G25脱盐——精选推荐

G25装柱
wd19831217 (站内联系TA)
G25粉末应该先要溶胀的，先用沸水煮一下或者直接放去离子水里面2-3d，然后装柱时主要要倒掉漂浮的小颗粒，如果是国产的一般柱子的话，胶的表面最好上个滤纸片，以保证胶面的平整。

脱盐柱和分子筛不一定要一样，胖点就可以了，高度和直径的比例尽量超过2以上。

我们现在用的GE的小预装柱直径大约1.6cm高约3cm，每次上样大约0.5-1mL的样子。

我以前自己装的柱子约是5cm(d)X20cm(h)的，大约能上30mL样品，
过的时候同时监测UV和电导，普通缓冲液电导一般不到十吧，你脱盐柱分离后应该在UV 出完后再出电导的峰。

出电导我一般到5左右的就不收了。

经常在实验中遇到UV能出好几个峰（主要是硫酸铵沉淀脱盐中遇到的），前面先出一个，后面在盐离子峰时UV也有，曾经尝试收集过，发现至少不是蛋白。

从GE买的G25应该是干粉，需要充分的溶胀起来才可以用。

一般G25的柱子可以装成短粗的，适于除盐。

我们做的是重组蛋白，用的是PB缓冲溶液。

wlt728 (站内联系TA)
用G25除盐的话，样品体积不能超过柱体积的20%，多了就达不到除盐的效果了！
xhjggl (站内联系TA)
买现成的也行 BSP090
路人甲007 (站内联系TA)
这是除盐柱吗貌似是分子筛吧
冼亮淀粉酶 (站内联系TA)
Originally posted by 路人甲007 at 2011-06-16 1521:
这是除盐柱吗貌似是分子筛吧
用的是分子筛的原理
paulajjh (站内联系TA)
Originally posted by xhjggl at 2011-06-16 1542:
买现成的也行 BSP090
实验室已经有G25了
paulajjh (站内联系TA)
Originally posted by wlt728 at 2011-06-16 1249:
从GE买的G25应该是干粉，需要充分的溶胀起来才可以用。

一般G25的柱子可以装成短粗的，适于除盐。

我们做的是重组蛋白，用的是PB缓冲溶液。

我也做重组蛋白，因为用透析总是出现蛋白聚沉现象，故考虑是否可以柱除盐，但是过Ni 柱需要加入一定量的NaCL，如果我直接用镍柱的bingding buffer去洗，是不是里面的NaCll 还是出不来，我还得在收集的蛋白里面加入一定量的NaCl啊
lizhijiang (站内联系TA)
如果不想损失样品，透析最好了，简单。

一毫升的枪 (站内联系TA)
Originally posted by paulajjh at 2011-06-16 1736:
我也做重组蛋白，因为用透析总是出现蛋白聚沉现象，故考虑是否可以柱除盐，但是过Ni 柱需要加入一定量的NaCL，如果我直接用镍柱的bingding buffer去洗，是不是里面的NaCll 还是出不来，我还得在收集的蛋白里面加 ...
所谓的脱盐就是交换buffer，如果你的洗脱buffer有多少的盐浓度，洗下来的蛋白就是在你洗脱液成分的buffer里了
请教各位高手,本人在实验过程中,遇到以下两个以下两个问题,实验条件,柱内径1.6CN,柱长80CM,胶为CM-sephadex-C25,冲洗液为碳酸氢氨(0.01M,Ph60.),上样(多肽)500mg.出现的问题:1,经常在上样后出现气泡,就是在装之前彻底抽气也不行.2第一个峰出来以后,发
现流速很慢,加压后效果也不明显.请各位高手不惜指教.致谢.
是手装柱吗？若是，有无装柱器？若有，在装柱时，可以先向柱子中加装柱液到3/4处，然后再按正常程序装柱，这样可以排除装柱带来的因素。

用碳酸氢氨(0.01M,Ph6.0)作洗脱液，是否是洗脱液产气？样品的PH是多少？
谢你的指教,我倒是没有考虑这个平衡时间的问题,说来也巧,昨天的柱子无意中平衡的时间长了一些,信天就做出了结果.但我也换了新胶.是不是有这种问题,如果胶用的时间过长,也容易出现气泡.
第二个问题可能是你平衡的时间不够，建议平衡一天以上。

