高效感受态细胞的制备
高效制备感受态
在科研实验中，为了获得纯的重组质粒DNA，需要允许外源DNA分子进入的细胞。
经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞。
基本制备步骤1.从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3.于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5.每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6.于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
8.每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。
9.此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。
洁净是最重要的~无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。
离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。
涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复。
轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。
涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
预冷是必要的。
整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。
制备感受态细胞的实验报告
制备感受态细胞的实验报告一、实验目的掌握制备化学感受态细胞和电转化感受态细胞的方法和步骤。
二、实验原理1.感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP 可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
化学制备法：大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理1. 什么是感受态细胞1.1 定义感受态细胞，听起来像是个高大上的名词，其实就是那些“准备好”接受外界信息和刺激的细胞。
想象一下，像个随时待命的服务员，时刻准备接待客人。
细胞的这种状态，通常是在特定的环境下，通过某些方法处理后形成的。
1.2 重要性为什么要制备感受态细胞呢？这可是生物实验中的关键一步！它们能帮助我们进行基因转化、疫苗研究，甚至是药物开发。
就像一个关键的道具，缺了它，很多实验都没法顺利进行。
2. 如何制备感受态细胞2.1 基本步骤制备感受态细胞的过程其实并不复杂，简单来说就是要让细胞放松心情，准备好接受外来的DNA。
首先，我们需要把细胞放在一个低温环境下，这就像给它们一个凉爽的SPA，让它们变得“懒洋洋”的。
接着，添加一些化学试剂，比如氯化钙，这些化学试剂可以帮助细胞的膜变得更容易接受外来的DNA，哇，真是神奇！2.2 处理时间然后，细胞要在这个特殊的环境中待一段时间，让它们完全“感受”这个过程。
通常，我们会让它们静置一小时左右，这段时间就像让一个小孩在游乐场里玩耍，兴奋而又期待。
当时间到了，嘿！细胞已经准备好迎接挑战了。
3. 实际应用3.1 科研领域在科研领域，感受态细胞的应用真是无处不在。
比如，科学家们可以将新的基因片段导入这些细胞中，看看它们会发生什么样的变化。
就像给一个平凡的角色增加超能力，结果往往出乎意料，有时候能发现新的疾病机制，有时候能找到新的治疗方法，简直就是科研的“黑科技”！3.2 工业应用当然，感受态细胞的应用不仅限于实验室，它们在工业上也大显身手。
比如，利用这些细胞生产蛋白质，甚至是药物，提升生产效率，降低成本，简直是企业的“秘密武器”。
有了它，企业就能在竞争中抢占先机，像个抢眼的明星一样脱颖而出。
总之，感受态细胞的制备虽然听起来复杂，但只要掌握了窍门，便能游刃有余。
它不仅是生物学研究的基础，更是现代科技进步的重要推动力。
就像一首动听的乐曲，细胞的“感受态”是其中不可或缺的音符。
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞的制备是一项非常重要的实验技术，可应用于许多研究领域，如分子生物学、农药毒理学、农业植物保护等。
一般来说，将培养细胞转化为感受态细胞，可以有三种方法：
1、皮下注射引起的感受态细胞制备。
由于它是一种经典的制备方法，大多数细胞都可以使用。
其核心步骤是将小量液体注入传感源头(如病毒、菌株、多糖、细菌等)皮下。
这种技术可以帮助人们制备特定种类的感受态细胞，并且可以控制病毒的感染率。
2、利用细胞克隆引起的感受态细胞制备。
这种方法涉及到使用不同种类的细菌或病毒及其克隆进行感染。
一旦细胞受感染，感受态细胞就会形成。
