AD大鼠模型的制备及行为学和超微结构研究
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Department of Neurobiology , Third Military Medical University , Chongqing 400038 Abstract : Objective To observe the learning and memory , level ofβ2amyloid protein and ultra2structure changes in the central nervous system
是研究的热点 。目前认为 AD 的病因主要有基因突
变[6] 、内分泌改变[7] 、慢性炎症[8] 和氧化应激 ,其中氧
化应激 被 认 为 是 AD 发 病 过 程 中 的 一 个 关 键 性 因
素[9] 。AD 的动物模型的制备原理就是模拟了以上几
种 AD 的病因和病理生理改变 。
尽管 AD 的病因多种多样 ,但 AD 的中后期都会出
二 、AD 大鼠模型的行为学检测 (Morris 水迷宫) Morris 水迷宫由直径 94cm ,高 55cm 圆形水池及高 38cm、面 积 6cm ×10cm 的 站 台 构 成 , 液 面 高 出 站 台 2cm ,水温维持在 (25 ±0. 5) ℃。 行为训练程序包括 : (1) 学习组 :大鼠共接受训练 36 次 ,每天 6 次 ,每次间隔 15min , 共 6 天 。(2) 记忆 组 :训练结束后一周开始检测性训练 ,共 3 天半 ,每天 6 次 ,从入水到找到站台时间作为潜伏期 (Latency) 。 三 、β2淀粉样蛋白的放射免疫测定 1. 测定前样本处理 :实验毕 ,将大鼠断头活杀开 颅 ,在冰台上分离出海马等脑区 ,生理盐水中煮沸 5 分 钟 ,匀浆 ,4000rpm 离心 15 分钟 ,取上清 ,220 ℃保存待 测。 2.β2淀粉样蛋白测定方法 :参照β2AP 放免测试盒 (解放军总医院放免所产品) 说明书进行 。离心去上清 后 γ, 计数器上计数 1min 。计算 (BΠBo) ×100 % ,从标 准曲线中找出抗原的含量 ,换算成每 mg 蛋白β2AP 的 含量 。 3. 样品蛋白含量测定 :以福林酚法对各样本总蛋 白含量进行测定 。 四 、AD 大鼠大脑皮层和海马神经元内超微结构的 变化 1. 电镜标本的取材和制作 :实验毕 ,大鼠经多聚甲
一 、AD 大鼠的空间记忆功能改变 皮下间断注射 NaN3 后 1～4 周 ,大鼠 Morris 水迷 宫测试潜伏期由生理盐对照组的 10 秒以下升高到 40 秒至 2 分钟之间 (图 1) ,以注射叠氮钠 4 周组大鼠的潜 伏期升高最为明显 ,升高 974. 75 %( P < 0. 01) 。 二 、AD 大鼠 CNS 内 Aβ的变化 生理盐水对照组各脑区 Aβ含量较正常对照组没 有明显差异 。注射 NaN3 1 周组大鼠额叶大脑皮层中 Aβ升高 ,较对照组升高 177. 02 % ( P < 0. 01) ,注射
与生理盐水对照组相比 , 3 P < 0. 05 , 3 3 P < 0. 01
三 、AD 大鼠皮层和海马神经元超微结构改变
1. 海马神经元
注射 NaN3 后 4 周 , 大鼠海马 CA1 区神经元中可
见脂褐素沉积 (图 2 A) ,出现髓鞘样改变 (图 2 A) 。神
经元内线粒体出现肿胀 ,线粒体嵴断裂 、数目减少 (图
图 1 注射叠氮钠后大鼠 Morris 水迷宫测试潜伏期变化 表 1 注射叠氮钠后大鼠中枢神经系统内β- 淀粉样蛋白含量的变化 (单位 :pgΠmg protein)
皮层
海马
空白对照组
生理盐水对照组 注射 NaN3 后 1 周组 注射 NaN3 后 2 周组 注射 NaN3 后 3 周组 注射 NaN3 后 4 周组
关键词 :阿尔茨海默氏病 ;氧化应激 ;学习记忆 β; 2淀粉样蛋白 ;大鼠 Establishment of Alzheimer disease rat model and its praxiology and ultrastructure research XU Hai2wei , LI Hai2di , FAN Xiao2tang , et al .