我用过G25，G100，G200，牌号越小流速越慢。

胶用的时间长了，应该不会产生气泡。

我是用水作流动相，没出现过你说的情况。

我想应该是你的流动相有问题，是不是碳酸氢铵分解产生的气泡？
G25脱盐
你可以购买法玛西亚的或者pierce公司的预装柱，但是比较贵；自己装柱，可以采用15ml 的注射器或者差不多大小的玻璃柱，G25凝胶填充10ml左右就可以了。

脱盐装柱可以不要太严格，注意不要有断层就可以。

收集最好有紫外检测，实在没有也可以只收集3-10毫升的溶液（最大可能是在3-8毫升处），后面的是小分子盐类了，可以不用收集；另外，你的样品4毫升左右有点多了，可以分成两次上样。

葡聚糖凝胶G25 G100保存方法
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作者: haining9377 (站内联系TA) 收录: 2010-11-19 发布: 2010-11-12
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我是新手请教葡聚糖凝胶G25 G100 使用后如何保存
我之前用G25 分离了中药然后用0。

5M的NaoH洗了现在保存在纯净水里大约一个月后用避光室温可以吗
我的凝胶现在出现了点问题有一部分在最上层有一部分在最下层上层的沉降不下来了两层中间是水我记得刚买来的时候是都沉淀在下层的这是怎么回事坏了吗
sophie.shan (站内联系TA)
短期就使用的话怕是应该保存在甲醇里吧，好像没听过保存在纯水的
ldq0501 (站内联系TA)
我的是保存在CHCl3：CH3OH中，很好的，要用是随时换上呵
haining9377 (站内联系TA)
那我现在凝胶出现一部分沉不下去是为什么呢是不是坏了
我洗脱用的是0.5M的NAOH 再用纯净水洗到中性这样做有什么问题吗
haining9377 (站内联系TA)
Originally posted by ldq0501 at 2010-11-12 1213:
我的是保存在CHCl3：CH3OH中，很好的，要用是随时换上呵
我现在的凝胶出现了两层是我操作中出现什么问题了吗
还有你们不用的时候洗脱残留在柱上的杂质是用什么洗脱的呢
copydog (站内联系TA)
葡聚糖凝胶G25 G100 就是用水洗的吧，听说长时间放置时要加一点叠氮钠抑菌什么的。

ldq0501 (站内联系TA)
Originally posted by haining9377 at 2010-11-12 1818:
我现在的凝胶出现了两层是我操作中出现什么问题了吗
还有你们不用的时候洗脱残留在柱上的杂质是用什么洗脱的呢
要是1：1应该不会出现分层的，除非你的氯仿含量更高，才会有溶剂向下层流，分层，一般不会有什么杂质吧，用1：1冲洗几次，完了可以继续用
也不用除杂质的吧
haining9377 (站内联系TA)
Originally posted by haining9377 at 2010-11-12 0901:
我是新手请教葡聚糖凝胶G25 G100 使用后如何保存
我之前用G25 分离了中药然后用0。

5M的NaoH洗了现在保存在纯净水里大约一个月后用避光室温可以吗
我的凝胶现在出现了点问题有一部分在最 ...
保存在甲醇里那你们甲醇的浓度是多少呢？分析纯的就可以了吗
还有每次用完怎么洗残留的蛋白质呢？长期不用一定要放叠氮化钠吗好毒啊~
haining9377 (站内联系TA)
Originally posted by copydog at 2010-11-12 2323:
葡聚糖凝胶G25 G100 就是用水洗的吧，听说长时间放置时要加一点叠氮钠抑菌什么的。

