鼠肺炎沙眼衣原体毒力因子Pgp3蛋白的分段克隆表达

ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１－４６９５．２０２１．０８．００１ 文章编号：１６７１－４６９５（２０２１）０８－０７８５－０４
鼠肺炎沙眼衣原体毒力因子Ｐｇｐ３蛋白的分段克隆表达
徐宏俊１　孙毅娜２　刘全忠３　刘原君３
（１首都医科大学附属北京友谊医院皮肤性病科　北京　１０００５０；２天津医科大学朱宪彝纪念医院天津市内分泌研究所　天津　３
００１３４；３天津医科大学总医院皮肤性病科　天津　３０００５２） 【摘要】　目的　获得鼠肺炎沙眼衣原体（ＣＭ）质粒编码蛋白Ｐｇｐ３氨基端（ｎ）、羧基端（ｃ）和中间段（ｍ）分别删除的
蛋白Ｐｇｐ３Δｎ、Ｐｇｐ３Δｍ和Ｐｇｐ３Δｃ，为近一步研究其功能及沙眼衣原体（Ｃ．ｔ）致病机制提供基础。

方法　用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增目的基因Ｐｇｐ３Δｎ、Ｐｇｐ３Δｍ和Ｐｇｐ３Δｃ，分别将其定向插入原核表达载体ＰＥＴ－３０ａ（＋）中，连接产物转化入大肠埃希菌ＤＨ５α、涂板、挑取单克隆提取质粒进行酶切、测序鉴定。

鉴定正确的重组质粒分别转化入大肠埃希菌ＢＬ２１，１５℃诱导表达１６ｈ和３７℃诱导表达４ｈ，考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹法鉴定目的蛋白。

结果　ＰＣＲ扩增的目
的基因Ｐｇｐ３Δｎ、Ｐｇｐ３Δｍ和Ｐｇｐ３Δｃ的长度分别为５９７、５２５、３２４ｂｐ，ＮｄｅＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切重组质粒后电泳显示酶切片段
大小符合预期，测序结果显示插入片段序列均与基因库中一致；考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹显示目的蛋白分子量分别约为２２０００、１８７００和１２０００，３个蛋白片段均在１５℃诱导表达１６ｈ的条件下表达量更多。

