《环境生物学及现代生物技术实验》教案

实验六、植物种群自疏的内因和外因效应一、目的通过阅读文献材料，学习验证型实验设计、结果表达和分析的方法。

掌握通过测定不同栽培密度和不同盐度的因子作用下，影响植物种群生长自疏效应的内因和外因的表达方式和强度。

二、原理生态系统的结构与功能受到来自系统内部和外部的调节与控制，如森林植被过密时会产生自疏作用，间伐后的疏林会很快重新郁闭；生态系统中各营养级间生物的数量关系常常相对稳定等。

这类受控的稳态是生态系统借助生物与环境的相互作用，达到稳态的作用结果。

种群在一定的生境条件下，种群数量会增长，但是并不是无限制的增长，会受到种群最大容量的制约，种群内部个体间的竞争会产生自疏作用使种群维持在一定的水平。

自疏作用为种内斗争和资源供给状况的综合反映，森林植物、藤壶等是自疏效应的明显例子。

本实验将开展经济作物红麻（Kenaf，Hibiscus cannabinus）的模拟栽培试验。

通过设定不同栽培密度，对其进行短时间的栽培试验记录，评价种群密度（内因）对种群自疏效应的影响。

三、材料与仪器：实验材料：实验室将提供统一购置的红麻种子。

种植所需土壤在校区内采集。

仪器：塑料盆4个/组、电子天平、烘箱、标签纸、记号笔等。

试剂：海盐。

四、实验内容4.1 试验设计每个组自行设定不同的幼苗种植株行距处理3组，进行栽培和浇灌。

4.2 观察记录八周内，每周固定时间对每盆内的作物幼苗进行观察，记录每棵植株的叶片数，以及每个处理的存活株数，每次每个处理需拍照记录1张。

4.3 生物量的测定第八周将所有植株个体收获，小心地洗净，去除叶片、根上的砂粒泥土，放入烘箱烘干24h后，分成地上部和根部，进行称重。

4.4 分析数据，撰写报告记录描述不同时间、不同处理的作物幼苗个体叶片数、存活率，以及八周内的生物量积累情况。

实验七、环境污染对植物生长的影响一、目的通过阅读文献材料，学习研究型实验设计、结果表达和分析的方法。

掌握通过记录和测定植物的生理和生长情况，如存活率、形态特征、生理指标，评价环境问题（以咸潮为例）对生态系统生物个体的影响。

二、原理河口区域生境中，水分作为最重要的环境因子之一，影响着植物在该区域的生长和分布。

近年来各种环境退化状况日益突出，其中凤眼莲(Eichhornia crassipes)（又名水浮莲、水葫芦）对内陆水体的生态入侵，以及河口区域咸潮频发等是环境退化的问题之一。

种群数量庞大的凤眼莲在通过河道输送至入海口的过程中会逐渐腐烂和分解，这是因为自淡水至盐水区域，水体的盐度逐渐增加的缘故。

此外，伴随着海平面上升的全球变化问题，生长在三角洲区域的生物受到了一定的影响。

河口区域水体的盐度是影响植物生长和分布的主要因素。

随着水体以及土壤可溶性盐分的增加，土壤溶液和水体的渗透压亦随之下降，当超出植物细胞膜的承受范围，细胞内的溶液即会流向水势更低的高浓度溶液，最后细胞脱水死亡。

此时，植物细胞的主要渗出液大部分来自于液泡。

本实验将模拟珠江口水域不同水体的盐度对凤眼莲进行短期栽培试验，通过观察凤眼莲的生长和存活状况，并测定试验溶液中电导率的增加程度，即可评价不同盐分浓度处理对凤眼莲入侵扩散的影响程度。

三、材料与仪器实验材料：同学们自行前往实验中心周边的河道（如格致园马路对面校车候车站旁）捞取生长正常、长势和形态一致的凤眼莲1。

于试验课2天前打捞冲洗，备用。

仪器：塑料盆（桶）4个/组、电导率仪、真空泵、打孔器、电炉、水浴锅、1水边作业，切记注意安全！直尺、盐度计、比色管（25 mL）、烧杯、标签纸、记号笔等。

试剂：去离子水，海盐。

四、实验步骤4.1 试验设计根据表1的5个测站盐度值等级，每组设计3个盐度梯度和1个对照梯度的试验体系。

表1 1998年珠江口地区五个站位海域的水体盐度站位丰水期平水期枯水期T1龙穴岛0.101 5.375 10.459T2内伶仃岛 6.279 22.819 27.668T3大濠岛23.338 29.782 30.847T4三角山岛16.474 24.356 26.861T5大铲岛 5.488 24.271 28.918注：数据源自贾后磊, 谢健, 吴桑云, 何桂芳. 近年来珠江口盐度时空变化特征. 海洋湖沼通报, 2011, (2), 142-146.洗净凤眼莲植株，去掉枯死的叶片和分枝，并对同一水桶内的3株重复处理植株作标记（注意标记中途不得脱落，否则试验视为失败）。

4.2 观察记录一周内，每天对凤眼莲植株的生长状况进行观察，包括叶片数量、死亡率等，每天每个处理需拍照记录1张。

每天按照各组设定的盐度梯度值，对凤眼莲进行浇灌。

4.3 细胞膜透性的测试取样与浸泡：取新鲜叶片用自来水冲洗后再用蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸净表面水分。