恩我查到了可是叠氮化钠好毒不想加那个东西~ 其他的你知道还可以加什么吗
haining9377 (站内联系TA)
Originally posted by ldq0501 at 2010-11-14 1328:
要是1：1应该不会出现分层的，除非你的氯仿含量更高，才会有溶剂向下层流，分层，一般不会有什么杂质吧，用1：1冲洗几次，完了可以继续用
也不用除杂质的吧
你是说用1比1的氯仿：甲醇冲几个柱体积就可以了吗
这样最长多久不用会没关系啊
haining9377 (站内联系TA)
Originally posted by ldq0501 at 2010-11-14 1328:
要是1：1应该不会出现分层的，除非你的氯仿含量更高，才会有溶剂向下层流，分层，一般不会有什么杂质吧，用1：1冲洗几次，完了可以继续用
也不用除杂质的吧
因为我的药里有蛋白质如果不用东西洗的话蛋白质下不来会长菌你们都不洗的吗
haining9377 (站内联系TA)
Originally posted by sophie.shan at 2010-11-12 0934:
短期就使用的话怕是应该保存在甲醇里吧，好像没听过保存在纯水的
保存在甲醇里那你们甲醇的浓度是多少呢？分析纯的就可以了吗
还有每次用完怎么洗残留的蛋白质呢？长期不用一定要放叠氮化钠吗好毒啊~
qwz (站内联系TA)
五楼说的对的，你的树脂要洗干净啊，用法估计会用问题呢，装柱洗脱都好重要，关键的是你用这个凝胶树脂，要现看看资料啊，还要看看厂家的使用说明。

叠氮钠好毒，好像甲醇也挺毒的啊，搞化学不能怕毒啊，要不就要选择离开了，:D
补充一下，用这些树脂重要的一方面是防尘防氧，溶剂流动相水都要过滤才好。

水最好用冷的蒸馏水，并且用前要过滤0.22
Last edited by qwz on 2010-11-15 at 08:03 ]
haining9377 (站内联系TA)
Originally posted by qwz at 2010-11-15 0821:
五楼说的对的，你的树脂要洗干净啊，用法估计会用问题呢，装柱洗脱都好重要，关键的是你用这个凝胶树脂，要现看看资料啊，还要看看厂家的使用说明。