此外，通过诱变基因表达等方式，也可以制备出不同感受源的感受态细胞。
3、利用小分子引起的感受态细胞制备。
小分子技术中的最新研究主要集中在核酸抑制剂、蛋白质结合蛋白、信号转导调节剂等。
这些小分子可以直接结合到感受细胞的特定分子，从而影响其功能，抑制或促进感受细胞的形成。
以上是三种感受态细胞制备的方法，它们均可用于解析某一特定基因或基因产物在细胞功能中的作用。
此外，这些技术还可用于识别及检测特定感受源，并评价其对细胞株功能的影响程度。
另外，它们还可用于发现新型抗病毒剂，以提高植物抗病能力。
因此，感受态细胞的制备实验在诸多方面都具有重要的意义，值得继续探索。
高效感受态细胞的制备
感受态细胞的制备一、实验原理受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。
本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。
二、材料及准备工作一）材料准备二)试剂配制1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用）蛋白胨 2.0g酵母提取物 1.0g氯化钠（NaCl） 2.0g2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌）蛋白胨2×1.0g酵母提取物2×0.5g氯化钠（NaCl）2×1.0g琼脂粉2×1.5g温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。
4℃保存备用。
3、TSS液（100ml）（有效期2周）聚乙二醇（PEG8000）10g 终浓度10%DMSO 5ml 终浓度5%MgCl2(1mol/L）5ml 终浓度50mmol/LLB 85ml 终浓度85%去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用注：聚乙二醇分子量可以为3000-80004、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用）KCl（2mol/L） 2.5mlCaCl2(1mol/L) 1.5mlMgCl2(1mol/L) 2.5ml水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒）5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml）取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃保存备用三）仪器设备1、低温大容量离心机2、恒温水浴锅3、超净台4、高压锅5、37℃孵育箱6、恒温摇床7、制冰机8、分光光度计9、微量移液枪10、低温冰箱三、步骤及注意事项一）感受态制备（TSS法）1、取菌种，划LB平皿板（无氨苄）；2、挑取分离良好的独立克隆，接种到5ml LB 中，220rpm ，37℃恒温摇床孵育过夜；3、取1 ml摇好的菌液，接种到100 ml LB 中（500ml锥形烧瓶），220rpm ，37℃孵育2.5-3.0h，菌液OD600达到0.2-0.5（0.36效果较好，不要超过0.6）；4、取出菌液，冰浴20min；然后4℃，3000 rpm离心5 min ，收集细菌；5、用10 ml 冰浴预冷的TSS液重悬细菌，然后4℃，3000 rpm离心5 min；再用冰浴预冷的TSS液重悬细菌，即成感受态；6、用1.5 ml离心管按150μl分装；-80℃长时间保存。
感受态细胞制备实验报告
感受态细胞制备实验报告摘要本实验旨在探究感受态细胞的制备方法。
通过一系列步骤，我们成功地制备出感受态细胞，并通过染色实验证实了细胞的感受态转变。
实验结果表明，我们所采用的制备方法具有较高的可行性和有效性。
介绍感受态细胞是一种具有感受外界刺激并做出相应反应的细胞。
在生物学研究中，制备感受态细胞是一项重要的实验工作。
本文将详细介绍感受态细胞的制备方法，并通过实验证实其有效性。
实验材料和方法材料•细胞培养基•细胞培养器具（培养皿、离心管等）•细胞培养箱•细胞染色剂方法1.细胞培养基的制备：–将适量的细胞培养基粉末加入无菌蒸馏水中，并充分搅拌溶解。
–调整pH值至合适范围。
–通过过滤器过滤，获得无菌的细胞培养基。
2.细胞的预处理：–选择适宜的细胞系，如人类上皮细胞系。
–将细胞培养在培养皿中，以适宜的温度和湿度进行培养。
–在细胞生长到合适密度时，进行下一步操作。
3.细胞的感受态诱导：–将培养皿中的细胞用无菌PBS缓冲液洗涤一次，以去除培养基中的成分。
–加入含有感受态诱导剂的培养基。
–将培养皿置于细胞培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间。
4.细胞的染色实验：–取出培养皿中的细胞，用PBS缓冲液洗涤去除培养基。
–按照染色剂使用说明，加入合适浓度的染色剂。
–在暗处孵育一定时间，使细胞充分染色。
