杨建雄生化456章

第4章蛋白质的共价结构第四章1．掌握蛋白质的分类和功能多样性；2．掌握肽的结构特点和基本性质；3．熟悉蛋白质一级结构的测定方法；4．掌握蛋白质一级结构与生物学功能的关系，熟悉有关的典型例子。

5．熟悉蛋白质人工合成的基本步骤。

第四章作业1．如果一个相对分子质量为12000的蛋白质，含10种氨基酸，并假设每种氨基酸在该蛋白质分子中的数目相等，问这种蛋白质有多少种可能的排列顺序？2．有一个A肽：经酸解分析得知由Lys，His，Asp，Glu2，Ala以及Val，Tyr和两个NH3分子组成。

当A 肽与FDNB试剂反应后，得DNP-Asp；当用羧肽酶处理后得游离Val。

如果我们在实验中将A肽用胰蛋白酶降解时，得到两种肽，其中一种（Lys，Asp，Glu，Ala，Tyr）在PH6.4时，净电荷为零，另一种（His，Glu以及Val）可给出DNP-His，在PH6.4时，带正电荷。

此外，A肽用糜蛋白酶降解时，也得到两种肽，其中一种（Asp，Ala，Tyr）在PH6.4时呈中性，另一种（Lys，His，Glu2以及V al）在PH6.4时，带正电荷。

问A肽的氨基酸序列如何？3．某多肽的氨基酸序列如下：Glu-Val-Lys-Asn-Cys-Phe-Arg-Trp-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Glu-Ala-Thr-Cys-Arg-His-Met-Asp-Gl n-Cys-Tyr-Pro-Gly-Glu-Glu-Lys。

（1）如用胰蛋白酶处理，此多肽将产生几个肽？并解释原因（假设没有二硫键存在）；（2）在PH7.5时，此多肽的净电荷是多少单位？说明理由（假设pKa值：α-COOH4.0；α-NH3+6.0；Glu和Asp侧链基4.0；Lys和Arg侧链基11.0；His侧链基7.5；Cys侧链基9.0；Tyr侧链基11.0）；（3）如何判断此多肽是否含有二硫键？假如有二硫键存在，请设计实验确定5，17和23位上的Cys哪两个参与形成？4．今有一个七肽，经分析它的氨基酸组成是：Lys，Pro，Arg，Phe，Ala，Tyr和Ser。

此肽未经糜蛋白酶处理时，与FDNB反应不产生α-DNP-氨基酸。

经糜蛋白酶作用后；此肽断裂成两个肽段，其氨基酸组成分别为Ala，Tyr，Ser和Pro，Phe，Lys，Arg。

这两个肽段分别与FDNB反应，可分别产生DNP-Ser和DNP-Lys。

此肽与胰蛋白酶反应，同样能生成两个肽段，他们的氨基酸组成分别是Arg，Pro和Phe，Tyr，Lys，Ser，Ala。

试问此七肽的一级结构是怎样的？5．一个四肽，经胰蛋白酶水解得两个片段，一个片段在280nm附近有强的光吸收，并且Pauly反应和坂口反应（检测胍基）呈阳性。

另一片段用溴化氰处理释放出一个与茚三酮反应呈黄色的氨基酸。

写出此四肽的氨基酸序列。

6．叙述用Merrifield固相化学方法合成二肽Lys-Ala。

如果你打算向Lys-Ala加入一个亮氨酸残基使成三肽，可能会掉进什么样的“陷坑”？第一节蛋白质通论一、蛋白质的化学组成和分类蛋白质的元素组成：C、H、O、N、S，其中含N平均为16%，这一数据可用于蛋白质的含量测定。

（一）简单蛋白完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。

根据溶解性的不同，可将简单蛋白分为7类：清蛋白（溶于水）、球蛋白（溶于稀盐溶液）、谷蛋白（溶于稀酸或稀碱）、醇溶蛋白（溶于70%-80%的乙醇）、组蛋白（溶于水或稀酸，可用稀氨水沉淀）、精蛋白（溶于水或稀酸，不溶于氨水）和硬蛋白（只能溶于强酸）。

（二）结合蛋白由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。

根据辅基的不同，可将结合蛋白分为以下7类：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。

（三）按蛋白质的生物学功能分类1．催化功能生物体内的酶都是由蛋白质构成的，没有酶，生物体内的各种化学反应就无法正常进行。

2．结构功能蛋白质可以作为生物体的结构成分。

高等动物的胶原蛋白是主要的细胞外结构蛋白，占蛋白总量的1/4；细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等膜系统都是由蛋白质与脂类组成的；动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。

3．运输功能脊椎动物的血红蛋白和无脊椎动物的血蓝蛋白起着运输氧气的作用；血液中的载脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转运铁；一些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要与甲状腺素结合球蛋白结合才能在血液中运输。

4．贮存功能某些蛋白质的作用是贮存氨基酸作为生物体的养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。

此类蛋白质包括蛋类中的卵清蛋白、奶类中的酪蛋白和小麦种子中的麦醇溶蛋白等。

肝脏中的铁蛋白可将血液中多余的铁储存起来，供缺铁时使用。

5．运动功能肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白是运动系统的必要成分，它们构像的改变引起肌肉的收缩，带动机体运动。