18. 50 ±5. 88 21. 45 ±6. 76 59. 42 ±12. 11 3 3 89. 54 ±13. 20 3 3 93. 66 ±15. 38 3 3 119. 67 ±20. 79 3 3
38. 32 ±8. 34 42. 65 ±4. 76 48. 82 ±8. 91 64. 87 ±5. 81 3 68. 73 ±8. 25 3 78. 67 ±16. 65 3 3
2B) 。
2. 额叶大脑皮层
注射 NaN3 后 4 周 , 大鼠额叶大脑皮层神经元中
出现髓鞘样改变 , 同一视野中可见多处髓鞘样改变
(图 2 C ) ,神经元内线粒体肿胀 ,线粒体嵴断裂 ,突触
内清亮突触小泡数目减少 (图 2 D ) 。图 2 见封二 。Fra bibliotek讨 论
AD 是痴呆最常见的原因 ,其病因和发病机理一直
nervous system , retrograde degeneration and mitochondria damage in the neurons. Key words : Alzheimer disease ;Oxidative stress ;Learning and memory ;β2amyloid peptide ; Rat 中图分类号 :R742. 5 文献标识码 :A 文章编号 :100528559 (2003) 022123202
五 、统计学处理
统计采用医用统计软件 SPSS(Ver 8. 0) 中的 t2pair test 和相关性分析程序 。
结 果
NaN3 2 周和 3 周组额叶皮层中 Aβ也明显升高 ( P < 0. 01) , 注射 NaN3 4 周组额叶皮层 Aβ升高达峰值 ,较 对照组升高 546. 86 %( P < 0. 01) 。海马中 Aβ的含量 在注射 NaN3 后也明显升高 ,并在注射 NaN3 后 4 周组 升高达峰值 ,较对照组升高 105. 30 % ( P < 0. 01) , 此 时小脑皮层中的 Aβ也升高了 29. 33 % ( P < 0. 05) 见 表 1。
材料和方法 一 、AD 大鼠模型的制备 Wistar 大鼠 48 只 (本校实验动物中心提供) ,雌雄
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30100087) ;全军“十五”青年基金 资助项目 (01Q099)
不拘 ,体重 190g 至 215g ,按 3mg. kg- 1Π2h 皮下间断注射 NaN3 ,注射 8 次Π天 ,连续注射 4 周[5] ,以同等剂量的生 理盐水代替 NaN3 作为对照组 。
现氧化应激 (oxidative stress) 。氧化应激是 AD 的重要
的病因 ,并随着 AD 病程的进行而逐渐加重[10] 。而 AD
的神经损伤又可加重氧化应激[11] 。Bennett 等[5 ,12] 等注
of the rats which were chronically injected sodium azide . Methods After the establishment of AD model , the memory of the rats was surveyed by Morris water maze test , the level of Aβwas assayed with radioimmunoassay and the ultrastructure of neuron was observed with transmission electron microscope. Results Increase of escape latency in Morris water maze test and elevation ofβ2amyloid protein level in the frontal cortex and hippocam2 pus of rats were obvious after injection of sodium azide. And the ultra2structure of neuron including retrograde degeneration such as lipofuscin deposit and myelin sheath2like changes , mitochondria swelling and cristae fragmentation , synaptic corpuscle decreased. Conclusion An Alzheimer disease rat model was established by chronically subcutaneously injection of sodium azide , which resulted in increasing ofβ2amyloid protein level in the central