–用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除多余的染色剂。
–观察细胞染色情况，使用显微镜拍摄图像。
结果与讨论经过以上步骤，我们成功地制备了感受态细胞，并通过染色实验证实了细胞的感受态转变。
观察到染色后的细胞明显显示出感受态特征，与对照组相比，表现出明显的区别。
这说明我们所采用的制备方法具有较高的可行性和有效性。
通过本实验，我们对感受态细胞的制备方法有了更深入的了解。
然而，还需要进一步的研究来探究感受态细胞的特性以及其在生物学研究中的应用。
此外，我们也可以尝试其他方法来制备感受态细胞，以寻求更高效的制备方法。
结论本实验通过一系列步骤成功地制备出了感受态细胞，并通过染色实验证实了细胞的感受态转变。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。
下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。
通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。
感受态细胞制备及各种感受态的特点
感受态细胞制备制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法:1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。
2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。
5。
注意:接种比例不得大于1:１0。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。
4、4℃５000g离心５分钟。
用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟;Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ离心5分钟;6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。
分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。
含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法:称取0。
28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。
感受态细胞得特征感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。
感受态细胞得特征:(1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。
(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。
感受态细胞的制备的实验步骤
CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；3．将菌液迅速置于冰上。
以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟8．弃去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．4℃下3000g冷冻离心5分钟10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11．立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。
附注：影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理
感受态细胞的制备原理是通过刺激细胞或组织，使其产生特定的感受态反应。
下面将介绍两种常见的制备感受态细胞的方法：
1. 免疫刺激法：免疫刺激是一种常见的制备感受态细胞的方法。
它通过注射外源性抗原或感兴趣的抗原到实验动物体内，刺激其免疫系统产生针对该抗原的免疫应答。
随后，从动物体内获得淋巴细胞或单个免疫细胞，并进行分离和培养。
在适当的刺激条件下，这些细胞会分化为感受态细胞，表达特定的受体和效应分子。
2. 细胞诱导法：细胞诱导法是一种将一种细胞类型转化为另一种感受态细胞的方法。
通过适当的生理或外部信号，诱导细胞发生转变，从而获得感受态细胞。
例如，通过改变细胞培养基的成分和配比，或添加特定的生长因子和信号分子，可以使一些细胞从一种特定状态转变为特定的感受态细胞。
而在实现这些方法时，需要注意实验条件的细节，确保刺激物的浓度和持续时间、培养基的组分和条件等都符合特定的要求。
此外，在实验过程中需要使用适当的实验技术和方法对细胞进行监测和鉴定，确保制备得到的是目标感受态细胞。
感受态细胞制备流程
感受态细胞制备流程感受态细胞制备流程，这是一个非常复杂和精确的过程，涉及到许多实验室技术和设备。
感受态细胞是指在特定的刺激下，可以触发细胞产生反应的细胞状态。
