甘蓝型油菜-埃塞俄比亚芥种间杂交非整倍体后代的遗传

甘蓝型油菜-埃塞俄比亚芥种间杂交非整倍体后代的遗传祁玉洁;袁世峰;戚存扣
【摘要】非整倍体Nj04-089为甘蓝型油菜(Brassica napus L.)与埃塞俄比亚芥(B.carinata A.Br.)种间杂交后代中获得的附加系.为分析Nj04-089的遗传特性,利用显微镜对Nj04-089自交后代的根尖细胞染色体进行计数、对花粉母细胞染色体分裂行为进行观察,并采用PCR、GISH和Southern杂交等技术对Nj04-089的2个连续自交后代的附加染色体进行了遗传分析.结果显示:这两个连续自交世代根尖细胞染色体数2n =37 ～51条；花粉母细胞减数分裂的中期染色体构型分别为(0-4)Ⅰ+(16-23)Ⅱ+(0-2)Ⅲ和(0-8)Ⅰ+(14-24)Ⅱ+(0-4)Ⅲ+(0-1)Ⅳ,且观察到染色体桥、染色体落后、分裂周期不同步等异常行为.结果表明在该非整倍体后代中未检测到芸薹属B组染色体或大的片段,推测非整倍体附加的染色体并非整条或大片段B组染色体.
【期刊名称】《中国油料作物学报》
【年(卷),期】2013(035)002
【总页数】6页(P117-122)
【关键词】甘蓝型油菜;埃塞俄比亚芥;非整倍体;基因组原位杂交;Southern杂交【作者】祁玉洁;袁世峰;戚存扣
【作者单位】南京农业大学农学院,江苏南京,210095;南京农业大学农学院,江苏南京,210095;农业部长江下游棉花油菜重点实验室,江苏南京,210014
【正文语种】中文
【中图分类】S565.403
芸薹属(Brassica)是芸薹(Brassicaceae)中最重要的一个属。

芸薹属包括白菜型油
菜(B.rapa，AA，2n=20)、黑芥(B.nigra，BB，2n=16)和甘蓝(B.oleracea，CC，2n=18)三个基本种，以及芥菜型油菜(B.juncea，AABB，2n=36)、甘蓝型油菜(B.napus，AACC，2n=38)和埃塞俄比亚芥(B.carinata，BBCC，2n=34)三个异
源四倍体物种［1］。

甘蓝型油菜起源于欧洲，遗传基础单一。

通过细胞工程或染色体工程途径构建成套染色体组附加系可用来进行植物基因组分拆、基因的染色体定位［2］、基因的剂量效应研究［3］、额外染色体的遗传连锁群创建［4］、将遗传连锁群定向到相
应的染色体上［5］等理论和应用研究。

目前，通过染色体工程途径已获得芸薹属植物种间非整倍体材料，包括甘蓝型油菜－黑芥二体附加系［6］、甘蓝型油菜－萝卜二体附加系［7］、甘蓝型油菜－白芥二体附加系［8］、甘蓝型油菜－诸葛菜单体附加系［9］、获得甘蓝型油菜－埃芥二体附加系［10］和甘蓝型油菜－黑芥异代换系［11］等。

有关芸薹属植物种内非整倍体如甘蓝型油菜三体、双三体、双四体［12］、单体、双单体和缺体［11］等的研究报道也在不断增加。

埃塞俄
比亚芥具有耐干旱、抗裂角、黄种皮等诸多优良农艺性状［13］。

已通过甘蓝型
油菜/埃塞俄比亚芥种间杂交、回交将埃芥的黄种皮性状转移到甘蓝型油菜中［14］，并从该种间杂交组合后代获得一个多体附加系材料［10］。

本文报道该
多体附加系衍生后代植株的遗传组成及附加染色体的遗传规律。

1 材料与方法
1.1 材料
以［(宁油 10号(B.napus)×Dodolla(B.carinata))F1×宁油10号］连续自交4代
后的群体中出现的多体附加系植株 NJ04－089为起始材料［10］。

