4T-A连接,感讲义受态细胞制备,转化及筛选
感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)
感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。
如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。
一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。
进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。
实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。
试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞实验报告]
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效价：指能用 1ug 的标准质粒能够转化出的菌落数。
再放到恒温振荡箱 60min
具体步骤
四．试验结果
化学效价检测
化学检测结果 菌数 4*10^7
.把感受细胞从超低温冰箱中拿出(冰水先预备好再拿出感受态细胞在
电转化检测结果 菌数 10^9
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五．试验分析
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表，经 42
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前培育
C2+处理的感受态细胞，其转化率一般能到达 5×106~2×107 转化子
将单菌落接种到 10ml 的培育液中，在恒温振荡器 37°下过夜培育
/ug 质粒 DN，可以满足一般的基因克隆试验。如在 C2+的基础上，联合其
水洗 3 加 10ml 水 离心 水倒掉
(50Ul~100Ul 若这里不能长到 10^6 则不行用)
4)XX 油 10%洗 2 次〔每次加 5ml〕中间离心两次 在第二次加 XX 油悬
电转化效价
浮后离心后加 120uLGYT 悬浮液
取 Pug19uL 加入感受态细胞再将此移到电击杯
5) 一个人预备 4 个小管子〔每个 40uL 扔到液氮速冻 放到-70℃
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感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞 实验报告]
也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出如今对数生长期，新颖幼 嫩的细胞是制备感受态细胞和进行胜利转化的关键。
制备出的感受态细胞临时不用时，可加入占总体积 15%的无菌 XX 油
重组 DN 分子体外构建完成后，必需导入特定的宿主〔受体〕细胞，使
感受态的制备与抗药性筛选
筛选阳性克隆的策略
转化后→平板筛选1→克隆扩增,提质粒→ →PCR 鉴定→质粒双酶切鉴定2→重组质粒序列分析 3→重组蛋白鉴定4
筛选阳性克隆的方法
1. 平板筛选：针对遗传表型改变的筛选方法 插入失活双抗生素对照筛选 插入表达筛选 -半乳糖苷酶系统筛选（-互补）
（-半乳糖苷酶能将X-gal转变为不溶性的深 蓝沉淀）
充分弃上清，沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 300l，重悬菌体，冰浴30min
40C，5000rpm×10min 弃上清，将管倒置于滤纸上1min （沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 120l，重
悬菌体，加入9 L DMSO，混匀 -80℃保存)
每管加入质粒5 l 轻轻旋转试管，混匀混合物，在冰浴上放置15min 试管放入预加温至42℃的循环水中，放置90s，不要摇动试管 迅速将试管转移到冰浴，冷却1~2min
感受态：宿主细胞处于容易吸收外源性DNA的 状态，处于感受态的细胞称为感受态细胞
制备感受态细胞和转化的常用方法
CaC l2转化法：传统方法；转化效率能达到 5106~2107转化子/g质粒DNA；简单、快速、重复 性好；菌株适用范围广。
CaCl2 /MnCl2法： 能提高转化的效率，但是降低了菌 株的适用范围，主要用于DH1、DH5、MM294等。
在转化体系中的DNA形成的抗DNase的羟基-钙磷酸复 合物能粘附于细菌表面，经过42℃短时间热冲击处理， 促进感受态细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生 长1小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子中的基 因在转化细菌中得到表达，在选择性培养基平板上即 可筛选出所需的转化子。
