2011.3.3原生质体制备和转化
原生质体制备
拟南芥原生质体制备转化方法选取开花前生长良好情况的拟南芥（Columbia型）叶片，用刀片切成0.5-1 mm宽的叶条；浸于配置好的酶解液中（每5-10 mL酶解液约10-20片叶子）；暗箱抽真空，30 min；转移至室温，继续黑暗酶解3-5 h；当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放；加入等量的W5溶液稀释酶解液；用60-100目筛子（W5溶液润湿）过滤酶解液；将滤液转移至30 mL eppendorf管，500-700 g离心1-2 min，弃上清；加入10 mL预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体；放于冰上静置30 min；保持室温在23℃以下；500 g离心8-10 min，弃上清；加入1 mL MMG溶液重悬原生质体（使其终浓度约在2×105个/mL）；即得到原生质体溶液。
用移液器吸取100 L的以上原生质体溶液于1.5 mL eppendorf管，加入10L DNA（10-20 g的质粒DNA），轻柔混合后，加入110 L PEG溶液，轻柔拍打eppendorf管使其混合完全；室温下诱导转化5-15 min；加入400-440 L W5溶液稀释转化混合液，轻柔颠倒，使之混合完好以终止转化反应；500 g离心2 min，弃上清；加入1 mL W5溶液悬浮清洗，500 g 离心2 min，弃上清；再用1 mL WI溶液轻柔重悬原生质体；室温（20-25℃）下，诱导载体表达18小时以上。
相关溶液配制PEG4000溶液（现用现配）组分用量PEG4000 1 g1 M CaCl20.25 mL0.8甘露醇0.625 mL水0.75 mL纤维素酶解液试剂15 mL酶液体系1-1.5 % Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225 g 纤维素酶0.2-0.4 % Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045 g 果胶酶0.4 M 甘露醇 1.09 g甘露醇干粉20 mM KCl 1 mL 0.3 M KCl20 mM MES, pH5.7 1 mL 0.3 M MES，pH5.7加水10 mL55℃水浴加热10 min，冷却至室温后加入以下试剂10 mM CaCl2 1 mL 0.15 M CaCl20.1% BSA 1 mL 1.5 % BSA5 mM β-巯基乙醇1mL 75 mM β-巯基乙醇用0.45 m滤膜过滤后即可使用。
原生质体名词解释基因工程
原生质体名词解释基因工程引言基因工程是一门应用技术，通过对生物体的遗传物质进行操作和改变，以实现特定目的的科学领域。
其中，原生质体是基因工程中的一个重要概念。
本文将对原生质体和基因工程进行详细解释，并探讨它们之间的关系。
原生质体定义原生质体是存在于细胞质内的一个独立结构，具有细胞膜包围。
它可以在细胞内进行独立的代谢活动，并参与到细胞的生物合成和分解过程中。
结构和功能原生质体通常由液泡、核糖体、线粒体等组成。
其中，液泡起到储存和运输物质的作用；核糖体参与蛋白质合成；线粒体则是细胞内能量供应的主要场所。
在基因工程中，原生质体扮演着非常重要的角色。
由于其具有相对独立性和高效性，科学家利用原生质体来进行基因转移和表达。
基因工程定义基因工程是一种应用生物技术的学科，旨在通过对生物体的遗传物质进行操作和改变，以实现特定目的。
它包括基因克隆、基因组编辑、基因表达调控等技术和方法。
基本原理基因工程的基本原理是通过改变生物体内的遗传物质来实现特定目标。
这一过程通常包括以下几个步骤：1.选择目标基因：根据需要选择具有特定功能或特征的基因作为目标。
2.提取DNA：从生物体中提取出含有目标基因的DNA。
3.基因克隆：将目标基因插入到适当的载体中，形成重组DNA。
4.转化：将重组DNA导入到宿主细胞中，使其表达目标基因。
5.表达调控：通过调控基因转录和翻译过程来控制目标基因的表达水平。
应用领域基因工程在许多领域都有广泛应用，包括农业、医学、环境保护等。
在农业领域，利用基因工程技术可以改良作物品种，提高产量和耐逆性，并增加营养价值。
转基因作物可以抵抗病虫害、耐受除草剂等。
在医学领域，基因工程技术被用于研究和治疗各种疾病。
通过基因编辑技术，科学家可以修复遗传缺陷，治愈某些遗传性疾病。
基因工程还可以生产重组蛋白和抗体等药物。
在环境保护领域，基因工程被用于改善环境污染的处理方法。
利用转基因微生物可以高效降解有机污染物。
基因工程与原生质体的关系原生质体在基因工程中扮演着重要角色。
细胞原生质体的制备
细胞原生质体的制备细胞原生质体的制备—植物原生质体分离和活性鉴定一、实验目的1.学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。
2.了解原生质体活性鉴定的原理。
3.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程二、实验原理去掉植物细胞壁的方法可以是机械的人工操作，也可以利用酶解法。
较早利用机械法制备原生质体的酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。
由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜，必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。
其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。
测定原生质体的活性有多种方法。
荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法，FAD 本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质膜。
一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。
它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。
PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合得以完成。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca 高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。
原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。
红曲霉原生质体的制备、再生及其遗传转化系统
收稿日期 ! 修回日期 ! ! & & $ & ’ ! %" ! & & $ & ( ! $ 作者简介 ! 周礼红 ! $ 女$ 贵州人 $ 江南大学在读博士 $ 研究方向 # 真菌分子生物学 &+ # ) * " ’%" , . / 0 0 1 2 1 3 4 # #"5 . 1 3 3 6 7 3 -6 7 8 通讯作者 ! 诸葛 ! 健 &9 # # : 0 % ( , ’ ) & , ’ % % ( ( $ !’ + , . / 0 / . 8 2 1 4 3 = . / 0 6 7 3 : "1 ; <
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地衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究
ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，Ｂ．１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ３０３ Ｗａｓ ｓｅｒｖｅｄ ａｓ ａ ｈｏｓｔ ｓｔｒａｉｎ，ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｗａｓ
ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ，ｐｒｅｌｉｍｉａｒｉａｒｉｌｙ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ丑ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ，．珑捃３０３，ａｎｄ ｌａｉｄ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ
关键词：地衣芽孢杆菌，原生质体，制备，再生，转化
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｂａｃｉｔｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｊｔｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，ａｎｄ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｆｉｅｌｄｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｆｏｏｄ，ｆｅｅｄ，ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．们１ｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｂ．１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｗｉｄｅ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｃａｎ ｎｏｔ ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｅｄ，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉＳ ｎｅｅｄｅｄ．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａｌｉｅｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ丑 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｐｒｅｍｉｓｅ ａｎｄ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｔｏ ｈｏｓｔ，
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ丑ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ．ｉｔ’Ｓ ｎｅｅｄ ｔｏ ｃａｒｒｙ ｏｎ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｉｔｓ
里氏木霉原生质体的制备及转化
里氏木霉原生质体的制备及转化摘要本实验通过将含潮霉素B抗性标记的质粒pAN7-1转化至里氏木酶原生质体中，在含100ug/ml潮霉素B的PDA平板上筛选转化子。
并予以验证，结果表明，在1kb处有潮霉素抗性基因组，其中浓度为107个/ml的转化子效果最好。
关键词里氏木酶原生质制备转化前言纤维素是自然界提供给人类的最宝贵的财富，植物每年通过光合作用产生数千亿吨的纤维素，但目前只有一小部分用于纺织、造纸、建筑和饲料等方面。