经连续自交选
育，以其F3、F4群体植株、盆栽白菜型油菜、黑芥、羽衣甘蓝、宁油10号和Dodolla作为供试材料。

1.2 体细胞染色体数观察
取种子置于培养皿中，25℃恒温培养箱中培养发根。

当幼根长到1.5cm左右时取根尖，置于0.002mol/L的8－羟基喹啉溶液中22℃处理3.5～4 h，蒸馏水冲洗
干净，移入卡诺氏液中固定24h。

压片前，用混合酶液包括0.8%(m/V)的纤维素
酶R－10(Japan)+0.4%(m/V)的果胶酶 Y－23(Japan)+0.8%(m/V)的蜗牛酶处理1.5～2h，然后用10%改良卡宝品红溶液染色，Olympus BX51显微镜下观察并
摄影。

1.3 花粉母细胞(PMC)减数分裂观察
取幼嫩花蕾放入卡诺氏固定液中固定24h。

镜检筛选处于减数分裂期的花蕾，挑
出花药置于固定液中4℃下保存。

压片前，用混合酶液处理3.5～4 h，然后用10%改良卡宝品红染色，在Olympus BX51显微镜下镜检观察并摄影。

1.4 原位杂交(GISH)分析
将处于减数分裂期的PMC置于混合酶液中37℃下酶解3.5～4h。

染色体制片参
照Zhong等人［15］的方法进行。

采用CTAB法大量提取全基因组DNA并纯化。

采用缺刻平移法标记黑芥基因组DNA作为探针。

甘蓝型油菜基因组DNA于沸水浴处理30min，使片段大小在200～500bp左右作为封阻;基因组原位杂交的程序参照 Snowdon［16］和 Li［17］等人的方法进行。

1.5 PCR与Southern杂交分析
采用PCR的方法检测F3群体植株中是否渗入B 基因组片段，引物序列是Schelfhout［18］和Márque z－Lema等人［19］发表的9对引物，引物序号为pBNBH35、Ni2－A02、Ni2 －A08、Ni2 －A11、Ni3 －H07、Ni4－A09、Ni4－C06、Ni4－D01和Ni4－G02。

对F4群体植株花粉母细胞采用染色体制片技
术进行染色体数目观察，选择其中6株非整倍体植株(染色体数目大于38)，采用CTAB法提取各单株全基因组DNA，每个样品DNA含量约20μg，用 Hind III酶切样品;采用Southern杂交的方法检测芸薹属B基因组染色体着丝粒区域一段特
异性重复序列pBNBH35，以Dig－11－dUTP作为底物合成探针序列。

Southern杂交按Roche公司的DIG－Southern方法进行。

2 结果与分析
2.1 多体附加系F3和F4群体植株体细胞染色体数
多体附加系F3和F4群体植株的根尖细胞染色体数存在着2n=44、41、40、39、38、37 这几种类型(图1)。

甘蓝型油菜/埃塞俄比亚芥种间杂交和回交后代中，体细胞染色体数多于甘蓝型油菜，有1～6条附加染色体，表明其为非整倍体植株。

2.2 花粉母细胞减数分裂染色体行为
两个世代群体的花粉母细胞减数分裂中期染色体行为观察结果，F3群体染色体基
本构型为(0－4)Ⅰ +(16－23)Ⅱ +(0－2)Ⅲ;F4群体的染色体基本构型为(0－8)Ⅰ
+(14－24)Ⅱ +(0－4)Ⅲ+(0－1)Ⅳ(表1)。

花粉母细胞减数分裂过程中观察到单价体(图2a，b)、三价体(图2b)、四价体(图2c)、环状多价体(图2d)、染色体桥(图
2e)、落后染色体(图2g)和分裂周期不同步现象(图2h)。