重组DNA转化及筛选实验操作
取出试管后，每管加入LB培养基800l， 置于37℃摇床（100~150r/min），温和震荡45min 将200l菌液铺于含Amp的琼脂平板表面 室温放置20min，正置平板使液体被吸收 倒置平皿，37℃培养，12小时可见菌落生长
感受态细胞的制备及转运
一、实验名称：感受态细胞的制备及转化二、实验原理：1.感受态细胞概念：所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体细胞的遗传性状所决定的，同时也受体细胞年龄、外界环境因子的影响。
受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
与此同时，要求感受态细胞不能具有载体的筛选基因，方便之后对产物的鉴定。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
2.转化：重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受态有着很大的关系。
在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.化学制备法制备感受态细胞（CaCl2法）：大肠杆菌的转化常用CaCl2法。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
实验四.感受态细胞的制备、转化及转化子的筛选
3. 取1.5ml的上述菌液转入1.5ml灭菌离心管中，在冰 上冷却30min，于4℃ 4000 rmp离心10min；（从 这一步起，之后所有操作均应在冰上进行，速度 尽量快而稳） 4. 倒净上清液，用1ml冰冷的0.1M CaCl2溶液轻轻悬 浮细胞（可以用枪头来回吹打，不用剧烈），冰 浴， 4℃ 4000 rmp离心10min；
LB液体培养基： Tryptone 10g Yeast Extract 5g NaCl 10g 加去离子水1L，用NaOH调PH值至7.0，高温高压灭菌后 4℃保存。（如制作固体培养基，应加Agar 15g/L）
三、实验步骤
CaCl2制备感受态细胞
1. 从新活化的大肠杆菌TG1平板上挑取一单菌落，接 种于3-5ml的LB液体培养液中，37℃振荡培养12h； 2. 将上述培养液以1:50-1:100转接于100ml LB液体培 养基中， 37℃振荡扩大培养，1-1.5h后测OD的DNA分子加到100µl的感受态细胞中， 冰上放置30min； 2. 42℃加热45s后，立即放在冰中1min； 3. 然后加入到1ml的LB液体培养基中，37℃振荡培 养1h； 4. 取上述培养液50µl涂在含有Amp的LB固体培养基 表面进行筛选。 5. 12h后观察LB固体培养基平板长菌情况。
5. 弃去上清液，加入500µl冰冷的0.1M CaCl2溶液， 小心悬浮（方法同上）。冰浴， 4℃ 4000 rmp离 心10min；
6.弃去上清液，加入100µl含15%甘油的冰冷的0.1M CaCl2溶液，小心悬浮（方法同上），冰上放置片 刻后，即成感受态细胞。 （感受态细胞在-70℃下可保存半年至一年）
四、实验结果与思考题 拍照转化子的筛选情况，并分析结果。
实验四：感受态细胞的制备、转化 及转化子的筛选
〖医学〗感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
式”近代发展起来的西医，20世纪西 医又发 展到“ 社会-心 理-生 物医学 ”或综 合医学 模式， 后基因 组时代 系统生 物学的 兴起， 形成了 系统医 学在全 球的迅 速发展 ，成为 继传统 医学、 西医学 之后中 、西医 学汇通 的未来 医学。 当代中 国医学 类专业 比较优 秀的学 校有北 京大学 、华中 科技大 学、郑 州大学 等学校 。
中医即中国传统医药学，是形成于 数千年 前的中 国，是 建立在 人们与 疾病长 期斗争 的经验 总结。 习樟恕 ９食鱿 治饕蕉 灾瘟撇 涣说募 膊≈
至于循证医学、比较医学、后现代医 学、行 为医学 等所谓 “医学 ”，都 称不上 一门独 立的医 学科学 ，关于 这一点 在灵魂 医学有 关章节 中将有 相关点 评。
(一)CaCl2 转化法 核心:目标细胞在 CaCl2·H2O 溶液中浸泡一段时间, 转化效率 107-109 cell/ gD 。
NE.coli: DH5 , TG1, XL-1Blue, JM105
(1)冰上 30min (2)热激 42℃ 90“ (3)恢复 1～2min (4)复苏 37℃ 45-60 min (二)原生质体转化法(protoplast) 适用于 G+ 细菌,特别是芽胞杆菌、酶母。 过程: (1)等渗环境下,脱细胞壁(Lysozyme) (2)细胞壁再生 (三)电转化法(electroporation) 缓冲液:10﹪ 甘油或蔗糖,含(或不含) Mg2+ 离子。 转化条件:2.5 KV/0.2cm 25 F 200-400 。