木霉属是迄今被认为纤维素酶成分最全面，分解天然纤维素活力最高的一类菌。
在育种方面利用高能电子、紫外线、亚硝基胍处理和原生质体融合等方法，使酶的活力得到很大的提高。
本试验对里氏木霉原生质体的制备及转化进行了研究,为进一步的育种工作奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株及质粒来源里氏木霉QM9414和质粒pAN7-1由深圳大学生命科学学院S402实验室刘刚老师提供。
1.1.2试剂及培养基的配制1.1.2.1 Mandels 营养盐浓缩液配制(NH4)2SO4 14 g，尿素 3 g，KH2PO420 g，CaCl2⋅2H2O 4 g，MgSO4⋅7H2O 3 g，ddH2O 定容至1L1.1.2.2 Mandels 微量元素浓缩液配制FeSO4⋅7H2O 5 g，ZnSO4⋅7H2O 1.7 g，CoCl2⋅6H2O 23.7 g，MnSO4⋅H2O 1.6 g，ddH2O 定容至1L1.1.2.3 1 M柠檬酸缓冲液配制柠檬酸210 g，NaOH（纯度96 %）78 g，ddH2O 750 ml，冷却后定容至1L1.1.2.4 60％的PEG400050 mM CaCl2，10 mM Tris·Cl（pH 7.5），60 g PEG4000加水定容到100 ml1M CaCl25ml，1M Tris·Cl（pH 7.5）1ml，PEG4000 60g，ddH2O定容至100 ml1.1.2.5 STC山梨醇218.6g（所需浓度为1.2 M），1M Tris·Cl（pH 7.5）10ml（所需浓度为10 mM），1M CaCl2 50ml（所需浓度为50 mM），ddH2O 定容至1L1.1.2.6 PDA培养基去皮土豆200g，葡萄糖20g，琼脂(Agar) 15g，ddH2O定容至1L其中20 %土豆浸出液制作方法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置电炉上煮20分钟，用纱布过滤，定容。
原生质体制备和转化
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取107个/mL的单孢子悬浮液 ，涂布于平板表面的玻璃纸上，培养后用 无菌镊子将培养菌丝体的玻璃纸转移并倒复在已配好的酶液内，轻轻 抖动玻璃纸，菌丝体散落在酶液中，然后去玻璃纸，酶解，定时取样 观察。
（该法收集的菌丝体会十分干净，免去了洗涤、离心等手续，减少对 菌丝的伤害和杂菌污染）
1、接种于液体培养基上培养。
2、取培养液10ml，4000r/min离心5min, 弃上清液，用Tris-HCl(pH 7.4)、 0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。 3、用含10mmol/L巯基乙醇的高渗缓冲液稀释裂解酶液。 4、加酶液，100r/min摇床50-100min酶解。脱壁效果达70%左右即停止酶解。
最后加入2mL STC溶液，混匀。
将适量上述转化液涂布于高渗再生基本培养基上，30℃培养5~7天，所 长出的菌落即为转化成功的菌株；同时设置未加质粒而转化的原生质体 涂布平板作为阴性对照。
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菌丝培养基 葡萄糖含量为0.5%的葡萄糖-蛋白胨完全培养基。 高渗再生培养基 以1.2mol/L Sorbitol（山梨糖醇）配制的葡萄糖-蛋白胨基本固体培养基。
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以0.15g湿菌体用酶量1mL的比例，加入酶液，置于灭菌平板中 置33℃摇床上80r/min振荡酶解，每半小时取样，在显微镜下观察原生质体的释放 情况 待酶解完全后，加等体积1mol/L山梨醇溶液，用四层无菌镜头纸过滤，除去未酶 解的菌丝体残片，收集原生质体液 4000r/min室温离心10min，收集原生质体沉淀 去上清，沉淀用1mol/L 山梨醇溶液洗涤2次，每次4000r/min离心10min 弃上清将原生质体悬浮于5mL 1mol/L 山梨醇溶液中，-70℃冰箱冷冻保存备用
细菌原生质体的制备
细菌原生质体的制备要求：1、写出完整的原生质体的制备的实验操作步骤2、写出分离培养基及相关试剂所需的量、仪器和器皿所需的数量。
说明：通过实验一获得出发菌（细菌）之后，第二周再对该菌进行诱变，第三周再进行该菌的碳源谱、及抗药性测定（链霉素或青霉素），第四周再制备原生质体。
培养基与试剂(1) 分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中再加入15g琼脂粉pH调至7.2121℃灭菌15min待冷却至50℃左右时于超净工作台倒平板。
注:先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状再加到溶化好的培养基中调匀; (2) 分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中pH调至7.2,121℃灭菌15min。
(3) 检测试剂,路戈氏碘液,碘片1g,碘化钾2g,蒸馏水300mL。
配制方法:先用少量35mL蒸馏水溶解碘化钾,再加入碘片,待碘片完全溶解后,加水稀释至300mL于棕色瓶内备用.实验方法: 1. 微生物的分离; 用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌。
取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土壤悬液,此时的稀释度为10-1。
另取7支试管分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度每支试管内加入9mL无菌水。
