，以增强反应的特异性。

在冰上配置如下试剂：（冷启动是PCR反应原则，不用特别列出）
试剂体积（μl）
γTaq酶(5U•μl-1) 0.25×3
10×PCR Buffer（Mg2+Free）5×3
(25mmol•l-1) 3×3
MgCl
2
dNTP Mixture(各2.5 mmol•l-1) 4×3
模板质粒5×3
Primer Forward（50μmol•l-1) 1×3
Primer Reverse（50μmol•l-1) 1×3
无菌水加水至50μl×3=150μl 配置完混合液后分装于10个PCR管，每管12.5μl。

置于梯度PCR仪上进行反应，设置温度梯度为55℃～65℃
PCR反应温度和时间控制：（请参照相关文章，按标准格式写作）
95℃预变性5min；
94℃变性1min,
55℃～65℃退火1min,
72℃延伸1min,
36个循环；
72℃延伸10min，
于4℃保存。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物
原理：琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过α（1→3）和β（1→4）糖苷键交替构成的线状聚合物。

L-半乳糖残基在3和6位之间形成脱水连接。

琼脂糖链构成螺旋纤维，后者再聚合成半径20-30nm的超螺旋结构。

琼脂糖凝胶可以构成一个直径从50nm到略大于200nm的三维筛孔的通道。

琼脂糖电泳时，DNA在高于其等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，其分子的大小与其在琼脂糖凝胶中的迁移速率成反比，不同构像DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率也不。