感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
一、实验原理
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞, 使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分 子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
感受态细胞的制备及大肠埃希菌转化图文
酶切处理
使用限制性内切酶对质粒进行酶切， 使其具有黏性末端，便于与外源 DNA连接。
纯化质粒
通过凝胶电泳和回收试剂盒对酶切 后的质粒进行纯化，去除杂质。
转化过程
制备感受态细胞
通过化学或电击法将大肠埃希菌的细 胞壁进行预处理，使其处于易于接受 外源DNA的状态。
加入质粒
离心和涂布培养
将转化后的细胞离心收集，涂布在含 有抗生素的选择性培养基上，筛选成 功转化的克隆。
实验原理
感受态细胞制备原理
通过物理或化学方法降低细菌的细胞 壁通透性，使其能够吸收外源DNA 。
大肠埃希菌转化原理
外源DNA与感受态细胞结合，通过细 胞壁的渗透作用进入细胞内，并在细 胞内进行复制和表达。
02
感受态细胞的制备
细菌培养
01
02
03
菌种选择
选择对数生长期的细菌作 为感受态细胞制备的起始 菌种，以保证较高的转化 效率。
CaCl2处理法
CaCl2处理
在细菌培养物中加入适量的CaCl2，使细菌细胞壁产生可逆性损伤，提高感受态细 胞的转化效率。
低渗溶液
将CaCl2处理后的细菌细胞洗涤在低渗溶液中，使细胞壁进一步损伤，提高感受 态细胞的转化效率。
03
大肠埃希菌的转化
准备质粒
提取质粒
从宿主菌中提取出质粒DNA，通 常使用质粒提取试剂盒进行操作。
高转化效率是实现高效基因工程操作的关键因素 之一，因此对转化效率的测定具有重要的实际意 义。
05
结果与讨论
实验结果
成功制备感受态细胞
通过电击法成功制备了感受态细胞，细胞形态无明显变化，生长 状态良好。
大肠埃希菌转化效率高
将外源DNA导入感受态细胞后，成功获得了高转化效率的大肠埃 希菌。
（整理）感受态细胞的制备和重组质粒的转化
（整理）感受态细胞的制备和重组质粒的转化1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
【实验原理】质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA 的细胞称为转化子。
在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。
质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。
转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。
细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competent cell）。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。
用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。
对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。
这种转化方法称为“化学法”。
目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。
电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子/μg DNA，甚至1 x 109转化子/μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。
微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。
【试剂与器材】〈一〉试剂1．LB液体培养基: 参见附录每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
实验4.T-A连接,感受态细胞制备,转化及筛选
4） 取1ml 菌液，冰浴5min，6000rpm离心5 min（收集菌 体） ；
5）弃上清，加入100μl冰冷的100mmol/L CaCl2溶液， 充分悬浮细胞，冰浴5分钟；
6）6000rpm离心5min； 7）弃上清，加入100μl冰冷的100mmol/L CaCl2溶液，
充分悬浮细胞； 8）将制备好的感受态细胞置于冰上待用。
午休
4） 6,000rpm离心10秒钟（收集菌体沉淀）；
5）吸弃800l上清，用剩余的200lLB培养液重悬菌体；
6）将菌液均匀涂于含有氨基苄青霉素的LB琼脂培养板 上 ， 室 温 放 置 5 - 1 0 min 待 菌 液 完 全 吸 收 后 ， 倒 置 于 37℃孵箱中培养14-16小时。