用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀,再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中,依此类推直至10-7试管。
分别从10-6、10-7、10-8三个稀释度的试管中吸取100uL悬液,均匀涂布于分离培养基平板上,于30℃培养36h等长出菌落后,将检测试剂卢戈氏碘液加入到平板中,菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株,因淀粉遇碘变蓝色,如菌落周围有无色圈说明该菌能分解淀粉。
--细胞生物学原生质体的分离与融合综合性实验报告
细胞生物学综合性实验课程名称: 细胞生物学实验姓名:班级:学号:时间: 年月日植物原生质体的分离、纯化及融合1 材料、试剂与方法1.1材料菠菜叶片,唐古特白刺愈伤组织,金盏菊花瓣。
1.2 试剂5%次氯酸钠,无菌水,酶液A,0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液,20%蔗糖溶液，0.16 mol/L的Cacl2.2H2O溶液，酶液B,12%蔗糖溶液，PEG溶液，高PH高钙稀释液。
1.3方法1.3.1菠菜叶片和金盏菊花瓣的消毒处理称取金盏菊花瓣1.5g或菠菜叶1g,用自来水冲洗;分别用5%次氯酸钠溶液浸泡10分钟，再用无菌水洗4次。
1.3.2 原生质体的分离1.将消毒后的金盏菊花瓣用镊子撕成细丝。
2.酶解：加5ml酶液A,封口，保持28℃,3-6小时。
3.过滤及离心：600r/min离心5min,弃去上清液保留沉淀。
1.3.3 原生质体的纯化1.将沉淀用2ml 0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮。
2.用注射器缓缓向离心管底部6ml 20%蔗糖溶液,600r/min离心5min,得到原生质带。
3.用注射器吸出管底杂质和蔗糖及上部Cacl2.2H2O溶液。
4.留下的原生质带用5ml 0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮, 600r/min离心5min。
5.用3ml 0.16mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮。
1.3.4 原生质体的融合1.将菠菜叶和金盏菊的原生质体悬液等量混合。
2.用吸管将混合的原生质体混合液滴在培养皿中，7-8滴每皿，静置10min,使其贴壁。
3.用吸管将等量的PEG溶液滴在原生质液滴上，静置10-15min 观察细胞的粘连。
4.用刻度吸管向原生质液滴慢慢加入高PH高钙稀释液。
第一次0.5ml,第二次1ml，第三四次各2ml,每次间隔5min。
5.平皿微倾斜，吸取上清液，缓缓加入4ml高PH高钙稀释液,静置5min后弃去上清液。
6.加入MS培养基4ml, 静置5min后弃去上清液。
一种柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法
一种柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法
“原生质体技术：探索柴胡植物的可塑造性”
柴胡原生质体（PC）是质粒附着在植物细胞内膜上的细胞分泌物或少量膜蛋白组成的复合物，它可以作为植物细胞等细胞分泌物的载体，在生物活性分子的迁移过程中发挥着重要的作用。
PC的制备及瞬时转化方法包括以下几点：
1. 细胞预处理：对柴胡细胞进行反渗洗、均质化等处理，以提高分泌
物含量。
2. PC制备：采用超声处理或有机溶剂质离子萃取等方法，提取柴胡原生质体。
3. 改性：运用有机溶剂、酶或其它因素对PC进行改性，使其具有特殊的功能。
4. 瞬时转化：采用冷冻放代理器对PC进行瞬时处理，以促进蛋白质在PC层转化。
采用上述方法制备和改性的PC的过程非常复杂，但是可以高效地提高
该植物的功能性。
此外，通过应用PC的瞬时转化技术，可以更快更有效地在PC层上转化并表达蛋白质。
原生质体培养的过程
原生质体培养的过程
原生质体的分离
机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体，该方法的缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。
优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。
酶解分离法：指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。
优点：获得量大，适用广泛。
缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质，会影响所获原生质体的活力
原生质体的纯化
1过滤法，用滤网过滤酶解混合物，滤去未被酶解的细胞和组织块2离心法，低速离心，使完整的原生质体沉积于离心管底部
3漂浮法，采用比重大的高渗溶液，是原生质体漂浮
原生质体的培养方法
1固体培养法原生质体纯化、离心、稀释后，再与1.4%琼脂或琼脂糖（37?C左右）等体积混合成0.7% ，培养于培养皿中2浅层液体培养法培养皿中注入3-4ml培养液，成一薄层——接种一定密度（2x105/ml）原生质体——每日轻摇2-3次，加强通气——原生质体细胞壁产生——分裂形成细胞团——转至固体培养基，分化成苗
3双层培养法培养皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。
201133原生质体制备和转化
0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）：0.2 mol/L NaH2PO4· 2H2O（约240mL） 和0.2 mol/L Na2HPO4· 12H2O（约60mL）混合至pH为6.0