在观察的群体中各单株之间染色体数目存在客观的差异，这可能因为PMC减数分裂期间染色体不均等分离造成不同染色体数目的配子相互结合而形成。

由于个体之间染色体数目存在的差异可能也是导致植株根尖细胞与花粉母细胞染色体数目观察结果不同的原因。

图1 多体附加系F3和F4群体植株根尖细胞染色体数Fig.1 Chromosome numbers of root－tip cell from F3 and F4 lines注:a:根尖染色体数目2n=44;b:根尖染色体数目2n=41;c:根尖染色体数目2n=40;d:根尖染色体数目2n=39;e:根
尖染色体数目2n=38;f:根尖染色体数目2n=37;标尺:10μmNote:Root－tip cells with a(2n=44)，b(2n=41)，c(2n=40)，d(2n=39)，e(2n=38)and
f(2n=37).Bar=10μm
表1 PMCs M I染色体基本配对构型Table 1 Chromosome pairing behavior in M I of PMCs of F3 and F4 linesF3 7 184 0～4 16～23 0～2 0 F4 18 501 0～8 14～24 0～4 0～1
图2 F4群体花粉母细胞减数分裂染色体行为Fig.2 Chromosome behaviors of pollen mother cellmeiosis of F4注:a:减数分裂中期Ⅰ染色体构型为22Ⅱ+3Ⅰ，箭头指向单价体;b:减数分裂中期Ⅰ染色体构型为23II+1I，箭头指向单价体;c，d:
减数分裂中期Ⅰ，箭头指向环状多价体;e:减数分裂后期Ⅰ(AI)染色体出现不均等分离，染色体呈25∶26分离，箭头指向染色体桥;f:减数分裂后期Ⅰ(AI)染色体出现
不均等分离，染色体数呈20∶24分离;g:减数分裂后期Ⅰ(AI)，箭头指向落后染色体;h:减数分裂后期Ⅰ(AI)，分裂周期不同步;标尺10μmNote:a:m etaphase IPMC with 22Ⅱ +3I，arrow indicates univalent;b:metaphase IPMC with 23Ⅱ +1I，arrow indicates univalent;c to d:metaphase IPMC with
ringmultivalent;e:anaphase I，unequal disruption of chromosomes(25∶26)，arrow indicates chromosome bridges;f:anaphase Iwit h 20∶24 chromosomes in each polar;g:anaphase I，arrow indicates lagged chromosome;h:anaphase I:meiotic cycle asynchrony;Bar=10μm
2.3 GISH分析结果
以芸薹属B基因组(黑芥)DNA为探针，与Dodolla、F3和F4群体原位杂交结果(图3)，在Dodolla(含B基因组)细胞处于减数分裂后期Ⅰ的染色体中各检测到8
个杂交信号(图3a)。

在F3和F4群体植株的染色体组中未检测到明显的杂交信号
点(图3b，c)。

以芸薹属C基因组(甘蓝)DNA作探针与宁油10号、Dodolla和
F4群体的原位杂交分析结果显示(图3d，e，f)，在宁油10号基因组中检测到38
个杂交信号(图3d);在Dodolla的花粉母细胞两极各检测到9个杂交信号(图3e);
在其非整倍体后代植株中检测到全部染色体上均遍布杂交信号点(图3f)。

图3 F3和F4群体植株的基因组原位杂交(GISH)分析Fig.3 GISH analyses on PMC of B.carinata and F4注:a～f:蓝色表示DAPI染色，红色表示DNA探针信
号(生物素标记)，箭头指向杂交信号点;a，e为芸薹属BBCC组(埃芥)染色体;d为
芸薹属AACC组(甘蓝型油菜)染色体;b～c、f为F4群体植株染色体;a:减数分裂后期Ⅰ，染色体以17∶17分离，两极各有完整的8条染色体被B基因组探针标记;b:后期Ⅰ，染色体以20∶25分离，有3条染色体上出现了B基因组探针标记的信号，其中2个信号位于染色体末端区域，另一个染色体上出现了明显的杂交信号;c:后
期Ⅰ，染色体以22∶23分离，有2条染色体末端位置出现了较弱的B基因组探针标记信号;d:后期I，所有染色体上均有CC基因组(甘蓝)探针的信号，只是杂交信
号强度有差异;e:后期Ⅰ，共有18条染色体被CC基因组探针标记;f:后期Ⅰ，染色
体数目为39，以19:20分离，所有染色体上均有CC基因组探针的信号。

