高效感受态细胞的制备

感受态细胞的制备

一、实验原理

受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。

本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。

二、材料及准备工作

一）材料准备

二)试剂配制

1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用）

蛋白胨 2.0g

酵母提取物 1.0g

氯化钠（NaCl） 2.0g

2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌）

蛋白胨2×1.0g

酵母提取物2×0.5g

氯化钠（NaCl）2×1.0g

琼脂粉2×1.5g

温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。4℃保存备用。

3、TSS液（100ml）（有效期2周）

聚乙二醇（PEG8000）10g 终浓度10%

DMSO 5ml 终浓度5%

MgCl2(1mol/L）5ml 终浓度50mmol/L

LB 85ml 终浓度85%

去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用

注：聚乙二醇分子量可以为3000-8000

4、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用）

KCl（2mol/L） 2.5ml

CaCl2(1mol/L) 1.5ml

MgCl2(1mol/L) 2.5ml

水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒）

5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml）

取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃

保存备用

三）仪器设备

1、低温大容量离心机

2、恒温水浴锅

3、超净台

4、高压锅

5、37℃孵育箱

6、恒温摇床

7、制冰机

8、分光光度计

9、微量移液枪

10、低温冰箱

三、步骤及注意事项

一）感受态制备（TSS法）

1、取菌种，划LB平皿板（无氨苄）；

2、挑取分离良好的独立克隆，接种到5ml LB 中，220rpm ，37℃恒温摇床孵育过夜；

3、取1 ml摇好的菌液，接种到100 ml LB 中（500ml锥形烧瓶），220rpm ，37℃孵育2.5-3.0h，菌液OD600达到0.2-0.5（0.36效果较好，不要超过0.6）；

4、取出菌液，冰浴20min；然后4℃，3000 rpm离心5 min ，收集细菌；

5、用10 ml 冰浴预冷的TSS液重悬细菌，然后4℃，3000 rpm离心

5 min；再用冰浴预冷的TSS液重悬细菌，即成感受态；

6、用1.5 ml离心管按150μl分装；-80℃长时间保存。

二）KCM法转化

1、冰上融化1管感受态细菌（也可室温化解后，再迅速冰浴）；

2、重取1个1.5ml离心管，加入20μl 5×KCM，DNA（建议不要超过10ng），水至100μl，放置冰中；

3、加入100μl 感受态细菌，混匀，继续冰中放置20-30mins；

4、42 ℃热休克90s后，再插入冰中1-5min；（休克30s效果更好）

5、加入1 ml 37℃预热的LB（无氨苄），转移至摇菌管中，220rpm ，

37℃孵育1h；

6、取100μl菌液，接种于含抗生素的LB平皿（也可以把菌液2000 rpm 离心5 min，收集细菌，用预热LB重悬细菌，接种含抗生素的LB平皿上），37℃孵育过夜。

7、剩余的感受态，可做阴性对照。

三）注意事项

1、本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在低温下进行。

2、PEG 和MgCl2二者均可沉淀质粒DNA，且PEG 有使细胞壁具有穿透性, 允许DNA 进入细菌体内的生物学功能；这些可能是优于CaCl2 法的原因。

3、培养基PH值。pH值在6.8-7.2之间较好。保证菌摇好后，pH值不低于6.0。pH值在6.5以上，表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好。

4、培养基离子浓度。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时,该方法制得的感受态要相对较高。使用20mmol/L MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。

5、培养温度。文献及经验证明，较低的温度培养有利于感受态的形成（一般18℃,一般的感受态，用室温即可），有利于获得较高转化效率的感受态。

6、感受态保存。文献报道,在保存感受态时,DMSO要比甘油的效果要

好,它会使感受态的效率增加。浓度不要超过7%。液氮速冻也会使感受态的效率提高，可用液氮速冻感受态12小时，然后保存于超低温冰箱内；也可在液氮中长时间保存而不降低效率。

7、热休克时间。有实验证明热休克时间30s能取得最好效果，而温度40-50℃均可，转化效率下降不明显。

8、转化质粒建议不要超过10ng，否则容易导致效率下降。

9、试剂使用国产分析纯即可，一定要过滤除菌，不能高压灭菌。

四、结果判定

转化后的菌液，分3个梯度DNA量，转化三个LB平皿，计算平均转化效率。

转化效率1×106cfu/μg DNA可满足普通的亚克隆实验；1×107 cfu/μg DNA用于作更复杂的亚克隆、有限量的DNA的转化、T-克隆实验；大于1×10 8 cfu/μg DNA可用于构建文库和突变要求用的转化。

转化效率计算公式：

转化效率＝产生菌落的总数/铺板DNA的总量（cfu/μg DNA）这是最常用的方法，即计算每微克DNA经转化后可以得到的阳性克隆菌落的数目(clone formation unit, cfu)。但实际上，由于用于测定转染效率的质粒（一般要求超螺旋质粒）的分子量不同，每微克DNA所代表的DNA分子数也会有差异，因此一般情况上，转化效率测定使用的都是pBR322或pUC19等小分子量的质粒。

使用一个具体的例子来说明转化效率的计算方法：假设取0.1ng