叠氮钠好毒，好像甲醇也挺毒的啊，搞化学不能怕毒啊，要不就要选 ...
买的这个凝胶没有说明书~
然后我查了资料说是用0.5M的氢氧化钠洗然后再洗到中性一个星期左右不用可以放在纯净水中一个月不用放在75%的乙醇里但我不知道这对不对想问问大家都是怎么做的
就是怎么洗脱杂质使凝胶再生以及怎么保存知道的大侠不吝赐教啊先谢谢啦
~~~~~
copydog (站内联系TA)
葡聚糖凝胶G25 G100 不能用有机相冲吧。

好像lh-20才能用有机相冲。

haining9377 (站内联系TA)
Originally posted by copydog at 2010-11-15 2133:
葡聚糖凝胶G25 G100 不能用有机相冲吧。

好像lh-20才能用有机相冲。

那怎么保存呢？
如果不放叠氮化钠的话
ylchen0902 (站内联系TA)
短期的话20%乙醇保存，长期的话最好是0.02%的叠氮钠保存:D
chenning1981 (站内联系TA)
一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。

湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。

抑菌剂用0.02%的叠氮钠！
ylchen0902 (站内联系TA)
短期20%的乙醇保存，长期的话0.03%的叠氮钠保存
（一）用硫酸铵分离血清白蛋白和球蛋白
一、目的要求
了解盐析法分离蛋白质的原理及操作方法
二、实验原理
在一定浓度的中性盐作用下，蛋白质颗粒失去电荷和水膜，则沉淀析出。

这时所获得的蛋白质沉淀，能保留蛋白质原来的性质。

这种蛋白质在不同浓度的盐溶液中，其溶解度不同，例如球蛋白不溶于半饱和的硫酸铵溶液，在半饱和硫酸铵溶液中沉淀析出；而白蛋白则溶于半饱和的硫酸铵溶液，但不溶于饱和硫酸铵，在饱和的硫酸铵溶液中才沉淀析出，因此可以利用不同浓度的硫酸铵将血清或其他混合蛋白液中的白蛋白与球蛋白分离。

三、仪器和试剂
1、仪器：试管和试管架、漏斗、定量滤纸。

2、试剂：血清、饱和硫酸铵溶液
四、实验步骤
取1：2稀释血清2ml，加饱和硫酸铵溶液2ml，混匀，静置10分钟后过滤。

取沉淀备用。

（二）葡聚糖G25凝胶过滤去盐
一、目的要求
了解用葡聚糖G25凝胶过滤去盐的基本原理和操作方法
二、实验原理
葡聚糖G25凝胶是一种“分子筛”的分离法，当欲分离的物质通过葡聚糖G25凝胶时，分子量大的物质（如蛋白质）沿凝胶颗粒间隙随溶剂流动，流程短，移动速度快先流出色谱床，而分子量小的物质（如盐）可渗入凝胶颗粒微孔中，流程长，移动速度慢，比分子量大的物质迟流出色谱床，以达到分离目的。

分别收集之，先收集的蛋白质用磺基水杨酸检测，产生白色沉淀，并进一步经浓缩进行醋酸纤维素薄膜电泳分离鉴定；后收集的盐（硫酸铵）可与纳氏试剂中的碘化汞钾作用生成棕黄色的碘化双汞铵。

三、仪器和试剂
1、仪器：2.5?20cm色谱柱，电泳仪，电泳槽，吸管，玻璃棒，试管和烧杯。

2、试剂：
（1）葡聚糖G25 （2）醋酸纤维素薄膜（3）浓缩剂
（4）0.9%NaCl溶液（5）pH8.6，0.075mol/L巴比妥缓冲液
（6）20%磺基水杨酸溶液（7）纳氏试剂贮存液：在500ml三角烧杯中加入碘化钾75克，碘55克，蒸馏水100ml，汞75克，将瓶浸在冷水中用力振荡，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化钾汞溶液为止，将溶液全部倾入1000ml容量的量筒中（多余的汞弃去），再用蒸馏水稀释至1000ml该度处，贮备待用。

（8）纳氏试剂应用液：取纳氏试剂贮存液150ml及蒸馏水150ml放入1000ml三角烧瓶中，再加入10%NaOH溶液700ml，摇匀后静置一天，取上层清液应用。

（9）血清的半饱和硫酸铵沉淀物。

四、实验步骤
1、凝胶的处理：商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需在水中溶胀，溶胀必须彻底，否则会影响色谱的均一性。

故在实验前先称取5克葡聚糖G25于烧杯中加入5~10倍水沸水浴1~2小时，让其充分溶胀或自然溶胀24小时以上，经这样处理的凝胶才能准备装柱。

2、装柱：用0.9%NaCl溶液将凝胶调成稀薄的浆状液，盛于烧杯中，然后在轻微地搅拌下使凝胶缓慢地沉降于2.5?20cm的柱内，松开流出口夹子，让其自然沉降，凝胶加至沉体积约占柱长的2/3为止，盖上一小圆形滤纸，以防加样时冲散凝胶表面，夹住流出口的橡皮管。

3、加样、洗脱：取实验（一）经过滤的沉淀物（样品）加大约1ml0.9%NaCl溶解，待柱床顶部的0.9%NaCl溶液（洗脱液）尚残留少许时，将溶解的样品缓慢加入，松开流出口夹子，当样品全部进入柱后，可先加入少量洗脱液冲洗粘附在柱壁上的样品，然后再加洗脱液洗脱，用20%磺基水杨酸检测流出液中有无蛋白质，以及时收集含蛋白质的洗出液。

4、盐（NH4+）的检查：取少量收集的流出液，用纳氏试剂检测有无NH4+，并及时收集之。

5、电泳鉴定蛋白质成分：将收集的蛋白液2~3滴加浓缩剂一粒，当浓缩至蛋白液将干时，用微量CAM电泳法检测蛋白质的成分。

实验原理
血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16％，100ml血清中约含1.2g左右。

首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。

半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。

用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。

常用的方法有透析法、凝胶层析法等。

本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。

当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。

α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI为7.2左右。

因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。