标尺
10μmNote:In a to f，blue indicates DAPIstaining result，and red indicates biotin －labeled signals.a:one anaphase ⅠPMC show chromosomes segregated at17∶17，two poles had 16 chromosomes labeled by B.nigra probe;b:one anaphaseⅠPMC show chromosomes segregated at20∶25，one bright signal and two small terminal signals covered with B.nigra probe;c:one anaphaseⅠPMC show chromosomes segregated at 22∶23，two chromosom e terminals labeled by B.nigra probe;d:at anaphaseⅠ，all
of the chromosomes of B.napus labeled by B.oleracea probe;e:one anaphaseⅠPMC，two poles had 18 chromosomes labeled by B.oleracea probe;f:one anaphase ⅠPMC show chromosomes segregated at19∶20，all chromo somes labeled by B.oleracea probe.Bar=10μm
2.4 PCR分析结果
用9对芸薹属B基因组特异性的引物序列对芸薹属6个种及F3和F4群体植株的20个单株的DNA进行 PCR扩增，结果显示 Ni2－A11、Ni4－A09、Ni4－D01 3对引物未能扩增出目标条带，其它6对引物 pBNBH35、Ni2－A08、Ni2－A11、Ni3－H07、Ni4－C06、和Ni4－G02在试验材料中均扩增出特异目标条带，这
些特异性条带大小与文献中所述相同(图片未完全列出)。

图4显示特异性序列Ni4－G02在这些植株中的PCR扩增结果，结果显示在含芸薹属B基因组的黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥中均扩增出特异目标条带(2、3、5泳道，箭头所示);在不含B基因组的白菜型油菜、甘蓝型油菜和甘蓝中均未能扩增出目标条带(1，4，6
泳道);在F3和F4群体植株(7到26泳道)中也未能扩增出相应的目标条带。

2.5 Southern blot分析结果
经体细胞染色体制片技术检测，用于Southern杂交的F4群体的6个单株花粉母细胞染色体数目确认为2n=39～45，染色体数目多于油菜染色体组数目。

但Southern杂交结果表明(图5)，含有芸薹属B组染色体的埃芥 (泳道3)和黑芥(泳
道4)均有强烈的杂交信号(329bp);而甘蓝型油菜Westar(泳道1)、宁油10号(泳
道2)和多体附加系F4群体中(泳道5～10)均无杂交信号。

Southern杂交结果显
示F4群体植株和甘蓝型油菜中均不含有芸薹属B组染色体的特异性重复序列pBNBH35。

图4 F3和F4群体植株的PCR产物的电泳图(特异性引物Ni4－G02)Fig.4 PCR detection of in progenies of F3 and F4(sequence specific primer Ni4－G02)注:1白菜型油菜;2黑芥;3芥菜型油菜;4甘蓝型油菜;5埃塞俄比亚芥;6甘蓝;7～26 F3和F4群体中单株Note:1，B.rapa;2，B.nigra;3，B.juncea;4，B.napus;5，B.carinata;6，B.oleracea;7 ～26，Indivdidual plants of F3 and F4
图5 F4群体植株的Southern杂交分析Fig.5 Southern blot analysis of plants
in F4注:1甘蓝型油菜品种Westar;2甘蓝型油菜品种宁油10号;3埃塞俄比亚芥
Dodolla;4黑芥;5～10是F4衍生后代单株Note:1，Westar(B.napus);2，Ningyou 10(B.napus);3，Dodolla(B.carinata);4，B.nigra;5 to 10，Individuals derived from F4
3 讨论
本研究目的是通过种间杂交，将存在于埃塞俄比亚芥Dodolla中的黄种皮基因转
移到甘蓝型油菜宁油10号中。