结论　成功表达Ｐｇｐ３Δｎ－Ｈｉｓ、Ｐｇｐ３Δｍ－Ｈｉｓ和Ｐｇｐ３Δ
ｃ－Ｈｉｓ融合蛋白，为进一步研究Ｐｇｐ３的功能位点和作用机制奠定基础。

【关键词】　鼠肺炎沙眼衣原体　Ｐｇｐ３　基因表达　结构域
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆＰｇｐ３ｏｆＣｈｌａｍｙｄｉａｍｕｒｉｄａｒｕｍ．ＸＵＨｏｎｇ－ｊｕｎ１，ＳＵＮＹｉ－ｎａ２，ＬＩＵＱｕａｎ－ｚｈｏｎｇ３
，
ｅｔａｌ．１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｅｒｍａｔｏｖｅｎｅｒｅｏｌｏｇｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＦｒｉｅｎｄｓｈｉｐＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００５０，Ｃｈｉｎａ；２ＣｈｕＨｓｉｅｎ－ＩＭｅ ｍｏｒｉａｌＨｏｓｐｉｔａｌ＆ＴｉａｎｊｉｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００１３４，Ｃｈｉｎａ；３ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｅｒｍａｔｏｖｅｎｅｒｅｏｌｏｇｙ，ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００５２，Ｃｈｉｎａ．
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｇｅｔｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆｐｌａｓｍｉｄ－ｅｎｃｏｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎＰｇｐ３ｏｆＣｈｌａｍｙｄｉａｍｕｒｉｄａｒｕｍ：Ｐｇｐ３Δｎ（ｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰｇｐ３Ｎ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ），Ｐｇｐ３Δｍ（ｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｍｉｄｄｌｅｄｏｍａｉｎｏｆＰｇｐ３）ａｎｄＰｇｐ３Δｃ（ｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰｇｐ３Ｃ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｐｏｌｙｍｅｒ ａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｗａｓｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｔｈｅｇｅｎｅｓｏｆＰｇｐ３Δｎ，Ｐｇｐ３ΔｍａｎｄＰｇｐ３Δｃ，ｔｈｅｎｔｈｅｓｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｇｅｎｅｓｗｅｒｅｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｒｏ ｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆＰＥＴ３０ａ（＋），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＤＨ５αｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓ，ｃｏａｔｅｄｐｌａｔｅｓａｎｄｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉ ｆｉｅｄｂｙｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ａｆｔｅｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｔｈｅｃｏｒｒｅｃｔｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｌｙｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１ａｎｄｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｆｏｒ１６ｈａｔ１５℃ｏｒ４ｈａｔ３７℃．ＴｈｅｅｘｐｅｃｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕｅｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆａｍｐｌｉｆｉｅｄｇｅｎｅｓｏｆＰｇｐ３Δｎ，Ｐｇｐ３ΔｍａｎｄＰｇｐ３Δｃｗｅｒｅ５９７ｂｐ，５２５ｂｐａｎｄ３２４ｂｐ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｓｅ ｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｉｎｓｅｒｔｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｒｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｇｐ３ｉｎＧｅｎｅｂａｎｋ；ＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｇｈｔｂｌｕｅｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅａｂｏｕｔ２２０００，１８７００ａｎｄ１２０００，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｂｅｔｔｅｒｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗａｓａｔ１５℃ｆｏｒ１６ｈ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＴｈｅｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓＰｇｐ３Δｎ－Ｈｉｓ、Ｐｇｐ３Δｍ－ＨｉｓａｎｄＰｇｐ３Δｃ－Ｈｉｓｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｅｘ ｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄ，ｗｈｉｃｈｌａｙｓｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】　Ｃｈｌａｍｙｄｉａｍｕｒｉｄａｒｕｍ；Ｐｇｐ３；Ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｄｏｍａｉｎ
基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号：３１５７０１７８）；天津市自
然科学基金资助项目（编号：１６ＪＣＱＮＪＣ１１１００）
通讯作者：刘原君，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｙｕａｎｊｕｎ１９８０＠１２６．ｃｏｍ 生殖道沙眼衣原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，Ｃ．ｔ）感
染是近年来国内外最常见的性传播疾病，美国疾病预防控制中心的统计结果显示２０１８年生殖道Ｃ．ｔ感染人数约１７６万，感染率约５３８／１０万［１］，我国珠江三角洲、长江三角洲等监测工作做得好的地区Ｃ．ｔ感染率达到６１６／１０万［２］。

由于大约２／３的Ｃ．ｔ感染者没有症状，意识不到自己已经感染，未积极治疗，Ｃ．ｔ可持续存在并引
起一系列严重的并发症，例如：男性附睾炎、前列腺炎、
直肠炎，在女性则更为严重，如子宫内膜炎、输卵管炎、
不孕症、异位妊娠、流产、盆腔炎性疾病和垂直传播
等［３－５］。

生殖道Ｃ．ｔ感染导致输卵管阻塞从而不孕已
成为影响我国优生优育的公共健康问题。

课题组前期
研究发现缺失Ｐｇｐ３的鼠肺炎沙眼衣原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ
ｍ
ｕｒｉｄａｒｕｍ，ＣＭ）不能导致小鼠输卵管积水［６］
，Ｐｇｐ３分子３个结构域（
Ｐｇｐ３ｎ、Ｐｇｐ３ｍ、Ｐｇｐ３ｃ）分别去除后ＣＭ导致输卵管积水的发生率明显降低或不致病［７］。