经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α－球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ－球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。

因此随洗脱液流出的只有γ－球蛋白，从而使γ－球蛋白粗制品被纯化。

其反应式如下：
用上述方法分离得到γ－球蛋白是否纯净，单一？可将纯化前后的γ－球蛋白进行电泳比较而鉴定之。

试剂和器材
1．试剂
（1）饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯)850g，置于1000ml蒸馏水中，在70一80℃水温中搅拌溶解。

将酸度调节至pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。

（2）葡聚糖凝胶G一25的处理：按每100ml凝胶床体积需要葡聚糖凝胶G一25干胶 25g。

称取所需量置于锥形瓶中。

每克干胶加入蒸馏水约30ml，用玻璃棒轻轻混匀，置于90～100℃水温中时时搅动，使气泡逸出。

1h后取出，稍静置，倾去上清液细粒。

也可于室温中浸泡24h，搅拌后稍静置，倾去上清液细粒，用蒸馏水洗涤2～3次，然后加0.017mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，备用。

（3）DEAE一32(二乙基氨基乙基一32)纤维素的处理：按100ml柱床体积需DEAE纤维素14g 称取，每克加0.5mol／L盐酸溶液15ml，搅拌。

放置30min(盐酸处理时间不可太长，否则DEAE纤维素变质)。

加约l0倍量的蒸馏水搅拌，放置片刻，待纤维素下沉后，倾弃含细微悬浮物的上层液。

如此反复数次。

静置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH>4为止。

加等体积lmol/L氢氧化钠溶液，使最终浓度约为0.5mol/L氢氧化钠，搅拌后放置30min，以虹吸除去上层液体。

同上用蒸馏水反复洗至pH<7为止。

虹吸去除上层液体，然后加入0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，备用。

（4）0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)
A液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H20)2.730g溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至1000ml。

B液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H20)6.269g，溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至 1000mL。

取A液77.5ml，加于B液22.5ml，混匀后即成。

（5）20%磺基水杨酸溶液
（6）奈氏(Nessler)试剂应用液
贮存液；称取碘化钾(KI)7.58g于250ml三角烧瓶中，用蒸馏水5ml溶解，再加入碘（I2）5.5g溶解，加7～7.5gHg用力振摇10min(此时产生高热，须冷却)，直至棕红色的碘转变成
带绿色的碘化汞钾液为止，过滤上清液倾入100ml容量瓶，洗涤沉淀，洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至100ml。

应用液：取贮存液75ml加10％NaOH 350ml，加水至500mL。

（7）0.9％氯化钠溶液
（8）乙酸纤维素薄膜电泳有关试剂(见实验29)
2．器材
（1）人血清。

（2）层析柱。

（3）长滴管。

（4）醋酸纤维素薄膜。

操作方法
1．盐析――中性盐沉淀
取正常人血清2.0ml于小试管中，加0.9％氯化钠溶液2.0ml，边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml，混匀后于室温中放置10min，3000r／min离心10min。

小心倾去含有清蛋白的上清液，重复洗涤一次，于沉淀中加入0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)0.5～1.Oml使之溶解。

此液即为粗提的γ－球蛋白溶液。

2．脱盐――凝胶柱层析
（1）装柱：洗净的层析柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约2.0ml洗脱液。

一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内，打开柱底部出口，调节流速0.3ml/min。

凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部，最后使凝胶床达20厘米高，床面上保持有洗脱液，操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。

在凝胶表面可盖一园形滤纸，以免加入液体时冲起胶粒。

（2）上样与洗脱：可以在凝胶表面上加圆形尼龙滤布或滤纸使表面平整，小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面，关紧下端出口，用长滴管吸取盐析球蛋白溶液，小心缓慢加到凝胶床表面。

打开下端出口，将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内。

关闭出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。

打开下端出口，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。

如此重复三次，以洗净内壁上的样品溶液。

然后可加入适量缓冲液开始洗脱。

加样开始应立即收集洗脱液。

洗脱时接通蠕动泵，流速为0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。

（3）洗脱液中NH4+与蛋白质的检查：取比色板两个(其中一个为黑色背底)，按洗脱液的顺序每管取一滴，分别滴入比色板中，前者加20％磺基水杨酸溶液2滴，出现白色混浊或沉淀即示有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度；于另一比色板中，加人奈氏试剂应用液l滴，以观察NH4+出现的情况。