多体附加系NJ04－089是从种间杂交组合宁油10号/Dodolla//宁油10号种间杂种后代群体中的异常株经连续自交选择获得的。

该异常株体细胞染色体数2n=45，PMC减数分裂染色体构型为19Ⅱ+7Ⅰ，推论它是在甘蓝型油菜基础染色体(2n=38)附加了多条芸薹属B组染色体［10］。

但实
际结果表明，它的衍生后代基因组中可能并不含有整条的B组染色体。

由于在该
附加系衍生后代的花粉母细胞减数分裂过程中观察到多个三价体和四价体，而三价体、四价体产生于染色体间(或附加染色体与基础染色体间)的同源或部分同源配对。

因此认为，Nj04－089的附加染色体可能源自基础染色体组(AA、CC)部分染色体的复制。

该附加系可能是组内染色体附加系(种内非整倍体)。

有关种内非整倍体已在甘蓝型油菜与诸葛菜种间杂交研究中发现［12］。

在甘蓝型油菜与诸葛菜F1混倍体中获得一株2n=42的植株，在该植株的子房和花粉母细胞中没有检测到诸葛菜染色体，进一步研究表明它们为种内非整倍体。

种属间杂种后代的回交和强制自交，通过外源染色体与基础染色体间的部分同源联会和遗传重组后获得外缘基因的基础染色体，在花粉母细胞减数分裂过程中不正常染色体行为是否是形成染色体组内附加系的原因，值得进一步的研究。

本研究发现，由于附加染色体与基础染色体组间同源性差异可能较大，但存在部分同源关系，它们通过部分同源的不均衡联会，最终形成多个三价体和四价体。

部分花粉母细胞在AI期形成1～3个染色体桥，这些事件可能会造成染色体结构上的变化，其结果是导致基因的重复或丢失，改变附加系的基因组成和表达。

Navabi［11］等人从
B.napus/B.carinata//B.napus的BC2 S3的双单倍体(DH)后代中检测发现，有5%左右的DH系携带8条完整的或缺失的B组染色体。

Li等人［20］对三基因组杂种(ABC)细胞学研究结果，在50%以上花粉母细胞中观察到三价体和四价体。

表明存在A、B和C基因组染色体间的部分同源配对。

Mason等人研究发现［21］，在三基因组(ABC)杂种中，平均每个花粉母细胞中异源联会的频率A－C间(4.0)远远高于A－B(0.8)和B－C(0.3);对单倍体研究发现，同源联会频率A－A和C－
C(0.75)远高于 B －B(0.13)。

Mason等人［22］对 B.napus/B.carinata种间杂
种后代分子遗传分析表明，不同基因组染色体间的遗传物质的部分同源交换可以导致种间的遗传物质的渗入，即使这种渗入频率很低，它也可用来获得遗传稳定的人工异源多倍体。

Li［20］等人对三基因杂种(ABC)分子遗传分析结果，30%以上花粉母细胞有9个以上二价体。

基因组原位杂交证明，其中有两个二价体为B基因
组染色体。

虽然本研究GISH分析未能在这些附加系植株中检测到整条或大片段芸薹属B组染色体;PCR和Southern杂交结果也证明在这些非整倍体材料中未含有芸薹属B组染色体着丝粒区域特异性的重复序列，这只表明这些非整倍体材料的
染色体组成可能仍为AC染色体组，但这些染色体附加系中已经渗入了部分B组染色体的遗传片段。