感受态细胞的制备可以用于研究许多生物学过程，如细胞信号传导、疾病机制等。
下面是一个常见的感受态细胞制备的流程：1.细胞培养首先，需要准备细胞培养基和细胞培养器皿。
细胞培养基是提供营养物质和条件来维持细胞生长和增殖的液体。
培养器皿选择取决于所使用的细胞类型和实验的要求。
然后，将细胞接种到培养器皿中，并在恒定的温度和湿度下进行培养。
2.细胞处理一旦细胞生长到足够数量，可以开始进行细胞处理。
这可以包括刺激细胞，例如添加化学物质、压力或温度变化。
刺激过程需要精确控制，以确保得到一致的结果。
3.细胞取样在细胞处理后，需要进行细胞取样。
这可以通过用吸管或毛细管吸取细胞悬浮液来实现。
取样过程需要快速和准确，以确保细胞状态的准确性。
4.细胞固定取样后，细胞需要固定以保持其形态和结构。
常用的细胞固定方法包括用甲醛或乙醛等化合物进行固定。
细胞固定可以帮助保留细胞结构和细胞内分子，以便后续的染色或分析。
5.染色和标记对固定的细胞进行染色或标记是感受态细胞制备的关键步骤。
染色和标记可以使用各种荧光染料或抗体来实现。
这可以通过将染料或抗体直接添加到细胞上，或使用转染技术将其引入细胞内。
6.显微镜观察完成染色和标记后，可以使用显微镜来观察细胞。
显微镜观察可以提供关于细胞形态和结构的信息，并且可以检测到染色或标记物的荧光。
这可以帮助研究人员获得有关感受态细胞的更多信息。
7.数据分析和解读最后，需要对得到的数据进行分析和解读。
这可能涉及到图像处理、统计学方法和生物学解释等。
数据分析和解读的目的是从实验结果中提取有意义的信息，并为后续的研究和应用做出贡献。
感受态细胞制备的流程是一个需要仔细和精确操作的过程。
任何一个步骤的错误或偏差都可能导致不准确的结果。
因此，研究人员需要具备高度的实验技能和实验室安全意识。
〖医学〗感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
西医学是最近三四百年来建立在解剖学 、生物 学及现 代科学 技术基 础上、 发展起 来的一 门以“ 解剖人 、肉体 人”为 概念的 、新兴 的现代 医学科 学理论 体系。 主要采 用科学 实验方 法，从 宏观到 微观， 直至目 前的分 子基因 层次水 平，发 展极为 迅速， 超过其 它任何 一门医 学科学 决目
四、注意事项
➢ 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是 最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好 分装保存于干燥的冷暗处。
➢ 4. 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均 应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip 头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试 剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶 或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂 DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要 的麻烦。
四、注意事项
➢ 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是 超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度 在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或 体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使 50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液 的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3、弃去上清,加入200μl预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮 细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
二、 转化 1、取200μl感受态细胞悬液置冰上。 2、加入1-10ulDNA,轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。 3、42℃水浴中热击2min,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 4、向管中加入1ml LB液体培养基,混匀后37℃振荡培养 45min-1小时。 5、将上述菌液摇匀后取200μl 涂布于含Amp的筛选平板上, 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 对照: 另取未转化感受态细胞分别涂布筛选平板(Amp终浓度 50ug/ml)和空白平板