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混合酶液：2%纤维素酶，1%蜗牛酶，5mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）用pH6.0的 含0.4 mol/L NH4Cl的0.2mol/L磷酸缓冲液配置混合酶液，经0.45μm微孔滤膜过 滤除菌，保存于4℃
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王金良学长： 1. 米曲霉C-2在2% G-P斜面培养6天至长出孢子，灭菌去离子水洗下孢子，经四层 擦镜纸过滤制成孢子悬液，接种于50mL 0.5%G-P菌丝全培养基，30℃静置培养 23~25h； 2. 过滤收集菌体，用无菌水与0.8M NaCl各洗涤一次； 3. 菌体置于灭菌培养皿中，加入15ml 酶解液（2%纤维素酶、1%蜗牛酶、3mM DTT）； 4. 置30℃摇床（80r/min）酶解3h左右，在显微镜下观察原生质体的释放情况； 5. 酶解完全后，四层擦镜纸过滤，除去未酶解菌丝，离心收集原生质体； 6. 用0.8M NaCl洗涤二次，0.8M NaCl-50mM CaCl2 洗涤一次； 7. 弃上清原生质体重悬于100μL 0.8M NaCl-50mM CaCl2中，血球板计数。
双层平板，再生，计算原生质体再生率。
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林艳学姐：
挑Aspergillus oryzae P5菌丝于葡萄糖-蛋白胨斜面培养基上培养6~7天，至孢子 成黄绿色 取新鲜培养的斜面7支，用20mL无菌水洗下成熟孢子于铺满玻璃珠的三角瓶中， 置摇床上150r/min振荡分散30min 经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单孢子悬浮液 将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝培养基的三角瓶中，于 30℃静止培养23~25h 6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体 用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体 用PBA溶液洗涤菌丝体两次，每次4000r/min，离心5min收集菌丝体
原生质体培养与诱变
概念与应用
原生质体的分离与培养
原生质体的诱变
1
原生质体(protoplast)： 脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球 原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。
亚原生质体(subprotoplast)
在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内 含物的断裂而形成的一些较小的原生质体。 它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。 核质体(nuclearplast)
用于分离原生质体的材料
1. 材料预处理
用黑暗处理和低温处理等方法，可提高某些 材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4oC处理较好。 ☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的 原生质体才能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分 离原生质体，才能获得高产量。 6
2. 原生质体分离的方法
低pH（<4.5），酶的活力强，原生质体分离
速度快，但细胞活力差，被破坏的细胞较多; pH值偏高（7.0） ，酶活力差，原生质体分 离速度慢，完整的原生质体数目较多。
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光照和温度
制备原生质体时，在细胞中加入酶液、渗透 压稳定剂、质膜稳定剂后，还需在一定时间 内保持一定的温度，原生质体方能释放。 脱壁的原生质体对光非常敏感，分离原生质 体一般是在黑暗条件下进行的。 在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上 培养4h后，叶片组织可完全分离 。 悬浮细胞需在25℃～33℃条件下酶解24h 。
是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS 33 培养基为基础 改进的。
二、影响原生质体培养的因素
5. 培养条件
温度，光照
6. 植物材料和基因型
柑桔，葡萄，桃
7. 供体细胞的生长同步性
植物细胞原生质体的制备与融合
植物细胞原生质体的制备与融合。
1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。
细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。
此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。
（2）原生质体融合：即体细胞杂交。
用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。
若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。