Ｈ
ｏｕ等［８］研究发现Ｐ
ｇｐ３蛋白能够与抗菌肽ＬＬ－３７结合并抑制抗菌肽对Ｃ
．ｔ的杀伤作用，进一步实验证实Ｐｇｐ３的中间段Ｐｇｐ３ｍ是负责结合ＬＬ－３７的区域。

本研究通过
表达鼠肺炎沙眼衣原体Ｐｇｐ３蛋白的氨基端、羧基端和
中间段分别删除的蛋白片段，为进一步制备相应的抗体
和体外研究Ｐｇｐ３的功能位点奠定基础。

１　材料与方法１．１　试剂、菌株及动物　核酸内切酶ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄⅢ、
ＭｌｕＩ购自日本Ｔａｋａｒａ公司；质粒提取试剂盒、硝酸纤维素膜购自北京鼎国生物技术有限责任公司；抗Ｈｉｓ单克隆抗体购自金斯瑞生物科技股份有限公司；Ｔ４ＤＮＡ连
接酶购自北京天根生化科技有限公司；辣根过氧化物酶·
５８７·临床和实验医学杂志　２０２１年４月　第２０卷　第８期
标记的羊抗小鼠ＩｇＧ抗体购自北京中杉金桥生物技术
有限公司；蛋白标志购自美国Ｆ
ｅｒｍｅｎｔａｎｓ公司；增强型化学发光（ｅｎｈａｎｃｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，ＥＣＬ）蛋白印迹
发光液购自美国Ｐ
ｒｏｍｅｇａ公司；载体质粒ＰＥＴ－３０ａ（＋）和各种鼠肺炎沙眼衣原体的菌株来自天津医科大学总医院皮肤性病科实验室。

１．２　引物设计及Ｐｇｐ３不同片段基因的扩增　根据基
因库中提供的鼠肺炎沙眼衣原体标准株Ｐｇｐ３的基因序列，参考Ｐｇｐ３晶体空间结构的文献结果［９］
，如图１所示，设计针对Ｐｇｐ３不同基因片段的引物，在上游引物５＇端加上限制性内切酶ＮｄｅＩ的识别位点及保护性碱基，在下游引物的５＇端加上限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ的识别位
点及保护性碱基，具体引物序列见表１。

取鼠肺炎沙眼衣原体标准株、
Ｐｇｐ３的氨基端、中间段和羧基端分别删除的ＣＭ突变株细胞培养物１００μＬ，１２２３５×ｇ离心２０ｍｉｎ后弃上清，沉淀中加入０．１％的十二烷基硫酸钠（
ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ，ＳＤＳ），１００℃煮沸１０ｍｉｎ，－２０℃保存备用。

用上述Ｃ
Ｍ基因组ＤＮＡ为模板，分别利用上述引物进行聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃ
ｔｉｏｎ，ＰＣＲ）扩增。

扩增条件为９４℃预变性３ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，６８℃退火和延伸３ｍｉｎ，３５个循环后，７２℃延伸８ｍｉｎ，使反应完全。

