抗人干扰素α2b单克隆抗体制备及初步鉴定

３ பைடு நூலகம்果
图 ２ 细胞株稳 定性分析 （ 下转 第 １ ９ ） ２页
２ １ 年 ７月中 第 ３ 第 ２ 期 ０１ 卷 ０
Ｊ ｙ ｕｌ ２ １ ０１ Ｖｂ ＿ ｌ ３ Ｎｏ ２ ．０
中国中医药咨讯
Ｊ ｕ ｌ ｆ ｉ ａｒ ａ ｉ ｏ ａ Ｃ ｎ， Ａｉ ｎ ｆ ｒ ａｉ ｎ ｏ ｍａ Ｏ ｎ ｌｄｔ ｎ ｌ ｈ ｅ ｅ Ｃｈ ｒ ｒ ｉ ｉ ｓ Ｍｅ ｃ ｅ ｎ ｏ ｍ ｔ ｉ Ｉ ｏ ・１ ９ ・ ２
】 ２ ３
１ 材料
重组人干扰素 ０２ ：哈药生物提供 ； 牛血 清 ，１ ０ 【ｂ 胎 ６ 培养 ４ 基 ， Ｔ Ｈ Ｔ 聚 乙二醇 ： ｉ ａ Ｈ ， Ａ， ｓ 公司 ；鼠源单抗亚类试剂盒 ： 舯 Ｓｕ ｅ Ｂｏ ｃ ；其余生化试剂均 为分析纯 。 ｏｔ ｍ ｉｅ ｈ ｔｈ
潜 阳安神汤 治疗不寐 ５ 例 疗效观察 ６
丰志辉
（ 吉林省 九台市 营城 区社 区卫生服务中心，吉林
●
九台 。１ ０ ０ ３ ５ ０）
【 摘 要 】 目的：观 察潜阳安神 汤治疗不寐的疗效 。方法 ：将 ５ 例不寐 患者 用潜 阳安神汤治疗 。结果 ：治愈 ３ 例 ，好转 ２ ６ ０ １ 例 ，末愈 ５ ，总有效率 ９％。结论 ：潜 阳安神 汤治疗不寐具有明显疗效 ，值得 临床推 广。 例 １
’
率 ９ ％，未发现 明显 药物不 良反应 。 １
４ 典型病 例
王某 ， ４ 岁 ， 男 ８ 患失眠十余年 ， 每晚均服安眠药 ， ２ 近 个 月病 情加重 ，彻夜不 能入睡 ，伴烦躁易 怒、头痛 、头晕、心悸 不宁、大便秘结 ， 经用 中西安神镇静药 皆未收效 ， 期面色不 察 荣 ，精 神委靡 ， 自述苦于不能入睡 ，至夜则 烦躁难忍 ，舌 红少 津 ，苔薄黄 ，脉 弦细 ， 此属肝 。 肾阴虚 ，肝阳亢旺之证 ， 养阴 宜 柔肝 ，潜 阳安神 ，用潜 阳安神汤加龙 胆草 １ ，生军 ５ｇ ０ｇ ，初服 １ ，能入 睡 ３小时左右 ，头痛 ，头晕 ，大便秘结改善 ，上方 Ｏ剂
【 关键词 】 潜阳安神汤；不寐
不寐 亦称失眠或 “ 不得眠… ‘ 卧” 目不 瞑 “ 不得 、“ ，是指经 常不 能获得正 常睡 眠为特征 的一 种病 症 ，随着人们生 活节奏的 加快 ，工作压力加大 。本病 的发 生率呈逐渐上升 的趋 势 ，对患 者造 成极 大 的身心痛苦 。笔者近几年 来采用潜 阳安神汤 加减 ， 治疗 不寐 ５ ，取得满意疗效 ，现报告如下 ： ６例
参考文献
【 国家 中医药管理局 ，中医病症诊断疗效标准 ， １ ｌ 】 南京 ：南京大学 出生
