针刺对不同时段睡眠剥夺大鼠模型行为学及TNF-α含量的影响

针刺对不同时段睡眠剥夺大鼠模型行为学及TNF-α含量的影响程少冰张毅敏唐纯志1张玉佩赖新生1杨君军1（暨南大学医学院中医系，广东广州510632）〔摘要〕目的探讨失眠的发病机制及针刺治疗失眠的调控机制。

方法将SD 大鼠随机分为10组，每组8只，设为正常组，失眠组，西药组，针刺组，后三组又根据24，72和120h 三个不同时段各分为三组。

各实验组大鼠在睡眠剥夺结束后，根据不同组别和时段（24、72、120h ）分别进行旷场实验，测试其水平得分、垂直得分和中央格停留时间；随即将相应组别大鼠快速摘眼取血，采用放射免疫法检测血浆肿瘤坏死因子（TNF-α）含量的变化。

结果①行为学变化：与各时段失眠组大鼠比较，针刺组大鼠水平得分、垂直得分呈下降趋势，针刺组大鼠中央格停留时间呈上升趋势，其中针刺120h 组垂直得分和中央格停留时间有统计学意义（P ＜0.01）。

②血浆TNF-α含量变化：与各时段失眠组比较，针刺组血浆TNF-α含量整体呈升高趋势，其中针刺72h 组和120h 组的TNF-α含量明显升高（P ＜0.05，P ＜0.01）。

结论针刺能显著改善睡眠剥夺大鼠的精神状态，增强其认知能力和反应能力；针刺可以提高睡眠剥夺大鼠TNF-α的含量，达到缓解失眠的效果，且治疗时间越长，效果越明显。

〔关键词〕失眠；针刺；睡眠剥夺；大鼠；行为学；TNF-α〔中图分类号〕R2-031〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）01-0077-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.01.033Research of behavior change and TNF-αcontent about acupuncture on rat model of sleep deprivation in different periodsCHENG Shao-Bing ，ZHANG Yi-Min ，TANG Chun-Zhi ，et al .Department of Traditional Chinese Medicine ，Medical College ，Jinan University ，Guangzhou 510632，Guangdong ，China 【Abstract 】Objective To explore the mechanism of insomnia mice for the purpose of providing some experimental proof about acu-puncture therapy on insomnia.Methods 80male SD mice were randomly divided into control （CC ），model （S ），insomnia with western medicine （SX ），insomnia with acupuncture （SZ ）groups.Except mice in control group ，mice in other groups were divided into 3groups ac-cording to the different time of sleep deprived ：24，72and 120hours.Content of TNF-αin the eye of mice was detected by radiation immune method.The clinical effect and the influence on open field test （testing ：crossing score ，rearing score ，latency time ）were studied.Results In the behavior test ，the crossing score and rearing score of SZ group were significantly less than that of CC group ，and the latency time was raised.In the test of immune cytokine ，TNF-αof acupuncture group for 72h and 120h （SZ group ）was significantly more than those ofCC group （P ＜0.01，P ＜0.05）.Conclusions Acupuncture has improved behavior effects as reaction and learning ability ，and can in-crease the TNF-αcontent and decrease the damage of insomnia.【Key words 】Insomnia ；Acupuncture ；Sleep deprived ；Rat ；Behavior ；TNF-α基金项目：广东省中医药局资助项目（No.20111172）；广东省高等教育学会基金项目（No.2010061）；广州中医药大学创新基金项目（No.04006）1广州中医药大学针灸推拿学院通讯作者：杨君军（1975-），男，博士，副教授，主要从事针灸治病的机制研究。

第一作者：程少冰（1970-），女，硕士，高级实验师，主要从事中西医结合临床基础研究。

失眠症，中医古籍中称为“不寐”、“目不瞑”、“不得眠”等。

中医认为失眠是由于心神失养或不安引起经常不能获得正常睡眠为特征的一类病证。

其症状表现为入睡困难，睡而易醒，醒后不能再睡，或晨醒过早，时睡时醒或整夜不能入睡。

近年来失眠的发病率有逐年上升的趋势。

本实验以传统穴位申脉、照海、四神聪和神门为干预穴位，结合现代研究方法，探讨针刺治疗失眠的作用机制。

1材料与方法1.1材料1.1.1动物清洁级SD 雄性大鼠80只，体重200 250g ，由广州中医药大学实验动物中心提供，大鼠在相同条件下分笼饲养于清洁级动物实验室中，温度20 22ħ，相对湿度60% 80%，定时通风换气，常规喂养1w 。

1.1.2主要试剂肿瘤坏死因子（TNF ）-α放射免疫试剂盒购于北京普尔伟业生物科技有限公司。

地西泮（安定）注射液，天津金耀氨基酸有限公司生产，生产批号0904131，规格：2ml ：10mg 。

1.2方法1.2.1实验分组将SD 大鼠随机分为10组，每组8只：正常组，失眠组，西药组，针刺组，后三组又根据24h ，72h 和120h 三个时段不同各分为三组。