阿尔茨海默氏病 (Alzheimer Disease , AD) 患者脑内 存在多种生化及组织学方面的异常变化 ,建立理想的 动物模型对探明 AD 的病因 、病程及治疗极为重要 。 目前采用的 AD 模型可分为神经元直接损伤模型[1] 和 胆碱能系统损伤模型[2] ,这两类模型模拟 AD 中后期 神经细胞变性坏死的病理改变 ,无法模拟 AD 缓慢发 病过程 ,且胆碱能损伤模型 CNS 未见特征性病理改 变 。将 AD 的致病基因导入生殖细胞可制备 AD 的转 基因动物模型 ,但由于 AD 的发生往往是多个基因的 共同作用[3 ,4] ,转染单个基因效果并不理想 ,况且转基 因动物技术要求高 ,难度很大 。AD 病人血小板中线粒 体细胞色素氧化酶活性出现显著降低 , Bennett 等[5] 根 据这一病理改变 ,采用长期皮下注射线粒体细胞色素 氧化酶的特异性阻断剂叠氮钠 ( Sodium Azide ,NaN3 ) , 大鼠出现明显的记忆障碍 ,海马脑片 LTP 也受到明显 抑制 ,初步证实该模型可以作为 AD 模型 ,但该模型中 AD 的典型病理产物β2淀粉样蛋白 (β2amyloid ,Aβ) 及神 经元的超微结构有何改变 ,未见报道 。本文采用放射 免疫和透射电镜对该模型的可靠性加以分析 ,希望有 助于理解 AD 氧化损伤的病理基础 。
中国行为医学科学 2003 年第 12 卷第 2 期
基础研究·论著
·123 ·
AD 大鼠模型的制备及行为学和超微结构研究
徐海伟1 , 黎海蒂1 , 范晓棠2 , 曹娟1 , 龚发云1 (1. 第三军医大学生理学教研室 ,2. 第三军医大学神经生物学教研室 ,重庆 400038)
摘要 :目的 观察大鼠皮下长期间断性注射叠氮钠后的学习记忆 、中枢神经系统β2淀粉样蛋白 (Aβ) 含量和神经元超微结构的 改变 。方法 采用 Morris 水迷宫 、放射免疫和透射电镜的方法 。结果 注射氮钠后 4 周 ,大鼠 Morris 水迷宫试验逃逸潜伏期明显延 长 ,海马和额叶大脑皮层内 Aβ含量显著升高 ,神经元内出现脂褐素沉积 、髓鞘样变等退行性变 ,线粒体肿胀 、嵴断裂 、数目减少 ,突 触小泡数目减少 。结论 长期皮下注射叠氮钠可以制备 AD 氧化应激大鼠模型 , 并导致中枢 Aβ的升高 ,神经元内出现退行性变和 线粒体的损伤 。
·124 ·
中国行为医学科学 2003 年第 12 卷第 2 期
醛主动脉灌注固定后 ,分离出海马 CA1 区和额叶大脑 皮层 ,3 %的戊二醛溶液 4 ℃固定 24h 。漂洗 ,1 % 锇酸 后固定 ,丙酮脱水 ,饱和醋酸铀电子染色 ,环氧树脂2 618 包埋 。半薄切片 (片厚 1μm) ,J TEM22000EX 电子显 微镜观察 ,照相 。
是研究的热点 。目前认为 AD 的病因主要有基因突
变[6] 、内分泌改变[7] 、慢性炎症[8] 和氧化应激 ,其中氧
化应激 被 认 为 是 AD 发 病 过 程 中 的 一 个 关 键 性 因
素[9] 。AD 的动物模型的制备原理就是模拟了以上几
种 AD 的病因和病理生理改变 。
尽管 AD 的病因多种多样 ,但 AD 的中后期都会出
二 、AD 大鼠模型的行为学检测 (Morris 水迷宫) Morris 水迷宫由直径 94cm ,高 55cm 圆形水池及高 38cm、面 积 6cm ×10cm 的 站 台 构 成 , 液 面 高 出 站 台 2cm ,水温维持在 (25 ±0. 5) ℃。 行为训练程序包括 : (1) 学习组 :大鼠共接受训练 36 次 ,每天 6 次 ,每次间隔 15min , 共 6 天 。(2) 记忆 组 :训练结束后一周开始检测性训练 ,共 3 天半 ,每天 6 次 ,从入水到找到站台时间作为潜伏期 (Latency) 。 三 、β2淀粉样蛋白的放射免疫测定 1. 测定前样本处理 :实验毕 ,将大鼠断头活杀开 颅 ,在冰台上分离出海马等脑区 ,生理盐水中煮沸 5 分 钟 ,匀浆 ,4000rpm 离心 15 分钟 ,取上清 ,220 ℃保存待 测。 2.β2淀粉样蛋白测定方法 :参照β2AP 放免测试盒 (解放军总医院放免所产品) 说明书进行 。离心去上清 后 γ, 计数器上计数 1min 。计算 (BΠBo) ×100 % ,从标 准曲线中找出抗原的含量 ,换算成每 mg 蛋白β2AP 的 含量 。 3. 样品蛋白含量测定 :以福林酚法对各样本总蛋 白含量进行测定 。 四 、AD 大鼠大脑皮层和海马神经元内超微结构的 变化 1. 电镜标本的取材和制作 :实验毕 ,大鼠经多聚甲