合并球蛋白含量高的各管，混匀。

除留少量作电泳鉴定外，其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。

3．纯化――DEAE纤维素阴离子交换层析
用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度，并用0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱、分管收集。

用20％磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况。

(装柱、上样、洗脱，收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析)。

4．浓缩
经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的γ－球蛋白液往往浓度较低。

为便于鉴定，常需浓缩。

收集较浓的纯化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干胶，摇动2～3min， 3000r／min 离心5min。

上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液。

5．鉴定――乙酸纤维素薄膜电泳
取乙酸纤维素薄膜2条，分别将血清、脱盐后的球蛋白、DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的γ-球蛋白液等样品点上。

然后参阅实验二十九：乙酸纤维薄膜电泳法进行电泳分离、染色。

比较电泳结果。

注意事项
1．凝胶及DEAE纤维处理期间，必须小心用倾泻法除去细小颗粒。

这样可使凝胶及纤维素颗粒大小均匀，流速稳定，分离效果好。

2．装柱是层析操作中最重要的一步。

为使柱床装得均匀，务必做到凝胶悬液或DEAE纤维素混悬液不稀不厚，一般浓度为l：l，进样及洗脱时切勿使床面暴露在空气中，不然柱床会出现气泡或分层现象；加样时必须均匀，切勿搅动床面，否则均会影响分离效果。

3．本法是利用γ-球蛋白的等电点与α-、β-球蛋白不同，用离子交换层析法进行分离的。

因此层析过程中用的缓冲液pH要求精确。

4．电泳注意事项见实验二十九。

5．凝胶贮存：凝胶使用后如短期不用，为防止凝胶发霉可加防腐剂如0.02％叠氮钠。

保存于4℃冰箱内。

若长期不用，应脱水干燥保存。

脱水方法：将膨胀凝胶用水洗净。

用多孔漏斗抽干后，逐次更换由稀到浓的乙醇溶液浸泡若干时间，最后一次用95％乙醇溶液浸泡脱水，然后用多孔漏斗抽干后，于60～80℃烘干贮存。

6．离子交换剂的再生和保存；离子交换剂的价格较贵，每次用后只需再生处理便能反复使用多次。

处理方法是：交替用酸、碱处理，最后用水洗至接近中性。

阳离子交换剂最后为Na型，阴离子以Cl型是最稳定型，故阴离子交换剂处理顺序为碱一水一酸一水。

由于上述交换剂都是糖链结构。

容易水解破坏，因此须避免强酸、强碱长时间浸泡和高温处理，一般纤维素浸泡时间为3-4h。

离子交换剂容易长霉引起变质，不用时，需洗涤干净，加防腐剂置冰箱内保存。

常用0.02％叠氮钠防腐。

叠氮钠遇酸放出有毒气体，也是剧毒与易爆的危险品。

使用时要加倍小心。

除用凝胶层析法去除无机盐类外，最常用的去盐法就是透析。

细的透析袋效率高，所需时间短。

将透析袋一端折叠，用橡皮筋结扎，试验是否逸漏，然后倒入待透析的蛋白质溶液。

勿装太满，将袋的上端也结扎好，即可进行透析。

开始可用流动的自来水，待大部分盐被透析出后，再改为生理盐水、缓冲液或蒸馏水。

透析最好在较低的温度下，并在磁力搅拌器上进行。

此法简单，易操作，仪器及试剂要求不高，但不如凝胶层析法效率高。

浓缩γ-球蛋白粗提液除上述方法外还可用透析袋浓缩。

将待浓缩的蛋白质溶液放入较细的透析袋中，置入搪瓷盘内。

透析袋周围可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。

以上物质在使用后(吸了大量水)都可以通过加温及吹风而回收；将装有蛋白质溶液的透析袋悬挂起来，用电风扇高速吹风(10℃以下)，也可达到浓缩目的，以上两法虽不如 SephadexG一25干胶快，但价格较便宜，方法也不烦琐。

①浊点萃取法(CPE)：浊点萃取法(cloud point extraction，CPE)是近年来出现的一种新兴的液—液萃取技术，它不使用挥发性有机溶剂，不影响环境。

它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，改变实验参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分离。

目前该法已成功地应用于金属螯合物、生物大分子的分离与纯化及环境样品的前处理中。

CPE 法除了利用增溶作用外，还利用了表面活性剂另一个重要性质——浊点现象。

溶液静置一段时间(或离心)后会形成两个透明的液相：一为表面活性剂相(约占总体积的5％)；另一为水相(胶束浓度等于CMC)。

外界条件(如温度)向相反方向变化，两相便消失，再次成为均一溶液。

溶解在溶液中的疏水性物质如膜蛋白，与表面活性剂的疏水基团结合，被萃取进表面活性剂相，亲水性物质留在水相，这种利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水性物质分离的萃取方法就是浊点萃取。

图1显示了由温度变化引发的这种相分离现象。

温度的改变，引起水化层的破坏，增强了表面活性剂的疏水性。

②置换色谱法：置换色谱(displacement chromatography)作为一种非线性色谱技术，是指样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂(displacer)通人色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子。

样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进，使样品中各组分按作用力强弱的次序，形成一系列前后相邻的谱带，并在置换剂的推动下流出色谱柱。

置换色谱的分离行为与样品组分和置换剂在实验条件下的吸附等湿线有直接的联系。

置换色谱要求样。