以重组人干扰素 ０２ 白为抗原包被 Ｅ ＩＡ板 ， 【ｂ蛋 ＬＳ 用碳 酸盐 缓 冲液稀释抗原 ，方 阵法 确定蛋 白最佳包被浓度 和阴 阳性血清 的最佳稀 释倍数 ， Ｈ Ｐ 经 Ｒ 标记的 山羊抗 鼠 Ｉ ｇ 用， Ｇ作 邻苯二胺 底 物显色 ，判定 结果 。判定标 准为 阳性血 清孔的 ０ ４值 接近 Ｄ： ９ １ ，阴性血清 Ｏ 值 ＜ ．， ／ ≥２ 。 ． ０ Ｄ ０ ＰＮ ． ２ １ ２３ 细胞融合及筛选 ＿ 抗血 清效价检测于第３ 次免疫后７ 天进行 。取脾 细胞 与Ｓ ２０ ｐ ／ 小 鼠骨髓瘤细胞 ， 常规方法进行融合 ，Ｈ １ 选融 合细胞 ， 按 Ａ筛 采用 有限稀释法对阳性克隆进行筛选 ，达到１０ ０ ％阳性者扩大培 养， 建株保存 。 ２４ 单抗亚类鉴定 ． 按 ＳｕｈｍＢｏ ｃ公 司亚类试剂盒说 明书用 Ｅ ＩＡ ｏ ｔｅ ｉｅｈ ｔ ＬＳ 方法进行 检测 。 ２５ 腹水制备 ． 采用体 内诱 生腹 水 法 ，按常 规方法 制备 腹水 。用 建立 的 Ｅ Ｉ ￣ Ｉ 测定单抗腹水效价 ， ／≥２ 的抗体最大稀释 ＬＳ Ａ Ｊ 方法 以ＰＮ ． Ｉ ０ 度作 为效 价终值 。 ２ 抗 体识别特异性鉴定 ． ６ 用 三株杂交瘤细胞腹水纯 化后 蛋 白做免疫 印迹 ，结果 证实 本试 验所获得 的单抗 均能 与重 组人干扰素 ２ 反应 ，说明筛选 ｂ 得 到的单抗可 以特异性识别人 干扰素 Ｏ２ ，进一 步证 实了所获 ｔｂ 得单抗 的特异性。 ２７ 杂交瘤细胞稳定性分析 ． 对 已获得的 ３株杂交瘤细胞进行 ３ Ｏ次传 代 ， 以免疫 鼠血 清为 阳性 对照 ，以空 白鼠血清为阴性对照 ，收集 细胞 培养上清 液并 测其 效价。
中国中医药咨讯
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Ｊ ｕ ｎ ｌｏｆＣｈｎ ａ ｉ ｏ ａ ｉ ｓ ｅ ｉｉ ｎｏ ｍａｉｎ ｏ ｒ ａ ｉ ａ Ｔｒｄｔ ｎ ｌ Ｃｈｎｅｅ Ｍ ｄ ｃｎｅ Ｉ ｆｒ ｔ ｉ ｏ
２ １年 ７ ０１ 月中
Ｊ ｌ ｕｙ ２ １ ０１
第 ３ 第 ２期 卷 Ｏ
图１ 免疫 印迹分析 １ ：３ ：２ ：人干扰素 仪 ｂ ２ 的纯化蛋 白 ３７细胞 分泌抗体稳定性分析结果 ． 由图 ２ 知 ， 可 杂交瘤细胞株经 ３ 次传代 ， ０ 能持 续并稳定分 泌抗体 。
．
０２ ０ ～ — —～
ｌ ６ １ ５１ １２ ７３ ３ ９ ２１ ８２ ４２ ０次
２ 方法
２１ 动 物 免 疫 ．
按照萨姆布鲁克Ｊ 报道 的方法 ，将重组人 干扰 素 ０ ｂ 等 【 作 ２ 为免疫蛋 白。以 １ ｓ 的浓度 ，对６ 周 龄 巴比西 小鼠进行 ／ Ｌ 只７ 免疫 ，每只接种 １０ Ｌ ０ ，间隔２ 免疫一次 ，共３ ，细胞融合 周 次
于最后一次免疫后７ 天进行 。 ２２ Ｅ ＩＡ 法 的建 立 ． ＬＳ 方
变。