一 、AD 大鼠的空间记忆功能改变 皮下间断注射 NaN3 后 1～4 周 ,大鼠 Morris 水迷 宫测试潜伏期由生理盐对照组的 10 秒以下升高到 40 秒至 2 分钟之间 (图 1) ,以注射叠氮钠 4 周组大鼠的潜 伏期升高最为明显 ,升高 974. 75 %( P < 0. 01) 。 二 、AD 大鼠 CNS 内 Aβ的变化 生理盐水对照组各脑区 Aβ含量较正常对照组没 有明显差异 。注射 NaN3 1 周组大鼠额叶大脑皮层中 Aβ升高 ,较对照组升高 177. 02 % ( P < 0. 01) ,注射
与生理盐水对照组相比 , 3 P < 0. 05 , 3 3 P < 0. 01
三 、AD 大鼠皮层和海马神经元超微结构改变
1. 海马神经元
注射 NaN3 后 4 周 , 大鼠海马 CA1 区神经元中可
见脂褐素沉积 (图 2 A) ,出现髓鞘样改变 (图 2 A) 。神
经元内线粒体出现肿胀 ,线粒体嵴断裂 、数目减少 (图
图 1 注射叠氮钠后大鼠 Morris 水迷宫测试潜伏期变化 表 1 注射叠氮钠后大鼠中枢神经系统内β- 淀粉样蛋白含量的变化 (单位 :pgΠmg protein)
皮层
海马
空白对照组
生理盐水对照组 注射 NaN3 后 1 周组 注射 NaN3 后 2 周组 注射 NaN3 后 3 周组 注射 NaN3 后 4 周组
关键词 :阿尔茨海默氏病 ;氧化应激 ;学习记忆 β; 2淀粉样蛋白 ;大鼠 Establishment of Alzheimer disease rat model and its praxiology and ultrastructure research XU Hai2wei , LI Hai2di , FAN Xiao2tang , et al .
18. 50 ±5. 88 21. 45 ±6. 76 59. 42 ±12. 11 3 3 89. 54 ±13. 20 3 3 93. 66 ±15. 38 3 3 119. 67 ±20. 79 3 3
38. 32 ±8. 34 42. 65 ±4. 76 48. 82 ±8. 91 64. 87 ±5. 81 3 68. 73 ±8. 25 3 78. 67 ±16. 65 3 3
2B) 。
2. 额叶大脑皮层
注射 NaN3 后 4 周 , 大鼠额叶大脑皮层神经元中
出现髓鞘样改变 , 同一视野中可见多处髓鞘样改变
(图 2 C ) ,神经元内线粒体肿胀 ,线粒体嵴断裂 ,突触
内清亮突触小泡数目减少 (图 2 D ) 。图 2 见封二 。Fra bibliotek讨 论
AD 是痴呆最常见的原因 ,其病因和发病机理一直
nervous system , retrograde degeneration and mitochondria damage in the neurons. Key words : Alzheimer disease ;Oxidative stress ;Learning and memory ;β2amyloid peptide ; Rat 中图分类号 :R742. 5 文献标识码 :A 文章编号 :100528559 (2003) 022123202
五 、统计学处理
统计采用医用统计软件 SPSS(Ver 8. 0) 中的 t2pair test 和相关性分析程序 。
结 果
NaN3 2 周和 3 周组额叶皮层中 Aβ也明显升高 ( P < 0. 01) , 注射 NaN3 4 周组额叶皮层 Aβ升高达峰值 ,较 对照组升高 546. 86 %( P < 0. 01) 。海马中 Aβ的含量 在注射 NaN3 后也明显升高 ,并在注射 NaN3 后 4 周组 升高达峰值 ,较对照组升高 105. 30 % ( P < 0. 01) , 此 时小脑皮层中的 Aβ也升高了 29. 33 % ( P < 0. 05) 见 表 1。
材料和方法 一 、AD 大鼠模型的制备 Wistar 大鼠 48 只 (本校实验动物中心提供) ,雌雄
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30100087) ;全军“十五”青年基金 资助项目 (01Q099)
不拘 ,体重 190g 至 215g ,按 3mg. kg- 1Π2h 皮下间断注射 NaN3 ,注射 8 次Π天 ,连续注射 4 周[5] ,以同等剂量的生 理盐水代替 NaN3 作为对照组 。
现氧化应激 (oxidative stress) 。氧化应激是 AD 的重要
的病因 ,并随着 AD 病程的进行而逐渐加重[10] 。而 AD
的神经损伤又可加重氧化应激[11] 。Bennett 等[5 ,12] 等注