细菌中的鞭毛蛋白有类似的作用，它的收缩引起鞭毛的摆动，从而使细菌在水中游动。

6．防御功能高等动物的免疫反应是机体的一种防御机能，它主要也是通过蛋白质（抗体）来实现的。

凝血与纤溶系统的蛋白因子、溶菌酶、干扰素等，也担负着防御和保护功能。

7．调节功能某些激素、一切激素受体和许多其他调节因子都是蛋白质。

8．感觉功能生物体对信息的识别与传递过程也离不开蛋白质。

例如，感受味道需要味觉蛋白，视觉信息的传递要有视紫红质参与。

视杆细胞中的视紫红质，只需1个光子即可被激发，产生视觉。

9．遗传调控功能遗传信息的储存和表达都与蛋白质有关。

DNA在在染色体中是缠绕在蛋白质（组蛋白）上的。

有些蛋白质，如阻遏蛋白，与特定基因的表达有关。

β－半乳糖苷酶基因的表达受到一种阻遏蛋白的抑制，当需要合成β－半乳糖苷酶时经过去阻遏作用才能表达。

10．其他功能某些生物能合成有毒的蛋白质，用以攻击或自卫。

白喉毒素可抑制真核生物的蛋白质合成。

二、蛋白质的形状和大小按蛋白质的形状和溶解度可将蛋白质分为：纤维状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白质。

点击放大蛋白质的相对分子质量差别很大。

三、蛋白质构像和蛋白质结构的组织层次蛋白质的结构复杂，可分为不同的结构层次：一级结构：多肽链的氨基酸序列。

二级结构：多肽链借助氢键形成的有规则的局部结构，如α螺旋、β折叠等。

三级结构：球状蛋白质在二级结构基础上，借助次级键形成的相对独立的完整结构。

四级结构：具有三级结构的组成单位（亚基）之间的聚合方式。

四、蛋白质功能的多样性蛋白质序列的多样性(P160)决定了其功能的多样性。

如：20种蛋白质形成的二十肽（每种氨基酸只用1次）可以形成的异构体为：20！=2´ 1018 。

又如：相对分子质量为34000的蛋白质含12种氨基酸，假定在肽链的任一位置，12种氨基酸出现的概率相等，则34000/120=283，12283 = 10305。

催化：大多数酶是蛋白质。

调节：如激素和反式作用因子。

转运：如血红蛋白、血清蛋白、载酯蛋白、膜转运蛋白等。

贮存：如种子蛋白和卵清蛋白。

运动：如肌肉、微管蛋白等。

结构成分：如角蛋白、胶原蛋白等。

支架作用：如锚定蛋白、连接蛋白等。

防御和进攻：如抗体、毒蛋白等。

特殊功能：如甜蛋白、胶质蛋白等。

第二节肽一、肽和肽键的结构点击放大肽键的C和N均为sp2杂化，有部分双键的性质，相关的6个原子处于共平面，称作肽平面，肽平面内两个Cα多处于反式构型。

二、肽的物理和化学性质肽的等电点计算需先分别判断各解离基团的带电荷情况，再统计净电荷的量。

肽的化学反应与氨基酸类似，同时，由于肽键的存在，肽可以进行双缩脲反应。

三、天然存在的活性肽主要有：肽类激素、肽类抗生素和肽类毒素。

有关内容将在后续章节介绍。

均为9肽，仅2个氨基酸有差别，生理功能差别极大。

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-脑啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-脑啡肽由细菌分泌的多肽，含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine，缩写为Orn）第三节蛋白质一级结构的测定一、蛋白质测序的策略确定蛋白质的纯度在97%以上。

测定多肽链的数目。

拆分多肽链。

分析每一条多肽链的氨基酸组成。

鉴定多肽链的N—末端和C—末端氨基酸残基。

用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段。

测定各肽段的氨基酸序列。

拼接各肽段成完整的多肽链。

确定二硫键的位置。

二、N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定（一）N-末端的测定二硝基氟苯(DNFB)法(Sanger法)：2，4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。

在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。

该产物能够用乙醚抽提分离。

不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。

丹磺酰氯法：在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。

此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光吸收，检测灵敏度可以达到1´10-9mol，比DNFB法灵敏100倍。

点击放大异硫氰酸苯酯(PITC)法：N末端氨基酸生成相应的PTH（苯乙内酰硫脲）–AA，并脱离肽链，可连续测定N末端氨基酸，广泛应用于肽链的氨基酸序列测定。

氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个水解肽链，释放氨基酸。

根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，可以确定蛋白质的N-末端残基。

（二）C-末端的测定还原法：C 末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的α氨基醇。

肽链水解后，再用层析法鉴定。

肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，可断裂所有的肽键，除C 末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。

肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离，C 末端氨基酸可用纸层析鉴定。

但精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。

H 2NCH CR OHNCH C R O ORn HNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORn C CH H 2N OHH 2NCH C R O NHNH 2+H+22氨基酸酰肼C-端氨基酸羧肽酶法：将蛋白质在pH 8.0，30℃与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C 末端氨基酸的排列顺序。

目前常用的羧肽酶有四种：A ，B ，C 和Y ；A 和B 来自胰脏；C 来自柑桔叶；Y 来自面包酵母。

羧肽酶A 能水解除Pro ，Arg 和Lys 以外的所有C-末端氨基酸残基；B 只能水解Arg 和Lys 为C-末端残基的肽键。

通常将二者混合使用。

羧肽酶Y 可作用于任何氨基酸，因而，除用来测定C 末端氨基酸外，还可以用来测定氨基酸的排列顺序。

三、二硫桥的断裂点击放大四、氨基酸组成的分析一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。