2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。
在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。
如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。
游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。
基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。
（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。
但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。
因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。
常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。
对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。
对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。
最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。
（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。
①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。
③酶解：除菌绿。
反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。
经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。
原生质体技术
备注
• 1. 原生质体制备过程中，必须有渗透压 稳定剂保护，避免原生质体破裂 • 2. 所有试剂，容器，培养基必须严格灭 菌，酶液用0.6M甘露醇溶液配制，再用 微孔滤膜过滤除菌。 • 3. 严格无菌操作，避免杂菌污染
本周实验
• 实验的前期准备----菌丝培养 • （原生质体制备和DNA提取）
1. 制备培养基
2.1.5 酶解时间
• 酶解时间以2-4小时左右 • 酶解时间一般因菌种类别而异 • 时间短，形成率低
2.1.6 酶解的pH
• 多以自然为宜，pH5-6左右。
2.2 原生质体制备方法
• • • • • 菌丝活化 菌丝液体培养 酶解 原生质体分离 原生质体纯与镜检
2.2.1 菌丝活化
• 菌丝接种于PDA培养基上 • 25℃培养7-10天
大型真菌原生质体的制备
1. 原生质体技术的应用
• • • • 原生质体融合 原生质体单核化 转化（transformation） 生物化学研究
1.1 原生质体融合
• 主要问题 • 遗传不稳定 • 子实体体难形成 • 优良性状难以表现
1.2 原生质体单核化
• （获得单核体，能较好地保持亲本菌株 遗传特性） • 双孢蘑菇 • 无性生殖菌株 • 难以形成子实体的野生菌株
2.1.2 酶
• 溶壁酶（Lywallzyme） • 广东微生物研究所 • Novozyme234 丹麦 • 均为木霉产生的酶系。
2.1.3 渗透压稳定剂
• 无机盐类：NaCl、KCl、MgSO4等 • 有机糖类：甘露醇、蔗糖、肌醇 • 使用浓度：0.4～0.6mol/L
2.1.4 酶解温度
• 酶解作用的适宜温度：以30℃为宜 • 对于各种真菌来说，酶解作用的适宜温 度一般高于菌丝的适宜生长温度 • 温度偏高时，原生质体极易破裂，形成 率下降，原生质体也易产生变形，活力 下降，甚至破裂，形成率低。 • 温度偏低时，原生质体形成慢
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《工业微生物育种学》 施巧琴 吴松刚 *菌丝培养基： 1、葡萄糖蛋白胨培养基 2、PDA培养基（一种普遍用于酵母菌和霉菌计数培养用的培养基，被推荐 用于各类食品和饮料中酵母菌和霉菌检测和计数 ） 3、査氏培养基（用于真菌的分离鉴定，霉菌、白色念珠菌、酵母等微生物）
*再生培养基：同查氏培养基，其中含NaCl浓度为0.8mol/L
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*缓冲液：pH5.8-6.8磷酸氢二钠-柠檬酸溶液
*高渗溶液：0.6mol/L NaCl溶液
*酶溶液：蜗牛酶、纤维素酶，用0.7mol/L的NaCl配制，G6砂芯漏 斗抽滤除菌
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高渗缓冲液：
1、接种于液体培养基上培养。
蔗糖0.5mol/L, MgCl2 10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4)
10mmol/L
2、取培养液10ml，4000r/min离心5min, 弃上清液，用Tris-HCl(pH 7.4)、 0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。
3、用含10mmol/L巯基乙醇的高渗缓冲液稀释裂解酶液。
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文献汇报
2011.3.3
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培养基成分 高渗溶液（有机/无机） 缓冲液的pH（5.8-7.4） 酶解条件（时间/各种酶的比例） 酶液用高盐还是高渗缓冲液配 擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体 双层or单层培养基