of the rats which were chronically injected sodium azide . Methods After the establishment of AD model , the memory of the rats was surveyed by Morris water maze test , the level of Aβwas assayed with radioimmunoassay and the ultrastructure of neuron was observed with transmission electron microscope. Results Increase of escape latency in Morris water maze test and elevation ofβ2amyloid protein level in the frontal cortex and hippocam2 pus of rats were obvious after injection of sodium azide. And the ultra2structure of neuron including retrograde degeneration such as lipofuscin deposit and myelin sheath2like changes , mitochondria swelling and cristae fragmentation , synaptic corpuscle decreased. Conclusion An Alzheimer disease rat model was established by chronically subcutaneously injection of sodium azide , which resulted in increasing ofβ2amyloid protein level in the central
阿尔茨海默氏病 (Alzheimer Disease , AD) 患者脑内 存在多种生化及组织学方面的异常变化 ,建立理想的 动物模型对探明 AD 的病因 、病程及治疗极为重要 。 目前采用的 AD 模型可分为神经元直接损伤模型[1] 和 胆碱能系统损伤模型[2] ,这两类模型模拟 AD 中后期 神经细胞变性坏死的病理改变 ,无法模拟 AD 缓慢发 病过程 ,且胆碱能损伤模型 CNS 未见特征性病理改 变 。将 AD 的致病基因导入生殖细胞可制备 AD 的转 基因动物模型 ,但由于 AD 的发生往往是多个基因的 共同作用[3 ,4] ,转染单个基因效果并不理想 ,况且转基 因动物技术要求高 ,难度很大 。AD 病人血小板中线粒 体细胞色素氧化酶活性出现显著降低 , Bennett 等[5] 根 据这一病理改变 ,采用长期皮下注射线粒体细胞色素 氧化酶的特异性阻断剂叠氮钠 ( Sodium Azide ,NaN3 ) , 大鼠出现明显的记忆障碍 ,海马脑片 LTP 也受到明显 抑制 ,初步证实该模型可以作为 AD 模型 ,但该模型中 AD 的典型病理产物β2淀粉样蛋白 (β2amyloid ,Aβ) 及神 经元的超微结构有何改变 ,未见报道 。本文采用放射 免疫和透射电镜对该模型的可靠性加以分析 ,希望有 助于理解 AD 氧化损伤的病理基础 。
中国行为医学科学 2003 年第 12 卷第 2 期
基础研究·论著
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AD 大鼠模型的制备及行为学和超微结构研究
徐海伟1 , 黎海蒂1 , 范晓棠2 , 曹娟1 , 龚发云1 (1. 第三军医大学生理学教研室 ,2. 第三军医大学神经生物学教研室 ,重庆 400038)
摘要 :目的 观察大鼠皮下长期间断性注射叠氮钠后的学习记忆 、中枢神经系统β2淀粉样蛋白 (Aβ) 含量和神经元超微结构的 改变 。方法 采用 Morris 水迷宫 、放射免疫和透射电镜的方法 。结果 注射氮钠后 4 周 ,大鼠 Morris 水迷宫试验逃逸潜伏期明显延 长 ,海马和额叶大脑皮层内 Aβ含量显著升高 ,神经元内出现脂褐素沉积 、髓鞘样变等退行性变 ,线粒体肿胀 、嵴断裂 、数目减少 ,突 触小泡数目减少 。结论 长期皮下注射叠氮钠可以制备 AD 氧化应激大鼠模型 , 并导致中枢 Aβ的升高 ,神经元内出现退行性变和 线粒体的损伤 。
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中国行为医学科学 2003 年第 12 卷第 2 期
醛主动脉灌注固定后 ,分离出海马 CA1 区和额叶大脑 皮层 ,3 %的戊二醛溶液 4 ℃固定 24h 。漂洗 ,1 % 锇酸 后固定 ,丙酮脱水 ,饱和醋酸铀电子染色 ,环氧树脂2 618 包埋 。半薄切片 (片厚 1μm) ,J TEM22000EX 电子显 微镜观察 ,照相 。