同时设立阴性对照，以灭菌的蒸馏水替代模板基因组ＤＮＡ建立扩增体系。

扩增产物用１％
的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

图１　Ｐｇｐ３蛋白空间结构域及其相应的ＤＮＡ序列示意图
表１　扩增所需引物序列
扩增片段引物１引物２
Ｐｇｐ３全长ａｔｇａｃａｇａａｃｃｔｃｔｔａｃａｇａｔｃｔｔａａｇｔｇｔｔｔｔｔｔｔｇａｇｇｔａｔｃａｃＰｇｐ３ΔｎＣＧＧＴＣＡＴＡＴＧａｔｇｇｔａａａｔａｔｔｇｇａｔｔａｇａｔｇｃＧＣＧＴＡＡＧＣＴＴａｇｔｇｔｔｔｔｔｔｔｇａｇｇｔａｔｃａｃＰｇｐ３Δ
ｍＣＧＧＴＣＡＴＡＴＧａｔｇａｃａｇａａｃｃｔｃｔｔａｃａｇＧＣＧＴＡＡＧＣＴＴａｇｔｇｔｔｔｔｔｔｔｇａｇｇｔａｔｃａｃＰｇｐ３Δ
ｃＣＧＧＴＣＡＴＡＴＧａｔｇａｃａｇａａｃｃｔｃｔｔａｃａｇＧＣＧＴＡＡＧＣＴＴｇｔｔａｃａｔｔｇａａｔｔｔｔｃｃｃａｇ１．３　目的基因的克隆和鉴定　按说明书和参考文
献［１０］将ＰＣＲ扩增产物Ｐｇｐ３Δｎ、Ｐｇｐ３Δｍ、Ｐｇｐ３Δｃ和质粒ＰＥＴ－３０ａ（＋）分别用ＮｄｅＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳后回收酶切产物，酶切产物用Ｔ４连接酶２３℃作用２ｈ，连接到ＰＥＴ－３０ａ（＋）载体。

将连接产物ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｎ、ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δ
ｍ和ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｃ分别转化入大肠埃希菌ＤＨ５α，转化后挑取单个菌落进行扩增以提取质粒进行ＭｌｕＩ和ＨｉｎｄⅢ内切酶双酶切、
测序鉴定，基因测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

１．４　重组蛋白的诱导表达和鉴定　选取构建成功的重组质粒ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｎ、ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｍ和ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｃ分别转化入感受态细胞大肠埃希菌Ｂ
Ｌ２１中，挑取单克隆菌落进行增量培养，当菌液的Ａ６００值达到０．６～０．８时，加异丙基－β－
Ｄ－硫代半乳糖苷（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ，ＩＰＴＧ），使其终浓度为０．５ｍｍｏｌ／Ｌ，１５℃诱导表达１６ｈ和３７℃诱导表达４ｈ，设置阴性对照管，不加ＩＰＴＧ。

４℃、６０００×ｇ离心５ｍｉｎ收集菌体沉淀，加入蛋白裂解缓冲液重悬后室温作用１
０ｍｉｎ，作为全细菌裂解产物。

进一步４℃、１２２３５×ｇ离心２０ｍｉｎ后分离上清和沉淀。

取上述全细胞裂解产物、上清和沉淀进行蛋白电泳，考马斯亮兰染色和蛋白质印迹鉴定融合蛋白的表达。

蛋白质印迹所用一抗为小鼠抗Ｈ
ｉｓ抗体，浓度为１ １０００；二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠ＩｇＧ，浓度为１ １００００，ＥＣＬ蛋白质印迹发光液显色。

２　结果
２．１　基因扩增　以双蒸水为模板作为阴性对照时，用针对Ｐｇｐ３不同基因片段的引物进行扩增没有目的条带，见图２中的２、４、８、９泳道；以不同鼠肺炎沙眼衣原体株的ＤＮＡ为模板时，扩增出相应的目的条带，Ｐｇｐ３全长约７２３ｂｐ（泳道１和３），Ｐｇｐ３Δｎ约５９７ｂｐ（泳道５），Ｐｇｐ３Δｍ约５２５ｂｐ（泳道６），Ｐｇｐ３Δ
ｃ约３２４ｂｐ（泳道７）。

