生物技术综合大实验

2013-2014学年生命科学综合大实验GFP分离与纯化

1.文献综述

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria )中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。

GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。

北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地

亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。

下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。

2.实验器材

2.1实验材料：

含GFP融合质粒，Top10菌株

2.2实验试剂：

质粒提取：溶液Ⅰ：50mM葡萄糖/10mM EDTA /25mM Tris-HCl，pH=8.0；溶液Ⅱ：0.2M NaOH/1% SDS；溶液Ⅲ：3M醋酸钾/2M醋酸；无水乙醇，75%乙醇，TE Buffer；

转化：0.1M预冷CaCl2，LB培养基，氨苄青霉素，阿拉伯糖；

GFP提取：液氮，Lysis Buffer，饱和(NH4)2SO4溶液，溶菌酶；

疏水作用层析柱材：苯基琼脂糖凝胶CL-4B；

离子交换柱层析柱材：DEAE+纤维素，

Start Buffer(A液20mM Tris-HCl，pH7.0（透析液）)

Elution buffer(B液20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0) SDS-PAGE电泳：PEG10000，Loading Buffer，溴酚蓝，丙烯酰胺，Tris，SDS，过硫酸铵，TEMED，Gly，SDS，甘油，β-巯基乙醇，溴酚蓝，甲醇，考马斯亮蓝，乙酸等

2.3实验仪器

高速冷冻离心机,移液枪，超声波破碎仪，梯度混合器，恒流泵,层析柱,色谱仪,自动记录仪,SDS-PAGE电泳装置。

3.实验方法

3.1质粒提取

1.取1.5mL菌液，12000rpm离心1min，弃上清液；

2.加100μL溶液Ⅰ，充分悬浮；

3.加200μL溶液Ⅱ，温和混匀，室温5min；

4.加150μL溶液Ⅲ，混匀，冰浴5min；

5.12000rpm离心8min，将上清加入一新的1.5ml EP管中；

6.加800μL无水乙醇至上清液中，混匀，-20℃放置10min，12000rpm 离心8min，弃上清；

7.70%乙醇洗DNA一次，离心弃上清；

8.在超净台中吹干DNA（一般吹5-10min即可）；

9.加40μL TE Buffer溶解DNA，4℃备用。

3.2感受态细胞的制备以及转化

1.取1.5mL Top10菌液，在4℃ 4000rpm离心10min，弃上清；

2.加200μL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀（无菌操作），冰浴15min后4℃ 4000rpm离心10min，弃上清；

3.加200μL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀（无菌操作），4℃备用；

4.将1μL质粒和感受态细胞混合，冰浴30min；

5.42℃热激90s；

6.立即放在冰上3-5min；

7.加入800μL LB液体培养基，37℃ 150rpm培养60min（使Top10恢复正常生长）；

8.取200μL菌液涂布在LB（Amp 100ng/ml，阿拉伯糖4mg/ml）培养基上，37℃培养过夜。

3.3扩大培养

1.取含GFP 质粒的Top 10平板并挑取单克隆（在紫外灯照射下有绿色荧光的菌落）；

2.将挑取的单菌落接种于试管中（含4mL 的LB 液体培养基，100ng/ml 的Amp 和4mg/ml 的阿拉伯糖）37℃，200rpm 振荡培养至对数生长期（约3-4h ）；

3.将上述摇好的菌液，按1:100转接至250mL LB 液中（Amp 工作浓度 100ng/ml ，阿拉伯糖工作浓度2mg/ml ），37℃，200rpm 培养过夜。 3.4细胞破碎

1.将培养好的细菌3000g 离心10min ，紫外灯观察弃上清，沉淀用液氮冻融；

2.用30mL Lysis Buffer (50mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA )悬浮沉淀；

3.向悬浮液中加15mg 溶菌酶，混匀后室温溶解10min ；

4.400W 功率下，超声处理10min ；

5.将破碎液9000g 离心15min ，紫外灯观察，留上清备用；

6.选取合适的浓度破碎(NH 4)2SO 4沉淀GFP ；一般(NH 4)2SO 4饱和度为30%时，杂蛋白的沉淀量最大，饱和度达到70%时GFP 沉淀量达最大附：(NH 4)2SO 4浓度与含量表，体积为10ml ；

7.向上清中加5.28g (NH 4)2SO 4，充分溶解，室温放置20min ，9000rpm

(NH 4)2SO 4饱和度

10% 20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

(NH 4)2SO 4（g ） 0.56

1.14 1.76

2.43

3.13 3.9

4.72

5.61

6.62