DH10Bac感受态的制备
DH10Bac感受态细胞的制备DH10Bac感受态细胞是用来生产用于真核细胞蛋白表达的重组杆状病毒分子。
高效DH10Bac细胞含有父Bacmid的bMON14272和辅助质粒pMON7124。
父Bacmid的包含一个小型F复制子，卡钠霉素抗性基因，attTn7重组位点和lacZα互补因子。
辅助质粒包含的tnsABCD的区域,提供了转座蛋白，这些转座蛋白可以供体质粒(Donor plasmid)上的小Tn7位点插入到父本Bacmid的重组目的位点。
辅助质粒pMON7124包含有四环素抗性(Tetracycline).DH10Bac感受态细胞本身含有卡那霉素和四环素抗性。
在制作感受态细胞的时候，需要加入这两种抗生素，以防止DH10Bac中的质粒父本杆粒bMON14272（卡那霉素抗性）和辅助质粒pMON7124（四环素抗性）在细胞扩增过程中丢失，提高质粒转化后的基因转座效率。
携带Tn7转座元件的供体质粒pFastBac，含有庆大霉素抗性基因，杆状病毒多角体启动子，一个多克隆位点区域和SV40的poolyadenylation信号。
重组的Bacmid分子通过将多克隆位点包含有基因编码序列的供体质粒pFastBac质粒DH10Bac感受态细胞转化与在编码序列克隆到多个克隆网站（重组成功的质粒在选择性培养基平板上呈现为白色菌落）。
然后可以将重组Bacmid进行挑菌，小量提取分离并且转染到昆虫细胞，从而进行感染重组杆状病毒颗粒生产。
高效DH10Bac感受态细胞的能够有效抵抗连接酶和连接酶缓冲液，同时可以容忍少量未稀释的连接反应。
φ80dlacZDM15标记可以利用Bacmid载体中的β-半乳糖苷酶基因α-互补使用含X-gal平板培养基的蓝白斑菌落筛选。
综上所述，DH10Bac感受态细胞本身含有卡那霉素和四环素抗性，而供体质粒pFastbac含有庆大霉素的抗性，所以在制备DH10Bac感受态细胞时需要在培养时添加卡那霉素和四环素，而在制备杆粒时需要使用卡那霉素，四环素，庆大霉素的三抗平板。
感受态细胞的制备
感受态细胞的制备感受态细胞是研究多种生物学和行为学反应的必不可少的细胞模型，由于生物反应的复杂性和敏感性，感受态细胞的制备是令人头疼的问题。
传统方法中，制备感受态细胞的步骤繁琐复杂，步骤数量多，每个步骤的重复程度高，操作过程耗时，并且受到仪器设备质量的限制，如果仪器设备不足，必须重新安装或更换设备，对软件编程也有一定要求，软件编写错误会影响实验结果，容易导致实验失败，给研究工作带来不必要的损失和延期。
随着现代生物技术的发展，高效的分子转录酶技术已经成为一种有效的制备感受态细胞的方法，它可以以更短的时间内产生有效的感受态细胞，大大缩短制备和实验步骤，消除了传统方法中耗费宝贵时间的步骤，减少了多次重复操作带来的不必要的误差，并且克服了仪器设备质量受限，软件编程也不再是问题，大大提高了实验效率，减少了实验损失和时间损耗。
分子转录酶制备感受态细胞的步骤不复杂，大致可以分为以下几个步骤：1.在细胞培养基中添加分子转录酶，离心收集细胞并置于转染培养箱中；2.将基因构建的DNA粘膜转染到感受态细胞上；3.在细胞中表达感受态基因，加入选择水平，细胞进行增殖；4.从细胞培养基中收集感受态细胞，离心洗涤，收集感受态细胞；5.用荧光显微镜观察感受态细胞的荧光变化，以确定制备过程是否成功。
分子转录酶技术可以有效降低制备感受态细胞的成本，减少实验流程，同时，实验过程可以得到更高的标准化要求，确保实验数据的可比性和可信性，有效提高实验的准确性和可重复性，进一步发挥分子转录酶技术在制备感受态细胞方面的优势，从而获得更有效的研究结果。
不过，由于分子转录酶技术在感受态细胞制备中存在着一定的不足，如培养环境的选择、基因识别性和转染效率等，都会影响分子转染的有效性和灵敏度，因此，应在设计实验中加以考虑，并进行相应的改进，以获得更好的结果。
总之，分子转录酶技术为制备感受态细胞提供了一种快速、高效、可行的方法，大大提高了实验成功率，减少了实验损失率和时间损耗，是研究生物学和行为学反应的一个有效且有价值的细胞模型。
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法
感受态细胞是一种特殊的细胞状态，可以用于研究细胞对外界刺激的感知和响应。
以下是一种常见的制备感受态细胞的方法：
1. 培养细胞：选择需要研究的感受态细胞类型，如神经元、免疫细胞等，在细胞培养基中培养细胞至合适的生长状态。
2. 刺激处理：给予细胞一定的外界刺激，如药物、光刺激、温度变化等。
刺激的剂量和时间可以根据具体研究目的进行调整。
3. 收集细胞：在刺激处理后，收集细胞，可以通过离心等方法使细胞沉积在培养皿底部或离心管中。
4. 提取RNA或蛋白质：利用相应的方法提取细胞中的RNA或蛋白质，用于后续分析。
5. 分析感受态：通过各种分析方法，如实时定量PCR、Western blot、流式细胞术等，检测特定的感受态标记物的表达水平或蛋白质修饰情况。