图２　鼠肺炎沙眼衣原体Ｐｇｐ３全长和不同片段的ＰＣＲ扩增结果注：Ｍ为ＤＮＡ标准参照物，１和３为Ｐｇｐ３全长，５、６、７分别为Ｐｇｐ３Δｎ、Ｐｇｐ３Δｍ和Ｐｇｐ３Δ
ｃ，２、４、８、９分别为阴性对照２．２　重组质粒的构建与鉴定　重组质粒ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｎ、ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｍ和ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｃ分别经内切酶ＭｌｕＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，见图３Ａ，重组质粒ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｎ未酶切（泳道１）可见环状、双螺旋、线性等多条带，经过双酶切后质粒（泳道２）显示２条带，分别位于４０００ｂｐ至５０００ｂｐ和
１０００ｂｐ至２０００ｂｐ，与预期吻合；重组质粒ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｍ未酶切（泳道３）可见环状、双螺旋、线性等多条带，经过双酶切后质粒（泳道４）显示２条带，分
别位于４０００ｂｐ至５０００ｂｐ和１０００ｂｐ至２０００ｂｐ，见图３Ｂ，与预期吻合；重组质粒ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｃ未酶切（泳道５）可见环状、双螺旋、线性等多条带，经过
·
６８７·ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅＶｏｌ．２０，Ｎｏ．８　Ａｐｒ．２０２１
双酶切后质粒（泳道６）显示两条带，分别位于４０００ｂｐ至５０００ｂｐ和稍大于１０００ｂｐ，见图３Ｃ，与预期吻合；测序结果显示３个重组质粒中的插入片段序列与基因库
中相应片段的序列完全一致。

图３　重组质粒的双酶切电泳鉴定结果
注：１、３、５分别为未酶切的重组质粒ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｎ、ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｍ和ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｃ；２、４、６分别为双酶切后的重组质粒ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｎ、ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｍ和ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δ
ｃ；Ｍ为ＤＮＡ标准参照物２．３　重组蛋白Ｐｇｐ３Δｎ、Ｐｇｐ３Δｍ和Ｐｇｐ３Δ
ｃ的表达和鉴定　经双酶切和测序鉴定正确的重组质粒ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｎ、ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｍ和ＰＥＴ－３０ａ（＋）／Ｐｇｐ３Δｃ分别转化至ＢＬ２１感受态，挑取单克隆分别扩增培养并诱导表达，菌体裂解后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和考马斯亮蓝染色，在菌体裂解液、上清和沉淀中均可
见相对分子质量约为２２０００的Ｐｇｐ３Δ
ｎ的特异性条带，其中１５℃诱导表达１６ｈ较３７℃诱导表达４ｈ蛋白条带更明显，即蛋白表达更多，见图４Ａ；Ｐｇｐ３Δ
ｍ的相对分子质量为１８７００，目的条带只出现在１５℃诱导表达１６ｈ的菌体裂解液和沉淀中，相应的上清中看不到目的条带，而３７℃诱导表达４ｈ后菌体裂解液、上清和沉淀中均没有明显的目的条带，见图４Ｂ；Ｐｇｐ３Δ
ｃ的相对分子质量为１２０００，１５℃诱导表达１６ｈ和３７℃诱导表达４ｈ均可见目的条带，Ｐｇｐ３Δｃ蛋白在上清和沉淀中均有表达，见图４Ｃ。