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《微生物学实验教程》 周德庆（酵母）
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将制备好的原生质体溶液3200r/min，4℃离心10min；
弃上清，沉淀重悬于预冷的STC溶液中，将原生质体浓度调整为 5×106 ~ 5×107个细胞/mL；
将约2~5µg质粒DNA(体积不超过10µL)与100µL米曲霉原生质体置冰上 轻轻混匀；
4、加酶液，100r/min摇床50-100min酶解。脱壁效果达70%左右即停止酶解。
5、100r/min离心三分钟，去沉淀，取上清。再2000r/min离心10min收集沉 淀原生质体。
6、高渗缓冲液洗涤2次，2000r/min离心10min收集原生质体，最终用1ml高 渗缓冲液悬浮原生质体。
经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单孢子悬浮液
将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝培养基的三角瓶中，于 30℃静止培养23~25h
6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体
用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体
用PBA溶液洗涤菌丝体两次，每次4000r/min，离心5min收集菌丝体
双层平板，再生，计算原生质体再生率。
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林艳学姐： 挑Aspergillus oryzae P5菌丝于葡萄糖-蛋白胨斜面培养基上培养6~7天，至孢子 成黄绿色
取新鲜培养的斜面7支，用20mL无菌水洗下成熟孢子于铺满玻璃珠的三角瓶中， 置摇床上150r/min振荡分散30min
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取107个/mL的单孢子悬浮液 ，涂布于平板表面的玻璃纸上，培养后用 无菌镊子将培养菌丝体的玻璃纸转移并倒复在已配好的酶液内，轻轻 抖动玻璃纸，菌丝体散落在酶液中，然后去玻璃纸，酶解，定时取样 观察。
（该法收集的菌丝体会十分干净，免去了洗涤、离心等手续，减少对 菌丝的伤害和杂菌污染）
酶解1-2h，将培养皿内破碎菌丝体和原生质体混合液用吸管吹吸数次， 用G2或G3砂芯漏斗过滤，使原生质体同菌丝体碎片分开，滤液15002000r/min离心10min，洗涤去上清，悬浮于同一高渗溶液中。再将含 有原生质体的滤液用再生培养基洗涤三次，以清除酶液，然后用保存 液悬浮。血球计数板计数，冷藏备用。
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1、原生质体混合、PEG助融
2、双层平板：底层10ml的固体培养基（1.2%琼脂），将样品加入 5ml融化后的半固体培养基（0.6%琼脂，预保温42℃）中，快速混合， 导入铺有底层培养基的平板上。待上层凝固后，置于恒温箱培养
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以0.15置33℃摇床上80r/min振荡酶解，每半小时取样，在显微镜下观察原生质体的释放 情况 待酶解完全后，加等体积1mol/L山梨醇溶液，用四层无菌镜头纸过滤，除去未酶 解的菌丝体残片，收集原生质体液 4000r/min室温离心10min，收集原生质体沉淀 去上清，沉淀用1mol/L 山梨醇溶液洗涤2次，每次4000r/min离心10min 弃上清将原生质体悬浮于5mL 1mol/L 山梨醇溶液中，-70℃冰箱冷冻保存备用
加入25µL PTC溶液，冰浴20min； 加入1 mL PTC溶液，室温放置15min； 最后加入2mL STC溶液，混匀。
将适量上述转化液涂布于高渗再生基本培养基上，30℃培养5~7天，所 长出的菌落即为转化成功的菌株；同时设置未加质粒而转化的原生质体 涂布平板作为阴性对照。
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混合酶液：2%纤维素酶，1%蜗牛酶，5mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）用pH6.0的 含0.4 mol/L NH4Cl的0.2mol/L磷酸缓冲液配置混合酶液，经0.45μm微孔滤膜过 滤除菌，保存于4℃ PTC溶液：25%PEG8000，50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris-HCl (pH 7.5) STC溶液：1.2mol/L Sorbitol，50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)
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菌丝培养基 葡萄糖含量为0.5%的葡萄糖-蛋白胨完全培养基。
高渗再生培养基 以1.2mol/L Sorbitol（山梨糖醇）配制的葡萄糖-蛋白胨基本固体培养基。
0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）：0.2 mol/L NaH2PO4·2H2O（约240mL） 和0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O（约60mL）混合至pH为6.0