研究表明，Nj04－089植株形态上带有较为明显的Dodolla的性状，表明Dodolla的部分遗传物质已经渗入到甘蓝型油菜的基因组中。

目前虽
然Navabi等人已经开发了一些B基因组DNA分子标记［11］，但对已经渗入到A或C基因组的B基因组遗传信息的检测有待开发更多的B基因组DNA分子标记。

参考文献:
［1］U N.Genome analysis in Brassica with special reference to the experimental formation of B.napus and peculiar mode of fertilization ［J］.Journal of Japan Botany，1935，7:389－452.
［2］Reyes B G D，Khush G S，Brar D S.Chromosomal location of eight isozyme loci in rice using primary trisomics andmonosomic alien addition lines［J］.Journal of Heredity，1998，89:164 －168.
［3］Miura H，Sugawara A.Dosage effects of the three Wx genes on amylose synthesis in wheat endosperm［J］.Theor Appl Genet，1996，93:1 066 －1 070.
［4］Satovic Z，Torres A M，Cubero J I.Estimation of linkage in trisomic inheritance［J］.Theor Appl Genet，1998，96:513－518.
［5］Zou JJ，Singh R J，Lee J，et al.Assignment ofmolecular linkage groups to soybean chromosomes by primary trisomics［J］.Theor Appl Genet，2003，107:745 － 750.
［6］Struss D，Bellin U，Röbbelen G.Developmentof B －genome chromosome addition lines of B.napus using different interspecific Brassica hybrids［J］.Plant Breeding，1991，106:209 －214.
［7］Budahn H，Schrader O，Peterka H.Development of a complete set of disomic rape － radish chromosome addition lines［J］.Euphytica，2008，162:117 － 128.
［8］Wang Y P，Zhao X X，Snowdon R J.Behaviour of Sinapis alba chromosomes in a Brassica napus background revealed by genomic in －situ hybridization［J］.Chromosome Research，2005，13:819 －826. ［9］Hua YW，Li ZY.Genomic in situ hybridization analysis of intergeneric hybrids between Brassica napus and Orychophragmus violaceus and production of B.napus aneuploids［J］.Plant Breeding，2006，125:144 －149.
［10］袁世峰，戚存扣.甘蓝型油菜埃芥二体附加系92I1096附加染色体的遗传分析［J］.江苏农业学报，2007(4):289－294.
［11］Navabi Z K，Parkin IA P.Introgression of B－genome chromosomes in a doubled haploid population of Brassica napus× B.carinata
［J］.Genome，2010，53:619 －629.
［12］华玉伟，完颜瑞红，李再云.甘蓝型油菜三体、双三体和双四体的形态和细胞学特征［J］.作物学报，2006，32:785－786.
［13］Rashid A，Rakow G，Downey R K.Development of yellow seeded Brassica napus through interspecific crosses［J］.Plant Breeding，1994，112:127 － 134.
［14］戚存扣，仲裕泉，傅寿仲.埃塞俄比亚芥黄种皮性状向甘蓝型油菜的转移研究［J］.江苏农业学报，1996(12):23－28.
［15］Zhong X B，Hans de Jong J，Zabel P.Preparation of tomato meiotic pachytene and mitotic metaphase chromosomes suitable for fluorescence in situ hybridization(FISH)［J］.Chromosome Research，1996，4:24 －28. ［16］Snowdon R J，KohlerW，Kohler A.Genomic in situ hybridization in Brassica amphidiploids and interspecific hybrids［J］.Theor Appl Genet，1997，95:1 320 － 1 324.
［17］Li M，Qian W，Meng J，et al.Construction of novel Brassica napus genotypes through chromosomal substitution and elimination using interploid species hybridization［J］.Chromosome Research，2004，12:417 －426.
［18］Schelfhout C J，Snowdon R，Wroth JM.A PCR based B － genome － specific marker in Brassica species［J］.Theor Appl Genet，2004，
109:917 －921.
［19］Márquez－Lema A，Velasco L，Pérez－ Vich B.Transferability，amplification quality，and genome specificity ofmicrosatellites in Brassica carinata and related species［J］.Journal of Applied Genetics，2010，51:123 －131.
［20］Li M T，Li Z Y，Meng J L.Reproduction and cytogenetic characterization of interspecific hybrids derived from crosses between Brassica carinata and B.rapa［J］.Theor Appl Genet，2005，10:1 284 －1 289.
［21］Mason A S，Huteau V，Eber F.Genome structure affects the rate of autosyndesis and allosyndesis in AABC，BBAC and CCAB Brassica interspecific hybrids［J］.Chromosome Research，2010，18:655 －666. ［22］Mason A S，Nelson M N，Castello M，et al.Genotypic effects on the frequency ofhomoeologous and homologous recombination in Brassica napus× B.carinata hybrids［J］.Theor Appl Genet，2011，122:543 － 553.。