注意：转化后的平皿倒置放于孵箱 （防止水蒸气形成的水滴影响细菌单
实验内容
1. PCR产物与T载体的连接 2. 感受态细胞的制备，连接产物的转化及筛选
实验1、PCR产物与T载体的连接
1. 连接反应
T vector
1 μl
10×ligation buffer
1 μl
PCR回收产物
7 μl
T4 DNA Ligase
1 μl
轻弹管底混合，离心机甩一下，置25oC水浴1h。 连接产物可直接用于转化，也可置-20oC保存备用。
如果反复冻融会使细胞活力受影响，而且细胞膜 的变化可能复原，由感受态细胞状态回转到普通细 胞状态，失去接受外源DNA的能力。
2）无菌操作。 在火焰附近操作，火焰附近是无菌区。 各种器具均需消毒。
无菌操作的注意事项
（超净台内操作）
• 枪头、EP管、试管、平皿等，各种试剂都是经过高压灭 菌后在超净台中专用的，但加样器需要自带。
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电穿孔转化法、脂质体法、胞核的显微注射法；
磷酸钙介导的转染、聚乙二醇介导的原生体转化法；
Biochemistry
3、 CaC l2法制备感受态细胞和转化的原理
一般受体菌对重组 DNA 分子的摄取能力很低，难以转化成功。当细 菌处于冰冷（0℃）0. 05~0.1M的 CaCl2低渗溶液中，菌体的细胞 膨胀成球形，细胞膜的通透性增加，对DNA的摄取能力增强，转 化效率提高（感受态细菌）。 同时在转化体系中的DNA 形成的抗 DNase 的羟基 -钙磷酸复合物能粘 附于细菌表面，经过42℃短时间热冲击处理，促进感受态细胞吸 收DNA复合物，在丰富培养基上生长1小时后，球状细胞复原并分 裂增殖，重组子中的基因在转化细菌中得到表达，在选择性培养 基平板上即可筛选出所需的转化子。
热激的温度（42℃）及热激时间（0~90s） 质粒分子量大小的影响 质粒在大约4~7.3kb时，转化效率基本一致（10.3kb，50% 左右；17.6kb，15%）；大分子量时可以用DNA解旋酶。 其他影响因素 一般不使用玻璃管；培养基的选择。
Biochemistry
重组体的筛选 1. 直接选择法
Biochemistry
重组DNA导入受体菌
受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection)
感染 (infection)
Biochemistry
1.影响感受态细胞制备和转化的因素
细菌生长条件的影响（直接接种、细菌密度） 转化缓冲体系的影响 pH（4~8，6.5）；
转化子/g质粒DNA；简单、快速、重复性好；菌株适用范围广。
CaCl2 /MnCl2法： 能提高转化的效率，但是降低了菌株的适
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
专业技能训练（分子生物学部分）实验一大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。
转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。
1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。
一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip 头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
本实验以E. coli JM 109菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
感受态细胞的制备、转化及重组质粒的筛选
蓝白斑筛选则能在转化子的基础上区分空载体和连
接成功的载体（连接上SOD基因的pUC18载体）。
细菌染色体
含有lacZ基因C端序列
β-半乳糖苷酶缺陷型菌株
生成 有活性的 β-半乳糖苷酶
载体
多克隆位点 LacZ’基因
β-半乳糖苷酶启动子
3. 取菌液1.5ml于EP管中，冰上放置5-10 min；4℃， 4000 rpm离心4 min，去上清，收集菌体。（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）
4. 用500μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞， 冰浴5-10 min。
5. 4℃，4000 rpm离心4 min，弃去上清液，加入50 μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液，加入10 μl重组质粒 DNA溶液，轻轻混匀，小心悬浮细胞后置于冰上2530min。
激活 IPTG
非代谢性的乳糖启动子诱导剂
含有X-gal和IPTG的培养基
细菌染色体
含有lacZ基因C端序列
β-半乳糖苷酶缺陷型菌株
插入片段到多克隆位点 lacZ‘基因被破坏
载体
无法生成 有活性的 β-半乳糖苷酶