避开主脉用直径0.5cm 的打孔器（切口洁净）打取小圆片十片放入25 mL比色管内，定容到25 mL，将所有样品放入真空干燥器中，反复抽气放气2~4次后，真空渗入10 min，再浸泡10 min。

测定电导值：在测定前先将各管浸泡液震荡摇匀，后用DDS-11A型电导仪测定其电导值（浸泡液电导率值）。

然后沸水浴加热10 min，冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导（煮沸后电导率值），重复三次。

相对电导率计算公式为：4.4 分析数据，撰写报告记录描述不同时间、不同处理的凤眼莲植株叶色状况，统计各处理组的叶片数、死亡率、相对电导率。

实验八、环境因子对水生生物的生理及分布范围影响一、目的通过阅读文献材料，学习研究型实验设计、结果表达和分析的方法。

掌握通过测定腹足类软体动物的活动和生理状况，包括存活率、体内代谢产物含量，评价酸污染对水生动物的影响。

二、原理酸雨(acid rain)是指PH值小于5.6的雨雪或其他形式的降水。

一般认为：年均降水pH高于5.65，酸雨率是0~20%，为非酸雨区；pH在5.30~5.60之间，酸雨率是10~40%，为轻酸雨区；pH在5.00~5.30之间，酸雨率是30~60%，为中度酸雨区；pH在4.70~5.00之间，酸雨率是50~80%，为较重酸雨区；pH小于4.70，酸雨率是70~100%，为重酸雨区。

这就是所谓的五级标准。

肝脏是动物体内重要的消化、代谢功能器官之一，并在身体里面扮演着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成角色。

肝脏具有代谢有毒物质、抵抗逆境环境的作用，是动物体健康状况的“晴雨表”，含有多种酶类肝脏是身体内以代谢功能为主的一个器官。

动物在逆境胁迫(stress)条件下，生长及生理活动将受到一定的影响。

在正常的范围内，肝脏可以作为解毒器官，氧化有害物质，协助动物抵抗不良影响；但当逆境环境超出动物承受的阈值范围，个体将逐渐衰竭、死亡，体内抗逆境胁迫的某些代谢产物也会逐渐积累。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）是生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应的终产物，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。

本实验将模拟不同酸污染条件下的水体，进行腹足类软体动物的养殖试验。

通过对其进行短时间的生存、活动、MDA含量进行测定记录，评价水体酸污染程度对水生动物的生理活动影响。

三、材料与仪器：实验材料：实验室将提供从农贸市场购置的田螺(Cipangopaludina sp.)。

同学们需选择发育正常、大小一致、壳体完整无破损的个体。

仪器：透明塑料小型鱼缸4个/组、手术剪、解剖针、小型台钳、电子天平、研钵、洗耳球、移液管（1 mL、5 mL）、容量瓶（500 mL、1 L）、离心管（10 mL）、离心机、水浴锅、pH计、标签纸、记号笔、分光光度计等。

试剂：去离子水，石英砂，浓盐酸（分析纯），氢氧化钠（分析纯）；10%三氯乙酸（分析纯）——称取100 g三氯乙酸溶解于去离子水，定容至1000 mL；0.6%硫代巴比妥酸（TBA，分析纯）——称取3 g硫代巴比妥酸，用10%的三氯乙酸定容至500 mL。

四、实验内容4.1 试验设计根据上述酸雨区的5个划分等级，自行设计酸溶液的pH值，并配制3个pH 值梯度、1个对照浓度的人工海水约1 L置于小型塑料鱼缸内，贴上标签注明组别、时间、试验编号、梯度。

每个鱼缸挑选合适的田螺个体5枚，以试管刷清洁壳体表面的附着物，做好标记以资区别，放置在缸中养殖，一周内请勿投喂食物，并且隔天更换配置好的人工海水。

4.2 观察记录一周内，每天对每只田螺活体进行5 min的观察，记录其存活率，每天每个处理需拍照记录1张。

死亡、完全不活动的个体切记需捞出，标记后后及时存入实验室冰箱0℃条件中冷冻保存，待实验测试当天解冻待测。

4.3 肝脏丙二醛含量的测试取样与研磨：用小型台钳缓慢夹碎螺壳，在内脏团末端取出田螺肝脏，每个处理各个个体混合后合计0.100 g。

加入少量石英砂和2 mL的10%三氯乙酸混合研磨至匀浆，倾倒至离心管中，余下部分用8 mL10%三氯乙酸润洗至离心管。

匀浆以4000 r/min离心10 min，上清液即为丙二醛提取液。

显色反应：取4支干净离心管，其中3支吸取上清液2 mL加入离心管，1支对照管加入纯水2 mL，各加入2 mL的0.6%硫代巴比妥酸，摇匀。

用薄膜、橡皮筋扎紧管口，沸水浴15 min显色。

比色测试：取出后迅速冷却至常温，以4000 r/min离心10 min。

取上清液在波长532 nm、600 nm处比色。

计算：MDA (nmd/g FW) = (A532 – A600) / W × 103.226式中W为组织鲜重（g）。

4.4 分析数据，撰写报告记录描述不同时间、不同处理的田螺个体活动状况，统计各处理组的田螺存活率、肝脏组织MDA含量。