图４　重组蛋白Ｐｇｐ３Δｎ、Ｐｇｐ３Δｍ和Ｐｇｐ３Δｃ的考马斯亮蓝染色鉴定注：Ｍ１为蛋白标准参照物，ＰＣ１、ＰＣ２为１μｇ、２μｇ牛血清白蛋白，ＮＣ、ＮＣ１、ＮＣ２分别为没有加ＩＰＴＧ诱导的菌体裂解液、上清、沉淀；１、３、５分别为１５℃诱导表达１６ｈ的菌体裂解液、上清和沉淀，２、４、６分别为３７℃诱导表达４ｈ的菌体裂解液、上清和沉淀蛋白印迹分析，重组蛋白Ｐｇｐ３Δｎ在２种诱导表达条件下，上清和沉淀中均有特异性的条带，相对分子质量为２２０００，见图５Ａ；Ｐｇｐ３Δｍ在菌体裂解液和沉淀中有特异性的条带，在上清中没有条带，与图４中考马斯亮兰染色结果一致，见图５Ｂ；Ｐｇｐ３Δｃ蛋白在菌体裂解液、上清和沉淀中均有表达，表达量沉淀中多于上清，见图５
Ｃ
图５　重组蛋白Ｐｇｐ３Δｎ、Ｐｇｐ３Δｍ和Ｐｇｐ３Δｃ的Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定注：ＮＣ为没有加ＩＰＴＧ诱导的菌体裂解液，１、３、５分别为１５℃诱导表达１６ｈ的菌体裂解液、上清和沉淀，２、４、６分别为３７℃诱导表达４ｈ的菌体裂解液、上清和沉淀，
Ｍ２为蛋白标准参照物３　讨论
不同类型衣原体的质粒结构高度保守，拥有８个开放阅读框，编码８种蛋白，命名为Ｐｇｐ１、Ｐｇｐ２、Ｐｇｐ３、Ｐｇｐ４、Ｐｇｐ５、Ｐｇｐ６、Ｐｇｐ７、Ｐｇｐ８。

其中，Ｐｇｐ３一直是研究最
多且作用最为重要的质粒编码蛋白［１１－１３］。

２００８年Ｌｉ等［１４］研究发现Ｐｇｐ３蛋白是８个质粒蛋白中唯一能够
分泌到衣原体包涵体外的分泌蛋白，衣原体在宿主细胞
内寄生，形成特殊的包涵体，分泌到包涵体外宿主细胞胞浆内的分泌蛋白可能在衣原体与宿主细胞的相互作用中发挥重要作用。

近年来新出现的衣原体转化技术
无疑是衣原体研究领域的重大突破［１５］
，极大地推进了
衣原体基因功能的研究。

课题组应用衣原体转化技术构建了Ｐｇｐ３缺失的鼠肺炎沙眼衣原体株，感染小鼠后发现不能导致小鼠输卵管病变，说明Ｐｇｐ３是衣原体质
粒编码最重要的毒力因子［
６］。

Ｇａｌａｌｅｌｄｅｅｎ等［９］的晶体结构研究显示Ｐｇｐ３可见氨
基端的球形结构域和羧基端的肿瘤坏死因子样结构域
由中间段的卷曲螺旋连接，形成三聚体结构。

课题组研
究发现删除Ｐｇｐ３的任何一个结构域，都会导致衣原体
输卵管积水的发生率明显降低甚至是不致病［７］，但是Ｐｇｐ３分子每一个结构域在致病过程中的具体作用和机制仍不清楚，因此构建表达Ｐｇｐ３分子３个结构域分别去除的蛋白片段有重要的意义。

本研究采用的目的基因载体ＰＥＴ－３０ａ（＋）带有Ｈｉｓ蛋白标签，是蛋白表达常用的载体之一。

设计扩增引物时除了考虑引物的一般设计原则外，还要考虑如下因素：首先，扩增的目的基因需要插入ＰＥＴ３０ａ（＋）质粒
载体中，根据质粒ＰＥＴ３０ａ（＋）的限制性酶切位点图谱和Ｐｇｐ３的基因序列，选择了ＮｄｅＩ和ＨｉｎｄⅢ２种限制性内切酶，将上述两种限制性内切酶的识别位点分别加在上下游引物的外侧；其次，是在酶切位点的外侧各加上４个保护性碱基以提高酶切效率，本研究按照上述原则设计了针对Ｐｇｐ３Δｎ、Ｐｇｐ３Δｍ和Ｐｇｐ３Δｃ的克隆引物，最终连接反应高效，成功得到重组质粒。

此外，在进行ＰＣＲ反应时，采用两步法即退火和延伸采用相同的温度６８℃，可以明显提升ＰＣＲ反应的效率。

本研究采用两
·
７８７·临床和实验医学杂志　２０２１年４月　第２０卷　第８期
步法ＰＣＲ成功获得Ｐｇｐ３Δｎ、Ｐｇｐ３Δｍ和Ｐｇｐ３Δｃ的ＰＣＲ片段，且ＰＣＲ产物的浓度较大，保证了后续克隆反应的顺利进行。