含有X-gal和IPTG的培养基
操作步骤
1. 从LB平板上挑取新活化的E.coli单菌落。接种于
4. 用500μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液轻轻悬浮细 胞，冰浴10 min。
5. 4℃，4000 rpm离心4 min，弃去上清液，加入 50 μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液，加入10 μl重组质 粒DNA溶液，轻轻混匀，小心悬浮细胞后置于冰上 25-30min。
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谢
谢
观
如果反复冻融会使细胞活力受影响，而且细胞膜 的变化可能复原，由感受态细胞状态回转到普通细 胞状态，失去接受外源DNA的能力。
2）无菌操作。 在火焰附近操作，火焰附近是无菌区。 各种器具均需消毒。
无菌操作的注意事项
（超净台内操作）
• 枪头、EP管、试管、平皿等，各种试剂都是经过高压灭 菌后在超净台中专用的，但加样器需要自带。
（上述1－3步骤已经由实验室完成）
水浴摇床
4） 取1ml 菌液冰浴5min，然后6000rpm，离心5 min ，收集菌体。
5）弃上清，除净剩余液体，然后加入100ul 冰冷的 100mmol/L CaCl2 致敏液悬浮细胞，冰浴5分钟。 6）6000rpm，离心5分钟，回收细胞，弃上清，加 入100ul冰冷100 mmol/L CaCl2溶液，悬浮细胞。 7）4oC可保存1-2周；长期保存， 可加甘油至终浓
转化入细胞后，细胞内的酶会将缺乏的磷酸基团加上，再 形成磷酸二酯键。
实验二、感受态细胞的制备及转化
1. 感受态细胞制备原理
培养至对数生长期的大肠杆菌在低渗 CaCl2 存 在的情况下，细菌变得膨胀而易于外源基因的导入。
另外，钙离子溶液处理的细胞对外源DNA的摄 取能力增强。
2.注意事项：
1）感受态细胞的膜已经很脆，应该超低温保存。
4） 6,000rpm，离心10秒钟，倒掉上清，用剩余的约 200l LB培养液重悬菌体。
5）将残存菌液轻轻混匀， 铺于含有氨基苄青霉素的 LB琼脂培养板上涂匀，室温放置5-10min，倒置于
37℃孵箱中培养14-16小时。
注意事项：转化后的平皿面朝下 放置： 防止水蒸气形成的水滴影 响细菌单菌落的形成。
用时要打开风机，。 • 操作前要用酒精擦拭手臂或带手套。
无菌超净工作台
3. 感受态细胞的制备过程
1） 将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线，37oC1216小时。 2） 次日从琼脂平板上取一单菌落于2ml LB培养 基中，37oC，225rpm速度震荡培养12-16小时。
3） 取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中， 37oC， 225rpm的速度震荡培养直至OD值为0.5 左右(约3小时)。
• 取饭盒中的枪头、EP管时，都要用在酒精灯上烧灼后的 镊子夹取。
• 烧瓶、试管、玻璃棒等玻璃器具，使用前和盖盖儿前要 在酒精灯上烧灼一下瓶口。
• 塑料制品，如枪头和EP管不能用酒精灯烧灼。 • 手臂尽量不要在敞开的容器上方移动，以免落入杂菌。 • 超净台事先要打开紫外灯照射至少20 min进行消毒，使
其他说明：
1） 连接反应的关键是目的基因片段与载体的比例，一般片 段与载体比例为2:1 或3:1（摩尔比），根据片段大小决定比 例。
2）平端连接
平端连接通常需要先将载体的5端磷酸去掉，然后再进行 连接，这样可以防止载体的自身环化。
当载体的5端磷酸去掉后，片段与载体的连接就会留下一 个缺口，连接酶由于载体5端缺乏磷酸而无法形成磷酸二酯 键，
。
2. TA克隆原理
TagDNA 聚合酶的一个功能： 使PCR产物的3`端突出一个A。
5`
A 3`
3` A
5`
商业设计的T载体：在3`端多出一个T。
5
T 3`
3``
5`
T
两者的粘性末端可以互补配对。
应用时避免反复冻融，防止T的断裂丢失。如果与T载体连接 后主要以自身环化为主，要考虑T可能已经丢失。
4T-A连接,感受态细胞制备,转化及筛选
精品jing
易水寒江雪敬奉
实验一、PCR产物与T载体的连接
1. 连接反应
T vector
1 μl
10×ligation buffer
1 μl
PCR回收产物
7 μl
T4 DNA Ligase
1 μl
轻弹管底混合，离心机甩一下，置25oC水浴1~2h。 连接产物可以直接用于转化，也可以置-20oC保存备用。 （低温连接效果比室温好）
度为15%，置-70oC备用。
注意：（无菌操作）
连接产物的转化
1. 转化的实验步骤 1）将200l感受态细胞置冰上融化，然后加入3l DMSO, 混合后，加入10l连接反应液(含重组质粒),
温和混匀，置冰上10分钟。
(目的：防止细胞被胀破。)
2）42oC，45秒，然后迅速放回冰中1-2分钟。
3）加入1 ml LB培养液， 37oC，225rpm摇荡培 养30min。