失眠大鼠模型采用小平台水环境法制备，实验箱为30cm ˑ30cm ˑ40cm 大小的塑料水箱，水箱四周和中心立有直径6cm 圆形平台，箱中注满水，水面距平台面约1cm 。

大鼠可在平台上自由进食饮水，如果睡眠，会因肌张力松弛而落入水中。

实验期间持续灯光照射，室内温度控制在18.0 22.0ħ。

每日更换箱中的水，水温保持在20ħ左右。

正常组单独笼养，自然昼夜照明，其余饲养条件相同。

1.2.2干预方法所有大鼠适应性饲养3d 。

实验由第4日上午8：00开始，针刺治疗为每12小时一次，参照《实验针灸学》大鼠穴位定位方法〔1，2〕，取穴申脉、照海、神门、四神聪，30号1寸毫针直刺或斜刺0.1 4cm 得气，平补平泻，留针10min ，中间运针1次约2min 。

西药治疗为腹腔注射安定，按成人催眠剂量（10mg /d ），用人鼠给药剂量体表面积折算公式计算出大鼠给药剂量为0.90mg /kg ，每日一次，上午9：00 9：30注射。

1.2.3观察指标1.2.3.1观察针刺对睡眠剥夺大鼠行为学的影响各实验组大鼠在睡眠剥夺结束后，根据不同组别和时段（24、72、120h ）分别进行旷场实验，通过测试其水平得分、垂直得分和中央格停留时间，以观察各组大鼠在不同处理因素干预下表现出来的行为差异。

大鼠旷场场箱高40cm ，底边长100cm ，内壁涂黑，底面平均分为25个4cm ˑ4cm 小方格。

测试时，将大鼠置于旷场场箱底面中心，观察其3min 内活动及行为变化。

观察指标：以大鼠在中央格（即不靠近内壁的9个格子）停留的时间为中央格停留时间，以大鼠穿越底面的方格数为水平得分，以后肢站立的次数为垂直得分。

记录各组动物在旷场中的水平活动得分、垂直活动得分和中央格内停留时间。

两次实验之间，清洗场箱内壁及底面，以免上次动物余留的信息（如动物的大、小便、气味）影响下次测试结果。

更换动物，继续实验。

1.2.3.2观察针刺对睡眠剥夺大鼠血浆TNF-α含量的影响于实验开始后的第24、72、120小时点分别将相应组别大鼠快速摘眼取血。

分别取血浆3 4ml ，3000r /min 离心10min ，沉淀，取上清液置于－20ħ冰箱内保存待测。

采用放射免疫法进行检测。

1.3统计学处理应用SPSS13.0统计软件进行处理，各组数据以x ʃs 表示，数据需经正态分布检验，方差齐性检验用Lev-ene 法，多组间差异的显著性分析用单因素方差分析，方差齐时用LSD 法，不齐时用Tamhane 法检验。

2结果2.1一般行为观察正常组在120h 内全部精神活泼、稳定，活动如常；失眠组（24h ）、针刺组（24h ）与正常组比较在早期都表现为兴奋性增高，易激惹，对外界的反应性及攻击性增强，抓取时反抗较剧，咬人。

但失眠组（72h 、120h ），可见大鼠反应性降低，体重明显下降，精神疲惫、萎靡，反应迟钝，警觉力下降等现象。

而针刺组（72h 、120h ）大鼠无明显体重减轻、反应迟钝和警觉力下降表现、精神比较稳定。

西药组（24、72、120h ）普遍表现为精神萎靡、反应迟钝、嗜睡倾向明显，体重轻微下降，并有落水现象。

2.2针刺对睡眠剥夺大鼠行为学的影响与正常组比较，失眠24h 组大鼠在旷场中的水平得分呈现上升趋势，但未有统计学意义（P ＞0.05），失眠72h 组和失眠120h 组大鼠水平得分差异有统计学意义（P ＜0.05，P ＜0.01）；与失眠120h 组比较，西药120h 组有显著性差异（P ＜0.05）；与各时段模型组（24h ，72h ，120h ）比较，针刺组水平得分呈下降趋势（P ＞0.05）。

各时段西药组（24，72，120h ）和相应针刺组（24，72，120h ）比较，无显著性差异（P ＞0.05）；与正常组比较，各时段失眠组（24，72，120h ）大鼠在旷场中的垂直得分呈现上升趋势，其中失眠120h 组差异有统计学意义（P ＜0.01）；与失眠120h 组比较，西药120h 组有显著性差异（P ＜0.05），针刺120h 组有极显著性差异（P ＜0.01）；各时段西药组（24，72，120h ）和相应针刺组（24，72，120h ）比较，无显著性差异（P ＞0.05）；与正常组比较，各时段失眠组（24，72，120h ）大鼠在旷场中央格停留时间呈现下降趋势，其中失眠72h 和120h 组下降明显，差异有统计学意义（P ＜0.05，P ＜0.01）；与失眠120h 组比较，针刺120h 组有极显著性差异（P ＜0.01）；各时段西药组（24，72，120h ）和相应针刺组（24，72，120h ）比较，无显著性差异（P ＞0.05）。