温度对于蛋白的诱导表达具有重要影响。

大肠埃希菌的最适合生长温度在３
７～３９℃之间，在此温度下表达外源蛋白极易生成包涵体。

研究发现较低温度的诱导，目的蛋白的合成速度较小，反而容易形成有活性的蛋白，有效地增加可溶蛋白的比例
［１６］。

本研究选择
１５℃诱导表达１６ｈ和３７℃诱导表达４ｈ两个诱导表达条件，结果发现，在较低温度１５℃条件下，３个蛋白片段Ｐｇｐ３Δｎ、Ｐｇｐ３Δｍ和Ｐｇｐ３Δｃ均有较高的表达量，Ｐｇｐ３Δｎ和Ｐｇｐ３Δｃ在１５℃条件下上清中的含量较多，而Ｐｇｐ３Δｍ在两个温度条件下都是形成包涵体，上清中没有蛋白。

关于Ｐｇｐ３Δｍ后续试验还可以尝试降低培养温度和摇床速度来探索是否可以出现可溶性表达。

４　结论
本研究成功克隆表达Ｐｇｐ３三个结构域分别去除的蛋白片段，为进一步鉴定Ｐｇｐ３蛋白的功能位点及研究Ｐｇｐ３各个结构域的生物学功能奠定基础，有望为沙眼衣原体治疗新药的开发提供一定的线索。

值得一提的是，本研究中Ｐｇｐ３Δｍ还是以包涵体的形式表达，后续试验还需要尝试能否使其可溶性表达。

参考文献
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（收稿日期：２０２０－１２－１６）
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１－４６９５．２０２１．０８．００２ 文章编号：１６７１－４６９５（２０２１）０８－０７８８－０５
１４，１５－ＥＥＴ通过线粒体途径减轻烟雾诱导的肺上皮细胞凋亡
于刚刚　吴艳军　李云霄　杨霭林　徐波 王浩彦
（首都医科大学附属北京友谊医院呼吸内科　北京　１０００５０）
基金项目：国家自然科学基金（编号：８１７０００３８，８１８７００２９）；北京市医院管理局“青苗”人才计划（编号：ＱＭＬ２０１８０１０７）；北京市自然科学基金（编号：７２０４２４７，７１６４２５０）；北京市青年骨干个人项目（编号：２０１８００００２１４６９Ｇ２０３）
通讯作者：徐波，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｕｂｏ＿ａｌｌｙ＠１２６．ｃｏｍ；王浩彦，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈａｏｙａｎｗ＠１２６．ｃｏｍ
【摘要】　目的　观察１４，１５－环氧二十碳三烯酸（１４，１５－ＥＥＴ）对香烟烟雾提取物（ＣＳＥ）刺激肺上皮细胞凋亡的影响，并观察１４，１５－ＥＥＴ对线粒体膜电位、线粒体形态变化的影响，初步探讨其可能的机制。

方法　培养支气管肺上皮细胞（Ｂｅａｓ－２Ｂ），实验分为对照组、ＣＳＥ刺激组（加入５％ＣＳＥ液）、ＣＳＥ＋１４，１５－ＥＥＴ组（１ｍｍｏｌ／Ｌ１４，１５－ＥＥＴ预处理１ｈ后再加入５％ＣＳＥ）及ＣＳＥ＋１４，１５－ＥＥＴ＋１４，１５－环氧二十碳－５（Ｚ）－烯酸（１４，１５－ＥＥＺＥ）组（１ｍｍｏｌ／Ｌ１４，１５
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８８７·ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅＶｏｌ．２０，Ｎｏ．８　Ａｐｒ．２０２１。