感受态细胞的制备方法可以根据具体研究目的和细胞类型的不同而有所差异，因此在实际操作过程中需要根据具体情况进行调整和优化。
（写作参考：）。
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究一、本文概述本文旨在深入研究枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法，以及质粒转化技术在枯草芽孢杆菌中的应用。
文章首先将对枯草芽孢杆菌的生物学特性进行简要介绍，包括其生理结构、生长环境及其在生物技术领域的重要地位。
随后，将详细阐述感受态细胞制备的原理和步骤，包括细胞的诱导、处理和保存等关键环节，并对不同方法进行比较分析，以找出最佳制备条件。
在此基础上，本文将深入探讨质粒转化技术在枯草芽孢杆菌中的应用。
质粒转化作为一种高效的基因转移手段，对于枯草芽孢杆菌的遗传改造和功能研究具有重要意义。
文章将详细介绍质粒转化技术的操作流程，包括质粒的选择、转化条件的优化以及转化效率的评价等方面。
本文还将对枯草芽孢杆菌感受态细胞制备及质粒转化方法的应用前景进行展望。
随着生物技术的不断发展，这些方法在基因工程、生物制药、环境修复等领域的应用潜力将逐渐显现。
通过本文的研究，旨在为相关领域提供可靠的技术支持和实践指导。
二、枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备制备枯草芽孢杆菌感受态细胞是质粒转化的关键步骤之一，它涉及到细胞的生长、处理和储存等多个环节。
以下是详细的制备过程：菌种复苏与活化：从低温保存的菌种库中取出枯草芽孢杆菌菌种，在LB固体培养基上进行划线接种，然后将其置于37℃恒温培养箱中倒置培养，待菌落长出后，挑选单个菌落进行活化。
种子液制备：将活化后的菌落接种到LB液体培养基中，以一定的转速（如200rpm）在37℃下振荡培养，直至达到对数生长期。
感受态细胞制备：将种子液按照一定比例接种到新鲜的LB液体培养基中，继续培养至OD600达到4~6。
然后，将培养液转移到预冷的离心管中，冰浴10分钟，以4℃、4000rpm的条件离心10分钟，收集菌体。
细胞处理：去除上清液，用预冷的感受态细胞洗涤液轻轻悬浮菌体，冰浴10分钟，再次离心收集菌体。
重复此步骤一次，以彻底去除培养基中的盐分。
高效转化及感受态细胞的制备
关于感受态细胞及转化克隆/建库/表达专用超级高效感受态细胞国外的同学说一般他们克隆都是直接购买感受态细胞转化，实验效率很高的。
我总是以为如果是一般的克隆实验，自己做感受态好像够用了－－如果是建库，购买现成的感受态细胞就是非常必要的首选，因为转化效率确实比实际手工制备的高2－3个数量级以上，特别是建库，能实实在在地提高实验的效率。
实际上，除了建库以外，Stratagene为更好的表达蛋白、以及转化效率较低的巨无霸质粒，而特别优化了一些感受态细胞，做表达的人其实可以参考一下，有点用处的。
生物通在这里借用Merck公司提供的资料供大家参考。
Stratagene的XL10-Gold®几乎算得上是高效转化的代名词了，研究者一旦要克隆大质粒、连接DNA和建库，克隆甲基化DNA，进行蓝白斑筛选等，首选的就是XL10-Gold®和其衍生菌。
XL10-Gold®用途包括：--克隆大DNA：包括表达质粒，基因组DNA克隆--构建质粒文库：减少DNA大小偏倚性，使全长cDNA克隆、双杂交质粒等各种大小的质粒转化效率更接近，提高文库代表性（比DH10B高25倍）。
Hte 基因型Hte（高效转化）基因型是Stratagene开发的特异性提高大质粒、连接DNA的宿主菌基因型，并使细胞生长加快（当天获得菌落），已经成功应用于25kb超螺旋DNA和8kb连接DNA的克隆。
XL10-Gold®，BL21-Gold，BL21-CodonPlus®，SoloPack® Gold 和96Pack® Gold等系列细胞都带有这个新的性状。
超级感受态细胞Stratagene提供多种>5 x109转化子/μg 超螺旋DNA转化效率的化学法超级感受态细胞正是克隆获得大质粒、连接DNA克隆和建库时最值得推荐的。
电转化感受态细胞Stratagene的电转化感受态细胞特别耐受电击处理，方便好用，在DNA材料极珍贵、量少时，或构建有代表性文库时，建议采用电转化感受态细胞。
大肠杆菌高效感受态细胞的制备及快捷转化体系的建立
［］ 王 晓俊 ． 方现 代 园林设计 ［ 口 南 京 ： 南大 学 出版社 ，００ ２ 西 Ⅳ． 东 ２０．
［］ 周 向频． 洲现代 景 观规划 设计 的发 展 历 程与 当代特 征 ［］ 城 市规 ３ 欧 Ｊ．
划汇 刊 ，０ ３ ４ ：９５ ． ２ ０ （ ）４ —６ ［ ］ 唐军 ． 功能 理性 到公 众参 与 西 方现 代景 观规 划设 计 的社会 脚 印 ４ 从
北 方 园 艺 ２ｏ ４ １～ ３ ｏ （ ）２ １ ｌ １ ：７ ０
・ 生物技术 ・
大肠杆菌高效感受态细胞的制备及快捷转化体 系的建立
杨 坤 ，巩 振 辉 ，李 大 伟
（ 北农 林科 技大 学 园 艺学 院 ， 西 陕西 杨 凌 ７２０ ） １１０