３ 疗效标准 ，根据 《 ． １ 中医病症诊断疗效标准 》 ’ “ 治愈 ：睡眠正常 ，伴 随症状 消失 。好转 ：睡眠时间延长 ， 伴随症状 改善。末愈 ，失眠症状 无改善 。 ３ 治疗结果 ． ２ 本组 ５ ６例不寐患者 ，经过 ２个疗程治疗后 ，治愈 ３ Ｏ例 ， 占 ５． ３６ ％，好 转 ２ 例 ，占 ３ ． １ ７５ ％，末愈 ５例 ，占 ８ ％，总有效 ． ９
Ｖ １３ ｂ ． Ｎｏ． ０ ２
抗人干扰素 Ｑ ｂ 单克 隆抗体 制备及初步鉴 定 ２
王 锐 王延涛 安晓丽 刘 恒 张秀 芹
（ 哈药集团技 术中心 ，黑龙江 哈尔滨 。１ ０ ２ ５ ０ ５）
【 摘 要 】 本研究 以重组人 干扰 素 仅 ｂ 白 疫 巴比西 小鼠 ，采 用淋 巴细胞 杂交瘤技 术 ，获得３ 可稳 定分泌抗人干扰素 ｄ ２蛋 免 株 ２单克 隆抗体的杂 交瘤 细胞株 ， 别命 名为１８ Ｅ ０ Ｅ 。 ＬＳ 鉴 定结果表 明 ， 株单抗的亚型均为Ｉ ｌ ｂ 分 Ｅ 、１ １和４４ Ｅ Ｉ Ａ ３ ，腹水效价都在１． ０以 上 。免疫印迹鉴定结果证 实， 株单抗均可与原核表达 的人干扰素 ２发生特异性反应 。结果表 明 ， ３ ｂ 本研 究成功获得３ 株针对人干扰 素 仅２ 的特异性 杂交瘤 细胞株 。 ｂ 【 关键词 】 重组人 干扰 素 ｏ ｂ 【 ；单抗 ２
减生军 ，又服 ｌ ５剂 ，睡眠恢复 ６ ７小 时 ，诸症消失而愈 。 —
５ 讨 论
不寐是肮脏机能紊乱 ，气血亏 虚，阴阳失调 导致不能 获得 正常睡眠的一种病症 ，不寐 的原 因很 多 ，但 总是 与心脾肝 肾及 阴血 不足有关 ，尤 以肝心 肾三脏关 系密 切 ，笔者在 临床上 观察 到不寐以阴虚 阳亢型居多 ， 针对这一病 机 ， 以平肝潜 阳 ， 故 养 心安神 而立法 ， 证施治 ， 辩 灵活变通 ， 阳安神汤 中的石决明 ， 潜 生龙骨 ，生牡蛎养肝 阴，潜 阳安神 为君 药 ；白芍补益 真阴 ，滋 水涵木 ，凉血生血为 臣药 ，杏仁敛神养 心 ，远志交通 心肾以安 神 ，合欢 花解郁安神 ，夜交藤滋益肝 肾 ， 合阴阳为佐药 ； 交 天 麻 ，钩藤 平肝息风 ，香附为 阴中快气药 ，引血至气分增强诸药 活力 ，兼 能理气解郁 。黄芩清热泻火 ，使肝经之热 ，不致偏亢 ， 共为使 药 ，诸药合用 ，共达平肝潜 阳 ，养心安神之功。药切病 机， 故收效颇 著。
１ 临床 资料
１１ 一般 资料 ． ５ ６例不寐患者均 系 ２０ ０ ５年至今 的门诊病人 ，经西 药治疗 后 ，疗效欠佳并且失 眠时间达 ３个月 以上 ，每 晚睡 眠时间少于 ４小时 ，其 中男 性 ２ １ ，女性 ３ ４ 例 ２例 ，年 龄最小 ２ ８岁 ，最大 ６ ９ 岁 ，平均 年龄 ４ 岁 ， １ 病程 最长 １ 年 ，最短 １ ，临床表现为 ０ 年 人睡 困难 ， 时寐时醒者 ４ 例 ， ７ 彻夜不寐者 ９ ， 中医病症 诊 例 按 断标准分 为 ：肝郁 化火 型 ８例 ，痰热 内扰 型 ４例 ，阴虑 阳亢型 ３ ６例 ，心脾两虚型 ５例 ，心 虚胆 怯型 ３例 。 １ 诊断标准 ：参见 《 ． ２ 中长病症诊断疗效标准 》” 诊： 确 １． ． １轻者不寐 困难或睡而易醒 ， ２ 醒后不寐 连续 ３ 以上 ， 者 周 重 彻夜难眠 。 １ ． 常伴有头痛头晕心悸健忘 ， ．２ ２ 神疲 乏力 ， 心神不宁 ， 多梦等 。 １ － 病症常有饮食不节 ，情志失常 ，劳倦 ，思虑过度 ，病 后 ． ３本 ２ 体虚等病史 。 １． ．４经各 系统实验室检查 ， ２ 未发现有妨碍 睡眠的其他器 质性 病
干扰素分为 Ｉ ＩＮ和 Ⅱ型 ＩＮ 。 型 Ｆ Ｆ 干扰素 ２ ｂ属于 Ｉ 型干 扰素 它具有广谱 抗病毒 、 ， 抗肿瘤 、 抑制细胞增殖 以及提高免 疫功能等作用 。干扰 素与细胞表面受体结合 ，诱导细胞产生多 种抗病毒蛋 白 ， 抑制 病毒在细胞 内繁殖 ，提高免疫功能包括增 强巨噬细胞 的吞 噬功 能 ，增强淋 巴细胞对靶 细胞 的细胞毒性和 天然杀伤性细胞 的功 能 。本 研究采用重组人干扰素 ２ ｂ为免 疫蛋 白 ，制备抗 人干扰 素 ｄ ｂ 单抗并 对其生物 学特性进 行鉴 ２ 定 ，为深入研究人干扰素 ２ 检测试剂盒提供物 质材 料。 ｂ ３１ 间接Ｅ ＩＡ ． ＬＳ 方法结果 将重组人 干扰素 Ｏ２ 原液 ， ｔｂ 分别 以 ８ｔｍ ， ｔ／ｌ２ ｇ ｌ ／ｌ４ ｓ ，］／ ｔ ｇ ￣ｍ ． ｍ ｔ 和 ｌｇ ｌ Ｉ／ 的浓度包被 Ｅ Ｉ 板 ，阳性 和阴性 血清稀释倍数为 ．ｍ Ｌ ＬＳ Ａ １１０ ： ０ ： ０ ，结果显示 ，抗原浓度在 ４ ／ ｉ ： 、１ ０ 、１ ０ ０ ０ ５ １ ｇｍ ，血清稀 释倍数 为 １１０ ／０ ０时 ，ＰＮ≥２１ ／ ．。 ３２ 杂交瘤细胞的融合率 ． 本试验 经过 ３ 次细胞 融合 ，细胞的融合率达到 了 ８． ％， ７５ ６ 阳性孔率为 ０３ ． ％。 ３３ 细胞 株的建立 － 细胞融合后 ，判定 为阳性 的杂交瘤细胞经 ３次 克隆筛选 ， 获得 ３ 株能够稳定分 泌抗人 干扰素 ２ 单抗细胞株 ， 别命 名 ｂ 分 为 １ ８ Ｅ１ ４ ４ Ｅ 、１ ０和 Ｅ 。 ３４ 单抗 亚类 鉴定 ． 经单克 隆抗体亚类鉴定试 剂盒 检测 ， 所获 ３ 株杂交瘤细胞 ， 均 为 ＩＧ 型 ，且都是 Ｋ轻链抗体 。 ｇ１ ３５ 单抗腹水效价测定 ． 经鉴定表 明 ３ 株单抗 １ ８ Ｅ ０ ４ ４ Ｅ 、１ ｌ 和 Ｅ 腹水 的间接 Ｅ ＳＡ Ｌ Ｉ 效价都在 １ 。 ３６ 单抗 特异性鉴定 （ １ ． 图 ） 经 Ｓ ＳＰ Ｇ Ｄ — Ａ Ｅ电泳后 ，将转移至硝酸纤维素膜 的蛋 白进 行 单抗孵育 。 果显示 ３株单抗均能特异性的识别人干扰素 ｄ２ 。 结 ｂ