摘
Байду номын сангаас
要： 比较 了不 同方法制备 的大肠 杆菌感 受态细胞 的转化效 率， 并优化 了质粒 Ｄ ＮＡ转化
ＬＩ Ｈｏｎ － ｉ Ｈ ＵＯ ｎ ｈ ｎ Ｕ ｇ ｘｕ， Ｙａ － ｏ ｇ
第一 作者 简介 ： 坤 （９ ４） 男 ， 西成 阳人 ， 读硕 士 ， 主要 从 杨 １８ 一 ， 陕 在 现
事 蔬 菜育种及 生物技 术研 究工作 。
通讯 作者 ： 巩振辉 （ ９７ ） 男， 西礼 泉 人 ， 士 ， 授 ， 士 生 导 １５ － ， 陕 博 教 博 师 ， 主要从 事蔬 菜 种质 资源 与生物 技术研 究工作 。 现 基金 项 目 ： 家 自然 科 学 基 金 资 助 项 目（ ０ ７ ２ ２ ３ ７ １６ ） 国 ３５１６ ；０７４７ ； “ ３ １” １ １５ 科技 创 新工程 重 大科技 专项 资助 项 目（０ ８ ［ Ｇ ０ ） 教 ２ ０ Ｚ ） －３ ； Ｋ
感受态细胞制备及转化步骤
一感受态细胞的制备（材料：DH5α菌）1.下午三点左右将大肠杆菌接种于培养管中（取冻存的大肠杆菌接种于5ml LB 培养基中或用牙签挑菌培养），以220rpm在摇床上震荡过夜培养。
2.第二天取已经摇好的的菌液50或100ul接种于盛有5mlLB培养基的培养管中，每隔20分钟观察一次（大肠杆菌大约20分钟繁殖一次），2到3个小时后培养基变浑浊，将培养管置于灯光下摇动会出现大肠杆菌的絮状条带，此时培养液的OD600nm≦0.5，细胞数小于10的8次方。
3.将培养好的大肠杆菌倒到1.5ml的eppendorf管中（将菌体混匀后再倒），以10000rpm，离心1min.倒掉上清液后将培养管中的液体混匀后继续倒到eppendorf管中并于冷冻离心机中离心，直至将培养管中的菌液全部离心完毕。
4.倒净上清液后将盛有菌体的eppendorf管置于冰上，加入100ul冰的氯化钙（0.1M）溶液，并将菌体与溶液混合均匀（用手指用力弹），置于冰上静置10min （此时勿忘将氯化钙同样至于冰上保持其冰冷）。
5.将eppendorf管置于冷冻离心机中以8000rpm，离心1min。
6.弃上清后加50ul的氯化钙溶液混合均匀，若有液体溅到eppendorf管壁上可以进行短时离心，此时已制成大肠杆菌的感受态细胞。
大肠杆菌至于冰上备用，或于-80︒C保存。
二转化（transformation）1.另取1.5ml的eppendorf管置于冰上（做好相应标记），将含有感受态细胞的菌液混匀后取10ul的感受态细胞加入到eppendorf管中，随后加入1ul的质粒混匀（用手指肚轻弹），至于冰上静置30min。
2.将离心管置于42摄氏度的水浴锅中1到2min，随后迅速置于冰上，并向离心管中加入500ul LB培养基混匀后置于摇床上震荡培养1小时（37摄氏度，220rpm，使菌体恢复正常生长状态）。
3.用移液枪从离心管中取已经摇好的菌液100ul均匀的加入到相应的选择培养基上，用刮刀将菌液均匀的涂布到培养皿上过夜培养。
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感受态细胞的制备
一、实验原理
受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。
本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。
二、材料及准备工作
一）材料准备
二)试剂配制
1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用）
蛋白胨 2.0g
酵母提取物 1.0g
氯化钠（NaCl） 2.0g
2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌）
蛋白胨2×1.0g
酵母提取物2×0.5g
氯化钠（NaCl）2×1.0g
琼脂粉2×1.5g
温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。
4℃保存备用。
3、TSS液（100ml）（有效期2周）
聚乙二醇（PEG8000）10g 终浓度10%
DMSO 5ml 终浓度5%
MgCl2(1mol/L）5ml 终浓度50mmol/L
LB 85ml 终浓度85%
去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用
注：聚乙二醇分子量可以为3000-8000
4、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用）
KCl（2mol/L） 2.5ml
CaCl2(1mol/L) 1.5ml
MgCl2(1mol/L) 2.5ml
水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒）
5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml）
取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃
保存备用
三）仪器设备
1、低温大容量离心机
2、恒温水浴锅
3、超净台
4、高压锅
5、37℃孵育箱
6、恒温摇床
7、制冰机
8、分光光度计
9、微量移液枪
10、低温冰箱
三、步骤及注意事项
一）感受态制备（TSS法）
1、取菌种，划LB平皿板（无氨苄）；
2、挑取分离良好的独立克隆，接种到5ml LB 中，220rpm ，37℃恒温摇床孵育过夜；
3、取1 ml摇好的菌液，接种到100 ml LB 中（500ml锥形烧瓶），220rpm ，37℃孵育2.5-3.0h，菌液OD600达到0.2-0.5（0.36效果较好，不要超过0.6）；
4、取出菌液，冰浴20min；然后4℃，3000 rpm离心5 min ，收集细菌；
5、用10 ml 冰浴预冷的TSS液重悬细菌，然后4℃，3000 rpm离心
5 min；再用冰浴预冷的TSS液重悬细菌，即成感受态；
6、用1.5 ml离心管按150μl分装；-80℃长时间保存。
二）KCM法转化
1、冰上融化1管感受态细菌（也可室温化解后，再迅速冰浴）；
2、重取1个1.5ml离心管，加入20μl 5×KCM，DNA（建议不要超过10ng），水至100μl，放置冰中；
3、加入100μl 感受态细菌，混匀，继续冰中放置20-30mins；
4、42 ℃热休克90s后，再插入冰中1-5min；（休克30s效果更好）
5、加入1 ml 37℃预热的LB（无氨苄），转移至摇菌管中，220rpm ，
37℃孵育1h；
6、取100μl菌液，接种于含抗生素的LB平皿（也可以把菌液2000 rpm 离心5 min，收集细菌，用预热LB重悬细菌，接种含抗生素的LB平皿上），37℃孵育过夜。
7、剩余的感受态，可做阴性对照。
三）注意事项
1、本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在低温下进行。
2、PEG 和MgCl2二者均可沉淀质粒DNA，且PEG 有使细胞壁具有穿透性, 允许DNA 进入细菌体内的生物学功能；这些可能是优于CaCl2 法的原因。
3、培养基PH值。
pH值在6.8-7.2之间较好。
保证菌摇好后，pH值不低于6.0。
pH值在6.5以上，表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好。
4、培养基离子浓度。
经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时,该方法制得的感受态要相对较高。
使用20mmol/L MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。
5、培养温度。
文献及经验证明，较低的温度培养有利于感受态的形成（一般18℃,一般的感受态，用室温即可），有利于获得较高转化效率的感受态。
6、感受态保存。
文献报道,在保存感受态时,DMSO要比甘油的效果要
好,它会使感受态的效率增加。
浓度不要超过7%。
液氮速冻也会使感受态的效率提高，可用液氮速冻感受态12小时，然后保存于超低温冰箱内；也可在液氮中长时间保存而不降低效率。
7、热休克时间。
有实验证明热休克时间30s能取得最好效果，而温度40-50℃均可，转化效率下降不明显。
8、转化质粒建议不要超过10ng，否则容易导致效率下降。
9、试剂使用国产分析纯即可，一定要过滤除菌，不能高压灭菌。
四、结果判定
转化后的菌液，分3个梯度DNA量，转化三个LB平皿，计算平均转化效率。
转化效率1×106cfu/μg DNA可满足普通的亚克隆实验；1×107 cfu/μg DNA用于作更复杂的亚克隆、有限量的DNA的转化、T-克隆实验；大于1×10 8 cfu/μg DNA可用于构建文库和突变要求用的转化。
转化效率计算公式：
转化效率＝产生菌落的总数/铺板DNA的总量（cfu/μg DNA）这是最常用的方法，即计算每微克DNA经转化后可以得到的阳性克隆菌落的数目(clone formation unit, cfu)。
但实际上，由于用于测定转染效率的质粒（一般要求超螺旋质粒）的分子量不同，每微克DNA所代表的DNA分子数也会有差异，因此一般情况上，转化效率测定使用的都是pBR322或pUC19等小分子量的质粒。
使用一个具体的例子来说明转化效率的计算方法：假设取0.1ng
pUC19质粒转入100μl待测的感受态细菌中，按常规转化步骤进行冰浴和热击，加入900μl SOC培养基继续培养（此时DNA浓度为0.1ng DNA/ml，这里也可使用LB培养基，但最后得到的克隆菌的数目可能会降低）。
然后再用SOC培养基进行1:10稀释（此时DNA浓度变为0.01ng DNA/ml），分别取100μl（含总量为0.001ng的DNA）涂布至两个平行的平板中。
如果最后产生的菌落数为200 个（两个平板菌落的平均数），则转化效率为：
200 cfu/0.001ng = 2×108cfu/μg（注:2×108cfu/μg的转化效率，大约相当于可以将千分之一的pUC19质粒分子成功转入感受态细菌中。
）。